急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4的表达及意义
张伟 蒋耀光 谢志坚 吕凤林 胡承香 李磊
【摘要】 目的 观察严重胸部创伤致急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4基因及蛋白表达水平的变化，并探讨其意义。方法建立严重胸部创伤致急性肺损伤模型。肺组织机械剪碎，然后用胶原酶、DNA酶消化肺组织，分离、培养肺间质巨噬细胞，利用免疫印迹蛋白、Northern Blot等分子生物学技术检测创伤前以及创伤后2、4、8、16和24 h肺泡巨噬细胞TLR4蛋白及基因表达。结果 利用小型多功能生物撞击机以400 kPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤，能够建立稳定可靠并且符合临床特点的严重胸部创伤模型；严重胸部创伤可以上调TLR4蛋白及基因在肺间质巨噬细胞内的表达，表达高峰在伤后8和16 h，伤后24 h恢复正常。结论 TLR4的上调参与了创伤后失控性炎症反应的病理生理过程。
【关键词】 肺损伤，急性； 创伤，胸部； 损伤； 肺间质巨噬细胞； Toll样受体4；脂多糖类
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Change in Toll-like receptor 4 expression on interstitial macrophages in acute lung injury
ZHANG Wei, JIANG Yao-guang, XIE Zhi-jian, LU Fenglin, HU Cheng-xiang, LI Lei.
Department of Thoracic Surgery, South-West Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China； Corresponding author: LI Lei. First Department, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
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Objective: To observe changes in the level of Toll-like recepter 4(TLR4) mRNA and the expression of TLR4 protein in interstitial macrophages in serious thoracic injury. Methods: A rat model of severe thoracic trauma was reproduced,then interstitial macrophages were isolated and collected by enzymatic digestion before and after trauma cultured. TLR4 mRNA and the expression of TLR4 protein were measured by Northern and Western blotting before trauma and 2, 4, 8, 16, 24 hours after trauma.Results: A stable and reliable severe thoracic trauma model was successfully reproduced with 400 kPa impact on the up-right chest of rat by a multiple-function collision apparatus. The expression was up-regulated by trauma and the highest expression of interstitial macrophages occurred 8, 16 hours after the trauma, and returned to normal range at 24 hours. Conclusion: The up-regulation of TLR4 might participate in the pathological process of excessive inflammation after trauma to the lung.
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【Key words】 acute lung injury; thoracic trauma; trauma; interstitial macrophages; Toll-like receptor 4; lipopolysaccharide
严重胸部创伤常并发创伤性急性肺损伤(acute lung injury，ALI)，并发展成为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，其发病机制至今仍不清楚。研究表明，严重胸部创伤能引起机体内毒素(LPS)升高(1)。新近发现的Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是Toll家族成员之一，被认为是LPS胞内信号转导的重要通路。TLR4启动的胞内信号转导最终激活核因子-κB(NF-κB)，从而诱导肺内巨噬细胞产生免疫炎性细胞因子，或扩大非特异性防御反应，或诱发特异性免疫反应，因而是极为重要的天然免疫受体。既往人们对肺巨噬细胞的研究主要来源于对肺泡巨噬细胞的认识；而位于间质内的巨噬细胞，由于取材的限制，对其功能、作用尚不清楚。将其应用于创伤性ALI发病机制的研究，无疑具有重要科学意义，也为调控创伤后的免疫紊乱状态，防治创伤并发症提供理论基础。
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1 材料与方法
1.1 严重胸部创伤模型制备及动物分组：Wistar大鼠(第三军医大学动物研究所提供)，雌雄不拘，体质量150~200 g。随机分为对照组(n=3)及创伤组(n=15)，致伤前12 h禁食、自由饮水。对照组单纯麻醉不致伤。创伤组吸入乙醚麻醉后，左侧45°卧位，采用小型多功能生物撞击机以400 kPa压力撞击右侧腋前线第四肋间。致伤后动物参照器官损伤定级(OIS)和创伤严重度评分(AIS)-90标准以及死亡率，结合电镜观察结果判定其损伤程度。
1.2 巨噬细胞分离与培养：动物腹腔注射质量分数为20%的乌拉坦麻醉，开胸，充分暴露心、肺，经右心室将一导管插入肺动脉并且固定，于肝脏上方切断主动脉。无Ca2+、Mg2+冷磷酸盐缓冲液(PBS)，4 ℃，pH 74，经导管反复灌洗肺血管床，至肺表面呈苍白色胶冻状。取出气管及肺脏，用37 ℃ PBS反复灌洗气管、支气管肺泡10~15次，至镜下偶见肺泡巨噬细胞。将灌洗后的肺组织剪碎，加入20 ml酶消化液(含胶原酶140 kU/L，DNA酶50 kU/L)，于37 ℃恒温震荡水浴箱中消化60 min，200目钢网过滤。离心(800×g)消化液10 min，RPMI-1640培养液悬浮细胞，37 ℃、体积分数为5%的CO 2培养箱中培养2 h，洗去未贴壁细胞，胰酶消化贴壁的巨噬细胞，调整细胞浓度为1×108/L备用。瑞氏染色法鉴定巨噬细胞纯度>90%；苔盼蓝染色，细胞存活率>95%。
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1.3 电镜观察：取创伤后大鼠8只，分别于伤后8、24 h剖胸，观察记录肺部大体病理改变。留取致伤大鼠挫伤区(右肺上叶)肺组织，标本取材后立即切成1 mm3大小，以体积分数为03%的戊二醛固定，再用质量分数为1%的四氧化锇固定，梯度丙酮脱水后，环氧树脂包埋，行超薄切片，透射电镜观察。
1.4 细胞总RNA提取与测定：采用改良异硫氰酸胍法(2)行细胞总RNA和巨噬细胞核蛋白提取，蛋白定量按Lorry法测定，-20 ℃保存。
1.5 免疫印迹蛋白(Western Blot)检测TLR4蛋白表达：上样量为每泳道40 μg。将留取的待测标本加入十二烷基硫酸钠聚丙烯胺(SDS)凝胶加样缓冲液2次，在100 ℃变性3 min，迅速放入冰中冷却，顺序加样，经体积分数为4%的积层胶在80 V电压
下电泳约30 min，然后经体积分数为12%的分离胶在100 V电压下电泳约2 h，取下分离胶进行电转印。半干转膜仪(Bio-Rad)在20 V恒压下转移12 h后取出。转印后的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用于杂交，用封闭液在37 ℃水浴箱内封闭2 h，将膜用PBS摇洗15 min共2次，加入TLR4抗体(1∶200稀释，SantaCruz)，37 ℃孵育1 h，将膜与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶5 000稀释，SantaCruz)在37 ℃下孵育1 h，然后与X线胶片共同放入暗盒内曝光30 s~10 min，常规显影、定影。
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1.6 Northern Blot检测TLR4 mRNA表达：总RNA按前述方法提取后，取1 μl RNA样品，稀释100倍，260 nm和280 nm处比色，260 nm/280 nm吸光度比值在16～20时可用于Northern杂交。然后行RNA甲醛凝胶电泳和转膜，每孔RNA样品10 μg，电泳70 V，45 h。根据Star程序软件设计大鼠的TLR4探针为：TATCATCAGTGTATCGGTGG TCAGTGTGCTTGTGGTAG，标记探针用放射性核素α-32P。电泳完毕后将RNA转移到尼龙膜上，在SSC中漂洗20次以去掉膜上的凝胶，晾干后80 ℃烘烤2 h。将膜置于杂交袋中,加入杂交液，42 ℃水浴中预杂交3 h。杂交完毕后，于暗盒内压上2张X线片，置-70 ℃放射显影。
1.7 统计学处理：所有图像的数据采集和分析用UVP BioImaging系统和Lab Works30软件进行，将X线胶片扫描后的图像数据输入Lab Works30图像分析系统，测定各目的条带的积分吸光度值，并将3次结果的平均值进行统计学分析。实验中所有数据均以均数±标准差(x±s)表示，每两组之间的计数资料比较采用χ2检验；每两组之间的计量资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
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2 结 果
2.1 模型动物一般情况和肺病理变化：采用该致伤模型或伤后，大鼠出现呼吸急促、口唇发绀、苏醒延迟、精神萎靡、食欲减退、活动减少、毛发竖立等表现，部分大鼠口鼻出现血性分泌物，少数大鼠还出现寒战。平均AIS为(415±024)分，OIS在较重与重度范围，1 h死亡率为40%，24 h死亡率为52%。电镜下见毛细血管内红细胞淤滞，炎细胞与血管内皮细胞黏附，Ⅱ型上皮细胞水肿，板层小体脱颗粒、空泡化、数目减少，细胞核固缩、核周间隙增大。肺泡腔内见中性粒细胞、单核-巨噬细胞和大量红细胞渗出，呈ALI病理改变。
2.2 TLR4蛋白表达(表1，图1)：巨噬细胞细胞群TLR4蛋白从伤后4 h开始增加，伤后8 h达到高峰，16 h仍处于较高水平，随后降低，伤后24 h恢复正常；复合LPS刺激后其变化趋势相似。
2.3 TLR4基因表达(表2，图2)
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3 讨 论
随着社会工业化进程加快及交通日益发达，创伤发病率不断增加，且伤情、伤类也更复杂。本世纪以来，因道路交通事故致死的人数已超过3 200万，而同期死于战争的人数约为2 350万，交通事故已成为“世界第一伤害”(3)。据WHO的统计资料，全球每年因创伤致伤人数约千万人，其中胸部创伤占创伤病例的15%～45%，而严重胸部创伤死亡率在25%左右(4，5)。Bardenheuer等(6)报道，在2 069例创伤患者流行病学调查中，交通伤达567%，其中胸部创伤最多见，占445%。因此，严重胸部创伤致ALI是目前创伤医学中亟待攻克的医学难题。严重胸部创伤一方面可以直接造成肺组织的损伤，另一方面还可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)，两者互为因果、互相加强，最终引发ALI，并进而发展为ARDS。现认为ALI与ARDS是同一病理过程中的两个不同阶段，ARDS是ALI的晚期表现(7)，至今对ALI的发病机制尚不明确。对严重胸部创伤继发的ALI进行深入研究，需要稳定可靠并且符合临床特点的动物模型。本研究中发现，用400 kPa驱动压力致伤，半数大鼠存活至伤后24 h以上，其肺部伤情在较重与重度范围内，平均AIS分值为415；病理检查发现撞击侧肺(右上肺)肺泡腔及间质内广泛出血，肺泡结构被破坏并有白细胞及单核-巨噬细胞浸润，血管内皮有炎细胞黏附，说明本模型是一种较好的对严重胸部创伤所致并发症进行研究的动物模型。作为重要的免疫细胞，肺内巨噬细胞是肺部炎症发生的调控中心，其表面受体表达及其对致炎因子的识别在SIRS发生和发展中具有重要作用。特别是巨噬细胞因其特殊的解剖位置，位于肺间质内，所释放的抗炎介质对于创伤后的肺间质感染具有更直接的作用。由于肺间质巨噬细胞分离方法复杂，获取较困难，使大部分研究局限于肺泡巨噬细胞，有关巨噬细胞的研究资料报道较少(6)，其在胸部创伤后TLR4的变化尚未见相关报道。严重创伤、感染情况下，单核-巨噬细胞活化，引起多种炎症介质大量、持续释放，导致SIRS。研究表明，炎症反应的启动有赖于模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)对病原体保守分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的识别(8)。TLR4是典型的模式识别受体，主要表达于单核-巨噬细胞，识别内外源性致炎因子，介导肺部炎症反应(9)。我们的结果显示，单纯LPS刺激虽然增加了巨噬细胞的TLR4 mRNA及蛋白表达，但差异不显著。目前LPS对TLR4表达影响的研究报道存在较大差异。Matsuguchi等(10)报道在小鼠巨噬细胞用LPS诱导了TLR2的高表达，却没有引起TLR4的变化。相反，Muzio等(11)在体外试验表明，LPS刺激人外周血单核细胞4 h，可以剂量依赖性地诱导TLR4 mRNA表达增加；Jang等(12)在体外单核细胞培养中，以TLR4抗体检测TLR4表达时发现，TLR4在单核细胞有基础表达，LPS(400 μg/L)作用后05 h，TLR4 mRNA及蛋白表达增加，且两者具有相关性。因此，我们认为，LPS对大鼠表达TLR4的不同影响，可能与组织细胞类型、分化程度以及LPS的作用时间、浓度有关系。本研究中发现，严重胸部创伤能上调间质巨噬细胞TLR4蛋白和基因水平，且两者变化时相一致，伤后4 h增加，表达高峰在伤后8和16 h，随后降低，伤后24 h恢复正常，但复合LPS攻击并未改变其变化趋势。这种现象可能与我们使用LPS剂量过小有关。Liu等(13)也认为高浓度的LPS才能使TLR4 mRNA表达上调。大量研究表明，TLR通路是由几个蛋白质复合物介导的，第一个复合物包括活性TLRs、接头分子MyD88、IRAK，被激活的TLR4复合物由肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6)介导，最终激活NF-κB，引起肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6等开放效应基因的转录(14)。因此，胸部创伤后TLR4表达上调引起大量炎症因子活化、转录以及大量合成、释放，形成炎症反应，以清除外来病原体。创伤后肺间质巨噬细胞TLR4表达上调，是免疫系统对胸部创伤和应激的一种反应，甚至使机体在细胞、组织、器官、系统乃至整体水平对致炎因子的敏感性增强，这可能对机体造成双向性影响：一方面是机体的防御反应增强，有利于机体抵御各种感染；另一方面，导致机体容易发生SIRS，在这个病理过程中，肺是最容易受损的器官，极易引发ALI，甚至多器官功能障碍综合征(MODS)。Paterson等(15)在小鼠烫伤模型的实验中观察到烫伤后3 h未发现TLR4表达增加，其表达增加出现在伤后1 d，相比我们结果则其表达延迟，推测与创伤模型、创伤程度不一致有关；Paterson等同时还发现，伤后早期脾脏巨噬细胞表面TLR4平均密度显著增加，同时增强了TLR4对LPS的敏感性。结论提示，TLR4作为模式识别分子，不仅能识别外来病原体，也能识别和介导内源性刺激因子。它的这种生物学特征对于创伤研究有重要意义，因为创伤导致机体大量坏死组织产生，从而触发内源性TLR4刺激，如热休克蛋白60(HSP60)；细胞坏死后释放的蛋白也能引起TLR4转录(16)，TLR4通过识别这些危险信号而启动自身转录，诱发炎症反应。
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参考文献
1 郑仲谨，顾长国，胡承香，等.创伤患者外周血单核细胞Toll样受体4和髓样分化蛋白-2基因表达的变化(J).中华创伤杂志，2003，19：23-25
2 熊仁平，刘萍，周元国，等.从少量培养细胞中同时提取微量蛋白和RNA的方法(J).中国生物化学与分子生物学报，2003，19：256-260.
3 王正国.交通事故伤(J).中国危重病急救医学，1999，11：325-326.
4 王正国，刘宝松，李晓炎，等.颅脑和胸部撞击伤发生机制研究(J).中国危重病急救医学，2001，13：400-403.
5 王正国.21世纪交通伤研究(J).创伤外科杂志，2000，2：1-4.
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6 Bardenheuer M,Obertacke U,Waydhas C,et al.Epidemiology of the severely injured patient:a prospective assessment of preclinical and clinical management;AG polytrauma of DGU(J).Unfallchirurg,2000，103:355-363
7 张伟，蒋耀光，谢志坚，等.严重胸部创伤复合内毒素感染对肺泡与肺间质巨噬细胞吞噬功能的影响(J).中国危重病急救医学，2003，15：408-410
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9 Akira S,Hemmi H.Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family(J).Immunol Lett,2003,85:85-95.
10 Matsuguchi T,Musikacharoen T,Ogawa T,et al.Gene expression of Toll-like receptor 2,but not toll-like receptor 4 is induced by LPS and inflammation cytokines in mouse macrophages(J).J Immunol,2000，165:5767-5772.
11 Muzio M D,Bosisio N,Polentarutti G,et al.Differential expression and regulation of Toll-like receptors(TLR) in human leukocytes:selective expression of TLR3 in dentritic cells(J).J Immunol,2000，164:5998-6004.
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12 Jang Q,Akashi S,Miyake K,et al.Cutting edge:lipopolysaccharide induces physical proximity between CD14 and Toll-like receptor 4(TLR4) prior to nuclear translocation of NF-κB(J).J Immunol,2000，165:3541-3544.
13 Liu Y,Wang Y,Yamakuchi M,et al.Upregulation of toll-like receptor 4 gene expression in macrophage response to peptidoglycan high concentration of lipopolysaccharide is involved in NF-κB activation(J).Infect Immun,2001，69:2788-2796.
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14 Poltorak A H,Xialong H,Sminova I,et al.Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice:mutations in TLR4 gene(J).Science,1998,282:2085-2088.
15 Paterson H M,Murphy T J,Purcell E J,et al.Injury primes the innate immune system for enhanced Toll-like receptor reactivity(J).J Immunol,2003,171:1473-1483.
16Ohashi K,Burkart V,Flohe S,et al.Cutting edge:heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the Toll-like receptor-4 complex(J).J Immunol,2000，164:558.
作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院胸心外科(张伟)；400042 重庆，第三军医大学大坪医院全军胸心外科中心(蒋耀光)，野战外科研究所一室(谢志坚，吕凤林，胡承香，李磊)通讯作者：李磊(Email:leili@cta.cq.cn)
作者简介：张伟(1966-)，男(汉族)，重庆市人，医学博士，主治医师，主要从事创伤免疫学的研究。, 百拇医药
【摘要】 目的 观察严重胸部创伤致急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4基因及蛋白表达水平的变化，并探讨其意义。方法建立严重胸部创伤致急性肺损伤模型。肺组织机械剪碎，然后用胶原酶、DNA酶消化肺组织，分离、培养肺间质巨噬细胞，利用免疫印迹蛋白、Northern Blot等分子生物学技术检测创伤前以及创伤后2、4、8、16和24 h肺泡巨噬细胞TLR4蛋白及基因表达。结果 利用小型多功能生物撞击机以400 kPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤，能够建立稳定可靠并且符合临床特点的严重胸部创伤模型；严重胸部创伤可以上调TLR4蛋白及基因在肺间质巨噬细胞内的表达，表达高峰在伤后8和16 h，伤后24 h恢复正常。结论 TLR4的上调参与了创伤后失控性炎症反应的病理生理过程。
【关键词】 肺损伤，急性； 创伤，胸部； 损伤； 肺间质巨噬细胞； Toll样受体4；脂多糖类
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Change in Toll-like receptor 4 expression on interstitial macrophages in acute lung injury
ZHANG Wei, JIANG Yao-guang, XIE Zhi-jian, LU Fenglin, HU Cheng-xiang, LI Lei.
Department of Thoracic Surgery, South-West Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China； Corresponding author: LI Lei. First Department, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
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Objective: To observe changes in the level of Toll-like recepter 4(TLR4) mRNA and the expression of TLR4 protein in interstitial macrophages in serious thoracic injury. Methods: A rat model of severe thoracic trauma was reproduced,then interstitial macrophages were isolated and collected by enzymatic digestion before and after trauma cultured. TLR4 mRNA and the expression of TLR4 protein were measured by Northern and Western blotting before trauma and 2, 4, 8, 16, 24 hours after trauma.Results: A stable and reliable severe thoracic trauma model was successfully reproduced with 400 kPa impact on the up-right chest of rat by a multiple-function collision apparatus. The expression was up-regulated by trauma and the highest expression of interstitial macrophages occurred 8, 16 hours after the trauma, and returned to normal range at 24 hours. Conclusion: The up-regulation of TLR4 might participate in the pathological process of excessive inflammation after trauma to the lung.
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【Key words】 acute lung injury; thoracic trauma; trauma; interstitial macrophages; Toll-like receptor 4; lipopolysaccharide
严重胸部创伤常并发创伤性急性肺损伤(acute lung injury，ALI)，并发展成为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，其发病机制至今仍不清楚。研究表明，严重胸部创伤能引起机体内毒素(LPS)升高(1)。新近发现的Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)是Toll家族成员之一，被认为是LPS胞内信号转导的重要通路。TLR4启动的胞内信号转导最终激活核因子-κB(NF-κB)，从而诱导肺内巨噬细胞产生免疫炎性细胞因子，或扩大非特异性防御反应，或诱发特异性免疫反应，因而是极为重要的天然免疫受体。既往人们对肺巨噬细胞的研究主要来源于对肺泡巨噬细胞的认识；而位于间质内的巨噬细胞，由于取材的限制，对其功能、作用尚不清楚。将其应用于创伤性ALI发病机制的研究，无疑具有重要科学意义，也为调控创伤后的免疫紊乱状态，防治创伤并发症提供理论基础。
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1 材料与方法
1.1 严重胸部创伤模型制备及动物分组：Wistar大鼠(第三军医大学动物研究所提供)，雌雄不拘，体质量150~200 g。随机分为对照组(n=3)及创伤组(n=15)，致伤前12 h禁食、自由饮水。对照组单纯麻醉不致伤。创伤组吸入乙醚麻醉后，左侧45°卧位，采用小型多功能生物撞击机以400 kPa压力撞击右侧腋前线第四肋间。致伤后动物参照器官损伤定级(OIS)和创伤严重度评分(AIS)-90标准以及死亡率，结合电镜观察结果判定其损伤程度。
1.2 巨噬细胞分离与培养：动物腹腔注射质量分数为20%的乌拉坦麻醉，开胸，充分暴露心、肺，经右心室将一导管插入肺动脉并且固定，于肝脏上方切断主动脉。无Ca2+、Mg2+冷磷酸盐缓冲液(PBS)，4 ℃，pH 74，经导管反复灌洗肺血管床，至肺表面呈苍白色胶冻状。取出气管及肺脏，用37 ℃ PBS反复灌洗气管、支气管肺泡10~15次，至镜下偶见肺泡巨噬细胞。将灌洗后的肺组织剪碎，加入20 ml酶消化液(含胶原酶140 kU/L，DNA酶50 kU/L)，于37 ℃恒温震荡水浴箱中消化60 min，200目钢网过滤。离心(800×g)消化液10 min，RPMI-1640培养液悬浮细胞，37 ℃、体积分数为5%的CO 2培养箱中培养2 h，洗去未贴壁细胞，胰酶消化贴壁的巨噬细胞，调整细胞浓度为1×108/L备用。瑞氏染色法鉴定巨噬细胞纯度>90%；苔盼蓝染色，细胞存活率>95%。
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1.3 电镜观察：取创伤后大鼠8只，分别于伤后8、24 h剖胸，观察记录肺部大体病理改变。留取致伤大鼠挫伤区(右肺上叶)肺组织，标本取材后立即切成1 mm3大小，以体积分数为03%的戊二醛固定，再用质量分数为1%的四氧化锇固定，梯度丙酮脱水后，环氧树脂包埋，行超薄切片，透射电镜观察。
1.4 细胞总RNA提取与测定：采用改良异硫氰酸胍法(2)行细胞总RNA和巨噬细胞核蛋白提取，蛋白定量按Lorry法测定，-20 ℃保存。
1.5 免疫印迹蛋白(Western Blot)检测TLR4蛋白表达：上样量为每泳道40 μg。将留取的待测标本加入十二烷基硫酸钠聚丙烯胺(SDS)凝胶加样缓冲液2次，在100 ℃变性3 min，迅速放入冰中冷却，顺序加样，经体积分数为4%的积层胶在80 V电压
下电泳约30 min，然后经体积分数为12%的分离胶在100 V电压下电泳约2 h，取下分离胶进行电转印。半干转膜仪(Bio-Rad)在20 V恒压下转移12 h后取出。转印后的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用于杂交，用封闭液在37 ℃水浴箱内封闭2 h，将膜用PBS摇洗15 min共2次，加入TLR4抗体(1∶200稀释，SantaCruz)，37 ℃孵育1 h，将膜与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶5 000稀释，SantaCruz)在37 ℃下孵育1 h，然后与X线胶片共同放入暗盒内曝光30 s~10 min，常规显影、定影。
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1.6 Northern Blot检测TLR4 mRNA表达：总RNA按前述方法提取后，取1 μl RNA样品，稀释100倍，260 nm和280 nm处比色，260 nm/280 nm吸光度比值在16～20时可用于Northern杂交。然后行RNA甲醛凝胶电泳和转膜，每孔RNA样品10 μg，电泳70 V，45 h。根据Star程序软件设计大鼠的TLR4探针为：TATCATCAGTGTATCGGTGG TCAGTGTGCTTGTGGTAG，标记探针用放射性核素α-32P。电泳完毕后将RNA转移到尼龙膜上，在SSC中漂洗20次以去掉膜上的凝胶，晾干后80 ℃烘烤2 h。将膜置于杂交袋中,加入杂交液，42 ℃水浴中预杂交3 h。杂交完毕后，于暗盒内压上2张X线片，置-70 ℃放射显影。
1.7 统计学处理：所有图像的数据采集和分析用UVP BioImaging系统和Lab Works30软件进行，将X线胶片扫描后的图像数据输入Lab Works30图像分析系统，测定各目的条带的积分吸光度值，并将3次结果的平均值进行统计学分析。实验中所有数据均以均数±标准差(x±s)表示，每两组之间的计数资料比较采用χ2检验；每两组之间的计量资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
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2 结 果
2.1 模型动物一般情况和肺病理变化：采用该致伤模型或伤后，大鼠出现呼吸急促、口唇发绀、苏醒延迟、精神萎靡、食欲减退、活动减少、毛发竖立等表现，部分大鼠口鼻出现血性分泌物，少数大鼠还出现寒战。平均AIS为(415±024)分，OIS在较重与重度范围，1 h死亡率为40%，24 h死亡率为52%。电镜下见毛细血管内红细胞淤滞，炎细胞与血管内皮细胞黏附，Ⅱ型上皮细胞水肿，板层小体脱颗粒、空泡化、数目减少，细胞核固缩、核周间隙增大。肺泡腔内见中性粒细胞、单核-巨噬细胞和大量红细胞渗出，呈ALI病理改变。
2.2 TLR4蛋白表达(表1，图1)：巨噬细胞细胞群TLR4蛋白从伤后4 h开始增加，伤后8 h达到高峰，16 h仍处于较高水平，随后降低，伤后24 h恢复正常；复合LPS刺激后其变化趋势相似。
2.3 TLR4基因表达(表2，图2)
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3 讨 论
随着社会工业化进程加快及交通日益发达，创伤发病率不断增加，且伤情、伤类也更复杂。本世纪以来，因道路交通事故致死的人数已超过3 200万，而同期死于战争的人数约为2 350万，交通事故已成为“世界第一伤害”(3)。据WHO的统计资料，全球每年因创伤致伤人数约千万人，其中胸部创伤占创伤病例的15%～45%，而严重胸部创伤死亡率在25%左右(4，5)。Bardenheuer等(6)报道，在2 069例创伤患者流行病学调查中，交通伤达567%，其中胸部创伤最多见，占445%。因此，严重胸部创伤致ALI是目前创伤医学中亟待攻克的医学难题。严重胸部创伤一方面可以直接造成肺组织的损伤，另一方面还可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)，两者互为因果、互相加强，最终引发ALI，并进而发展为ARDS。现认为ALI与ARDS是同一病理过程中的两个不同阶段，ARDS是ALI的晚期表现(7)，至今对ALI的发病机制尚不明确。对严重胸部创伤继发的ALI进行深入研究，需要稳定可靠并且符合临床特点的动物模型。本研究中发现，用400 kPa驱动压力致伤，半数大鼠存活至伤后24 h以上，其肺部伤情在较重与重度范围内，平均AIS分值为415；病理检查发现撞击侧肺(右上肺)肺泡腔及间质内广泛出血，肺泡结构被破坏并有白细胞及单核-巨噬细胞浸润，血管内皮有炎细胞黏附，说明本模型是一种较好的对严重胸部创伤所致并发症进行研究的动物模型。作为重要的免疫细胞，肺内巨噬细胞是肺部炎症发生的调控中心，其表面受体表达及其对致炎因子的识别在SIRS发生和发展中具有重要作用。特别是巨噬细胞因其特殊的解剖位置，位于肺间质内，所释放的抗炎介质对于创伤后的肺间质感染具有更直接的作用。由于肺间质巨噬细胞分离方法复杂，获取较困难，使大部分研究局限于肺泡巨噬细胞，有关巨噬细胞的研究资料报道较少(6)，其在胸部创伤后TLR4的变化尚未见相关报道。严重创伤、感染情况下，单核-巨噬细胞活化，引起多种炎症介质大量、持续释放，导致SIRS。研究表明，炎症反应的启动有赖于模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)对病原体保守分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的识别(8)。TLR4是典型的模式识别受体，主要表达于单核-巨噬细胞，识别内外源性致炎因子，介导肺部炎症反应(9)。我们的结果显示，单纯LPS刺激虽然增加了巨噬细胞的TLR4 mRNA及蛋白表达，但差异不显著。目前LPS对TLR4表达影响的研究报道存在较大差异。Matsuguchi等(10)报道在小鼠巨噬细胞用LPS诱导了TLR2的高表达，却没有引起TLR4的变化。相反，Muzio等(11)在体外试验表明，LPS刺激人外周血单核细胞4 h，可以剂量依赖性地诱导TLR4 mRNA表达增加；Jang等(12)在体外单核细胞培养中，以TLR4抗体检测TLR4表达时发现，TLR4在单核细胞有基础表达，LPS(400 μg/L)作用后05 h，TLR4 mRNA及蛋白表达增加，且两者具有相关性。因此，我们认为，LPS对大鼠表达TLR4的不同影响，可能与组织细胞类型、分化程度以及LPS的作用时间、浓度有关系。本研究中发现，严重胸部创伤能上调间质巨噬细胞TLR4蛋白和基因水平，且两者变化时相一致，伤后4 h增加，表达高峰在伤后8和16 h，随后降低，伤后24 h恢复正常，但复合LPS攻击并未改变其变化趋势。这种现象可能与我们使用LPS剂量过小有关。Liu等(13)也认为高浓度的LPS才能使TLR4 mRNA表达上调。大量研究表明，TLR通路是由几个蛋白质复合物介导的，第一个复合物包括活性TLRs、接头分子MyD88、IRAK，被激活的TLR4复合物由肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6)介导，最终激活NF-κB，引起肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6等开放效应基因的转录(14)。因此，胸部创伤后TLR4表达上调引起大量炎症因子活化、转录以及大量合成、释放，形成炎症反应，以清除外来病原体。创伤后肺间质巨噬细胞TLR4表达上调，是免疫系统对胸部创伤和应激的一种反应，甚至使机体在细胞、组织、器官、系统乃至整体水平对致炎因子的敏感性增强，这可能对机体造成双向性影响：一方面是机体的防御反应增强，有利于机体抵御各种感染；另一方面，导致机体容易发生SIRS，在这个病理过程中，肺是最容易受损的器官，极易引发ALI，甚至多器官功能障碍综合征(MODS)。Paterson等(15)在小鼠烫伤模型的实验中观察到烫伤后3 h未发现TLR4表达增加，其表达增加出现在伤后1 d，相比我们结果则其表达延迟，推测与创伤模型、创伤程度不一致有关；Paterson等同时还发现，伤后早期脾脏巨噬细胞表面TLR4平均密度显著增加，同时增强了TLR4对LPS的敏感性。结论提示，TLR4作为模式识别分子，不仅能识别外来病原体，也能识别和介导内源性刺激因子。它的这种生物学特征对于创伤研究有重要意义，因为创伤导致机体大量坏死组织产生，从而触发内源性TLR4刺激，如热休克蛋白60(HSP60)；细胞坏死后释放的蛋白也能引起TLR4转录(16)，TLR4通过识别这些危险信号而启动自身转录，诱发炎症反应。
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作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院胸心外科(张伟)；400042 重庆，第三军医大学大坪医院全军胸心外科中心(蒋耀光)，野战外科研究所一室(谢志坚，吕凤林，胡承香，李磊)通讯作者：李磊(Email:leili@cta.cq.cn)
作者简介：张伟(1966-)，男(汉族)，重庆市人，医学博士，主治医师，主要从事创伤免疫学的研究。, 百拇医药