丹参、党参和黄芪合剂对急性低氧时脑损伤的保护作用
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【摘要】 目的 观察丹参、党参和黄芪合剂对急性低氧脑损伤的保护作用，并探讨其机制。方法 用成年SD大白鼠分成常氧对照组(NC组)，急性减压低氧组(AH组)，丹参、党参和黄芪合剂加低氧组(MH组)，分别观察各组大鼠海马CA1区锥体细胞层神经元形态的变化，测定各组脑含水量，Na + ，K + -ATP酶活性，超氧化物歧化酶和丙二醛的含量。结果 (1)缺氧24h复氧72h后，海马CA1区锥体层神经元形态发生明显变化，细胞数目减少，排列紊乱，突起消失，而MH组细胞损伤不明显，形态与NC组相似。(2)与NC组相比，AH组脑含水量明显增高(P<0.01)，而MH组脑含水量较AH组明显降低(P<0.01)。(3)AH组脑Na + ，K +-ATP酶活性较NC组下降(P<0.05)，MH组该酶活性较AH组上升(P<0.05)。(4)AH组脑丙二醛含量明显高于NC组(P<0.01)，MH组丙二醛含量较AH组显著降低(P<0.01)。(5)SOD在3组之间的的变化无显著意义。结论 丹参、党参和黄芪合剂能减轻脑水肿，对抗氧自由基，与膜脂质过氧化作用、提高Na + ，K + -ATP酶活性、改善脑细胞能量代谢有关。
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关键词 丹参、党参和黄芪合剂 急性减压缺氧 Na + ，K + -ATP酶 超氧化物岐化酶丙二醛
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0865-03
Protective effect of salvia miltiorrhiza，radix astrugali
and codonopsis pilosula mixture on hypoxia-induced brain damage
Li Jiancheng，Shi Zhongyuan，Jin Shuyi，et al.
Institute of Nautical Medicine，Nantong Medical College，Nantong226001.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the protective effect of salvia miltiorrhiza，codonopsis pilosula and radix asˉtrugali mixture on hypoxia-induced brain damage and its mechanisms.Methods Adult SD rats were randomly dividˉed into three experimental groups:normoxic control(NC)，acute decompression hypoxia(AH)，salvia miltiorrhiza，codonopsis pilosula and radix astrugali mixture add decompression hypoxia(MH).Both cerebral water content and Na + ，K + -ATP ase activity，superoxide dismutase(SOD)，malondialdehyde(MDA)concentration in cerebral hoˉmogenate were determined respectively.Results (1)Compared to NC group，cerebral water content was significantly increased in AH group(P<0.01)，but this inscreasingwas inhibited in MH group(P<0.01).(2)Na + ，K + -ATPase activty incerebral homogenate of AH group was lower than that of NC group(P<0.05)，however，compared to AH group，it was increased(P<0.05).(3)Concentration of MDA in cerebral homogenate of AH group was higher than that of NC group(P<0.01)，MHgroup decreased this increase(P<0.01).(4)SOD activities were not significantly different between three groups.Conclusion Salvia miltiorrhiza，codonopsis pilosula and radix astrugali mixture has protective effect on hypoxia-induced brain damage，its mechanisms are related to the following factors:antagonist efˉfect of salvia miltiorrhiza，codonopsis pilosula and radix Astrugali mixture on oxygen-derived free radicals and memˉbrane lipid peroxidation and improving energymetabolism of cells.
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Key words salvia miltiorrhiza codonopsis pilosula and radix astrugali mixture acute decompression hypoxia Na + ，K + -ATPase malondialdehyde superoxide dismutase
脑是氧消耗量最大而贮氧量最少的组织之一，也是对缺氧最敏感的器官，因此，缺氧常引起脑功能障碍 [1] 。人快速从平原进入海拔3500m以上高原后，因高原低压低氧环境引起急性高山反应，出现一系列缺氧性脑功能、脑代谢紊乱的表现。然而关于急性高山反应的病理生理学机制尚未完全阐明，对该病防治仍缺少有效措施。黄芪(Radix Astruˉgali)是中医常用益气药之一，具有免疫调节、降压、强心等作用。近年来的研究还发现其具有抗缺氧作用 [2] ;丹参注射液可显著延长小鼠在常压和低压氧条件下的存活时间，提高小鼠在低氧状态下对氧的利用能力，并能提高机体在低氧状态下对氧的耐受力 [3] 。党参(Codonopsis Pilosula)为常用中药，现代药理研究表明，党参具有调节血糖、促进造血机能、降压、抗缺氧、耐疲劳、增强机体免疫力等多种作用 [4] 。我们将丹参、党参和黄芪提取物制成合制，运用已建立的低压低氧模型，观察预先给予丹参、党参和黄芪合剂是否能提高机体抗缺氧耐力，并分析其可能的作用机制，为高原缺氧机体损伤的防治工作提供实验依据。为此，我们将大鼠暴露于模拟海拔8000m高原环境，观察预先给予这三种药物对防治高原缺氧性脑损伤的效应，以探讨丹参、党参和黄芪合剂的神经保护作用及其机制。
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1 材料与方法
1.1 动物与分组 SD大鼠30只(南通医学院实验动物中心提供)体重180～200g，雌雄各半，按性别、体重分成3组(n=10):常氧对照组(NC组)，急性减压缺氧组(AH组)，丹参、党参和黄芪合剂加缺氧组(MH组)。
1.2 药物 丹参、党参和黄芪合剂由石中瑗教授提供，浓度为0.25生药/ml。
1.3 实验方法
1.3.1 给药方法 丹参、党参和黄芪合剂按5ml/kg体重剂量每天灌胃给药1次，连续7h;其余2组给予等体积的水。
1.3.2 减压方法 AH组和MH组动物在最后一次灌胃给药后半小时进入低压舱(舱容积为0.01m 3 )内，“以10m/s的速度升至海拔8000m”，持续7h;NC组不做任何处理，常氧室温饲养。
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1.4 生化测定 出舱后各组动物在1～2min内快速断头剥脑，其中半脑用于脑含水量的测定;另半脑称重后按1:10(w/v)加入0～4℃的生理盐水制成匀浆，用福林-酚法测定匀浆蛋白含量，Na + ，K + -ATP酶活性、超氧化物岐化酶 (SOD)和丙二醛(MDA)含量测定，按南京建成生物工程研究所提供的药盒说明进行操作。Na + ，K + -ATP酶活性以μmol pi/(mg pro)·h表示，超氧化物岐化酶以NU/mg pro表示，丙二醛含量以nmol/mg pro表示。
1.5 脑含水量测定 采用干湿质量法，取各组半侧脑组织于称量瓶中，称重后置50℃烘箱烤干至恒重。按公式计算含水量，脑含水量(%)=(湿重量-干重量)/湿重量×100%。
1.6 统计学处理 实验结果用均数±标准差(X±s)表示，boxbase建立数据库，组间的显著性用SPSS软件进行t检验、F检验。
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2 结果
2.1 丹参、党参和黄芪合剂对低氧暴露大鼠海马CA1区锥体细胞的影响 Nissl染色结果显示:常氧对照组海马CA1区锥体细胞排列紧密，形态完整，突起排列整齐、完整、较长。低氧暴露7h海马细胞变化不明显，低氧暴露24h复氧72h，海马CA1区锥体细胞数量锐减，突起紊乱、减少或消失。药物组细胞排列较整齐，数量只有少量减少，突起排列较整齐(见图1)。
图1 丹参、党参和黄芪合剂对低氧暴露大鼠海马CA1区锥体细胞层神经元的影响A:常氧对照组，海马CA1区锥体细胞排列紧密，形态完整，突起排列整齐、完整、较长(×100);B:低氧暴露7h组，海马CA1神经元变化不明显(×100);C:低氧暴露24h复氧72h组，海马CA1区锥体细胞数量锐减，突起紊乱、减少或消失(×100);D:丹参、党参和黄芪合剂+低氧暴露24h复氧72h组，海马CA1区锥体细胞排列较整齐，数量只有少量减少，突起排列较整齐(×100) 丹参、党参和黄芪合剂(×7，ig)对低氧暴露(8000m7h)。大鼠脑含水量、Na + ，K + -ATPase活性、SOD活性和丙二醛含量的影响，见表1，急性减压低氧组大鼠脑含水量较常氧对照组明显增加(P<0.01)，预先给予丹参、党参和黄芪合剂连续7天，脑含水量较急性低氧组显著降低(P<0. 01)，与常氧对照组接近。与常氧对照组相比，急性减压低氧组的Na + ，K + -ATPase活性明显下降(P<0.05)，MDA含量明显升高(P<0.01)，而给药组Na + ，K + -ATP酶活性上升(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.01)，SOD在3组中变化不明显。
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表1 对大鼠脑含水量、Na + ，K + -ATPase活性、SOD活性和丙二醛含量的影响
注:与NC组相比， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01，与AH组相比， # P<0.05， ## P<0.01
3 讨论
采用干湿质量法测定脑组织含水量是评价脑损伤的一种简单、准确、行之有效的方法 [5] 。本研究将大鼠暴露于约相当于海拔8000m高度的低压舱中7h，发现低氧暴露大鼠脑含水量较对照动物显著增加(P<0.01)，表明动物发生急性高原性脑水肿;而预先给予丹参、党参和黄芪合剂[5ml/(kg·d)]连续7天，再行低氧暴露的大鼠，其脑含水量明显比单纯低氧组有明显降低。脑水肿被认为是引起颅内高压和急性高原反应的重要原因，因此，本研究的结果可以说明丹参、党参和黄芪合剂对高原缺氧性脑损伤具有一定的防治作用。Na + ，K + -ATP酶是一种膜结合酶，其活性与酶的脂质微环境有关。以往研究证明，脑缺氧后脑细胞膜Na + ，K + -ATP酶活性减少。Na + ，K + -ATP酶活性可作为脑功能和脑细胞膜是否正常的标志 [6] 。本研究中，低氧暴露后脑组织匀浆的Na + ，K + -ATP酶活性明显降低，而用丹参、党参和黄芪合剂预先保护的大鼠，其脑Na + ，K + -ATP酶活性上升，说明丹参、党参和黄芪合剂对维持脑功能正常和脑细胞膜完整有一定作用。
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脑缺氧可引起高能量化合物和ATP等降解，腺苷可代谢转变为黄嘌呤，以黄嘌呤氧化酶催化，使之产生尿酸和O 2 ·- ，O 2 ·- 生成过多会导致神经细胞膜脂质过氧化;此外，缺氧也可直接引起神经细胞膜去极化，使兴奋性氨基酸释放过多，NMDA受体活化，提高胞内Ca 2+ 浓度，活化磷脂酶A 2 ， 使花生四烯酸和氧自由基生成增加，促使膜脂质过氧化，而膜脂质过氧化是引起神经细胞功能障碍和死亡的原因之一。我们的实验中也发现大鼠经低氧暴露后脑内脂质过氧化物含量明显增加，而给予丹参、党参和黄芪合剂可以降低脑细胞膜脂质过氧化程度，说明丹参、党参和黄芪合剂还可通过抵抗氧自由基与脂质过氧化作用保护脑细胞。
综上所述，丹参、党参和黄芪合剂对高原缺氧性脑损伤可能具有保护作用，其机制与其抗氧自由基和膜脂质过氧化作用，提高Na + ，K + -ATP酶活性，改善细胞能量代谢有关。
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参考文献
1 石中瑗，越德铭，顾正中.急性和慢性缺氧对人体脑电图的影响.中国科学B辑，10:29-36.
2 李卫平，明亮，张艳，等.黄芪多塘耐缺氧作用的实验研究.安徽医科大学学报，1995，30:184.
3 陈维州.丹参的药理.药学学报，1994，19(11):876.
4 朱恩圆，贺庆，王峥涛，等.党参化学成分研究.中国药科大学学报，2001，32(2):94-95.
5 Andine P，Thordstein M，Kjellmer I，et al.Evaluation of brain damage in rat model of neomatal hypoxic-ischemia.J Neurosci Methods，1990，35:253-260.
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6 Teds Rosenkrantz，Joanna kubin，Omp.Mishra，et al.Brain cell memˉbrane Na+ ，K + -ATPase activity following severe hypoxic injury in the newborn piglet.Brain Res，1996，730:52.
作者单位:226001江苏省南通医学院航海医学研究所
200231上海交通大学海洋水下工程科学研究院
(收稿日期:2004-02-27)
(编辑依 依), http://www.100md.com
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关键词 丹参、党参和黄芪合剂 急性减压缺氧 Na + ，K + -ATP酶 超氧化物岐化酶丙二醛
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)10-0865-03
Protective effect of salvia miltiorrhiza，radix astrugali
and codonopsis pilosula mixture on hypoxia-induced brain damage
Li Jiancheng，Shi Zhongyuan，Jin Shuyi，et al.
Institute of Nautical Medicine，Nantong Medical College，Nantong226001.
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【Abstract】 Objective To study the protective effect of salvia miltiorrhiza，codonopsis pilosula and radix asˉtrugali mixture on hypoxia-induced brain damage and its mechanisms.Methods Adult SD rats were randomly dividˉed into three experimental groups:normoxic control(NC)，acute decompression hypoxia(AH)，salvia miltiorrhiza，codonopsis pilosula and radix astrugali mixture add decompression hypoxia(MH).Both cerebral water content and Na + ，K + -ATP ase activity，superoxide dismutase(SOD)，malondialdehyde(MDA)concentration in cerebral hoˉmogenate were determined respectively.Results (1)Compared to NC group，cerebral water content was significantly increased in AH group(P<0.01)，but this inscreasingwas inhibited in MH group(P<0.01).(2)Na + ，K + -ATPase activty incerebral homogenate of AH group was lower than that of NC group(P<0.05)，however，compared to AH group，it was increased(P<0.05).(3)Concentration of MDA in cerebral homogenate of AH group was higher than that of NC group(P<0.01)，MHgroup decreased this increase(P<0.01).(4)SOD activities were not significantly different between three groups.Conclusion Salvia miltiorrhiza，codonopsis pilosula and radix astrugali mixture has protective effect on hypoxia-induced brain damage，its mechanisms are related to the following factors:antagonist efˉfect of salvia miltiorrhiza，codonopsis pilosula and radix Astrugali mixture on oxygen-derived free radicals and memˉbrane lipid peroxidation and improving energymetabolism of cells.
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Key words salvia miltiorrhiza codonopsis pilosula and radix astrugali mixture acute decompression hypoxia Na + ，K + -ATPase malondialdehyde superoxide dismutase
脑是氧消耗量最大而贮氧量最少的组织之一，也是对缺氧最敏感的器官，因此，缺氧常引起脑功能障碍 [1] 。人快速从平原进入海拔3500m以上高原后，因高原低压低氧环境引起急性高山反应，出现一系列缺氧性脑功能、脑代谢紊乱的表现。然而关于急性高山反应的病理生理学机制尚未完全阐明，对该病防治仍缺少有效措施。黄芪(Radix Astruˉgali)是中医常用益气药之一，具有免疫调节、降压、强心等作用。近年来的研究还发现其具有抗缺氧作用 [2] ;丹参注射液可显著延长小鼠在常压和低压氧条件下的存活时间，提高小鼠在低氧状态下对氧的利用能力，并能提高机体在低氧状态下对氧的耐受力 [3] 。党参(Codonopsis Pilosula)为常用中药，现代药理研究表明，党参具有调节血糖、促进造血机能、降压、抗缺氧、耐疲劳、增强机体免疫力等多种作用 [4] 。我们将丹参、党参和黄芪提取物制成合制，运用已建立的低压低氧模型，观察预先给予丹参、党参和黄芪合剂是否能提高机体抗缺氧耐力，并分析其可能的作用机制，为高原缺氧机体损伤的防治工作提供实验依据。为此，我们将大鼠暴露于模拟海拔8000m高原环境，观察预先给予这三种药物对防治高原缺氧性脑损伤的效应，以探讨丹参、党参和黄芪合剂的神经保护作用及其机制。
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1 材料与方法
1.1 动物与分组 SD大鼠30只(南通医学院实验动物中心提供)体重180～200g，雌雄各半，按性别、体重分成3组(n=10):常氧对照组(NC组)，急性减压缺氧组(AH组)，丹参、党参和黄芪合剂加缺氧组(MH组)。
1.2 药物 丹参、党参和黄芪合剂由石中瑗教授提供，浓度为0.25生药/ml。
1.3 实验方法
1.3.1 给药方法 丹参、党参和黄芪合剂按5ml/kg体重剂量每天灌胃给药1次，连续7h;其余2组给予等体积的水。
1.3.2 减压方法 AH组和MH组动物在最后一次灌胃给药后半小时进入低压舱(舱容积为0.01m 3 )内，“以10m/s的速度升至海拔8000m”，持续7h;NC组不做任何处理，常氧室温饲养。
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1.4 生化测定 出舱后各组动物在1～2min内快速断头剥脑，其中半脑用于脑含水量的测定;另半脑称重后按1:10(w/v)加入0～4℃的生理盐水制成匀浆，用福林-酚法测定匀浆蛋白含量，Na + ，K + -ATP酶活性、超氧化物岐化酶 (SOD)和丙二醛(MDA)含量测定，按南京建成生物工程研究所提供的药盒说明进行操作。Na + ，K + -ATP酶活性以μmol pi/(mg pro)·h表示，超氧化物岐化酶以NU/mg pro表示，丙二醛含量以nmol/mg pro表示。
1.5 脑含水量测定 采用干湿质量法，取各组半侧脑组织于称量瓶中，称重后置50℃烘箱烤干至恒重。按公式计算含水量，脑含水量(%)=(湿重量-干重量)/湿重量×100%。
1.6 统计学处理 实验结果用均数±标准差(X±s)表示，boxbase建立数据库，组间的显著性用SPSS软件进行t检验、F检验。
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2 结果
2.1 丹参、党参和黄芪合剂对低氧暴露大鼠海马CA1区锥体细胞的影响 Nissl染色结果显示:常氧对照组海马CA1区锥体细胞排列紧密，形态完整，突起排列整齐、完整、较长。低氧暴露7h海马细胞变化不明显，低氧暴露24h复氧72h，海马CA1区锥体细胞数量锐减，突起紊乱、减少或消失。药物组细胞排列较整齐，数量只有少量减少，突起排列较整齐(见图1)。
图1 丹参、党参和黄芪合剂对低氧暴露大鼠海马CA1区锥体细胞层神经元的影响A:常氧对照组，海马CA1区锥体细胞排列紧密，形态完整，突起排列整齐、完整、较长(×100);B:低氧暴露7h组，海马CA1神经元变化不明显(×100);C:低氧暴露24h复氧72h组，海马CA1区锥体细胞数量锐减，突起紊乱、减少或消失(×100);D:丹参、党参和黄芪合剂+低氧暴露24h复氧72h组，海马CA1区锥体细胞排列较整齐，数量只有少量减少，突起排列较整齐(×100) 丹参、党参和黄芪合剂(×7，ig)对低氧暴露(8000m7h)。大鼠脑含水量、Na + ，K + -ATPase活性、SOD活性和丙二醛含量的影响，见表1，急性减压低氧组大鼠脑含水量较常氧对照组明显增加(P<0.01)，预先给予丹参、党参和黄芪合剂连续7天，脑含水量较急性低氧组显著降低(P<0. 01)，与常氧对照组接近。与常氧对照组相比，急性减压低氧组的Na + ，K + -ATPase活性明显下降(P<0.05)，MDA含量明显升高(P<0.01)，而给药组Na + ，K + -ATP酶活性上升(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.01)，SOD在3组中变化不明显。
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表1 对大鼠脑含水量、Na + ，K + -ATPase活性、SOD活性和丙二醛含量的影响
注:与NC组相比， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01，与AH组相比， # P<0.05， ## P<0.01
3 讨论
采用干湿质量法测定脑组织含水量是评价脑损伤的一种简单、准确、行之有效的方法 [5] 。本研究将大鼠暴露于约相当于海拔8000m高度的低压舱中7h，发现低氧暴露大鼠脑含水量较对照动物显著增加(P<0.01)，表明动物发生急性高原性脑水肿;而预先给予丹参、党参和黄芪合剂[5ml/(kg·d)]连续7天，再行低氧暴露的大鼠，其脑含水量明显比单纯低氧组有明显降低。脑水肿被认为是引起颅内高压和急性高原反应的重要原因，因此，本研究的结果可以说明丹参、党参和黄芪合剂对高原缺氧性脑损伤具有一定的防治作用。Na + ，K + -ATP酶是一种膜结合酶，其活性与酶的脂质微环境有关。以往研究证明，脑缺氧后脑细胞膜Na + ，K + -ATP酶活性减少。Na + ，K + -ATP酶活性可作为脑功能和脑细胞膜是否正常的标志 [6] 。本研究中，低氧暴露后脑组织匀浆的Na + ，K + -ATP酶活性明显降低，而用丹参、党参和黄芪合剂预先保护的大鼠，其脑Na + ，K + -ATP酶活性上升，说明丹参、党参和黄芪合剂对维持脑功能正常和脑细胞膜完整有一定作用。
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脑缺氧可引起高能量化合物和ATP等降解，腺苷可代谢转变为黄嘌呤，以黄嘌呤氧化酶催化，使之产生尿酸和O 2 ·- ，O 2 ·- 生成过多会导致神经细胞膜脂质过氧化;此外，缺氧也可直接引起神经细胞膜去极化，使兴奋性氨基酸释放过多，NMDA受体活化，提高胞内Ca 2+ 浓度，活化磷脂酶A 2 ， 使花生四烯酸和氧自由基生成增加，促使膜脂质过氧化，而膜脂质过氧化是引起神经细胞功能障碍和死亡的原因之一。我们的实验中也发现大鼠经低氧暴露后脑内脂质过氧化物含量明显增加，而给予丹参、党参和黄芪合剂可以降低脑细胞膜脂质过氧化程度，说明丹参、党参和黄芪合剂还可通过抵抗氧自由基与脂质过氧化作用保护脑细胞。
综上所述，丹参、党参和黄芪合剂对高原缺氧性脑损伤可能具有保护作用，其机制与其抗氧自由基和膜脂质过氧化作用，提高Na + ，K + -ATP酶活性，改善细胞能量代谢有关。
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1 石中瑗，越德铭，顾正中.急性和慢性缺氧对人体脑电图的影响.中国科学B辑，10:29-36.
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3 陈维州.丹参的药理.药学学报，1994，19(11):876.
4 朱恩圆，贺庆，王峥涛，等.党参化学成分研究.中国药科大学学报，2001，32(2):94-95.
5 Andine P，Thordstein M，Kjellmer I，et al.Evaluation of brain damage in rat model of neomatal hypoxic-ischemia.J Neurosci Methods，1990，35:253-260.
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6 Teds Rosenkrantz，Joanna kubin，Omp.Mishra，et al.Brain cell memˉbrane Na+ ，K + -ATPase activity following severe hypoxic injury in the newborn piglet.Brain Res，1996，730:52.
作者单位:226001江苏省南通医学院航海医学研究所
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