人前列腺增生症中CDKN2基因CpG岛异常甲基化
作者：邱启裕 高新 梅骅 Lilly Zhang 姚学军
单位：邱启裕 高新 梅骅(中山医科大学附属第三医院泌尿外科， 广东 广州 510630)；Lilly Zhang( 美国贝勒生殖医学研究中心,美国 德克萨斯 75246)；姚学军( 湖北医科大学病毒所, 湖北 武汉 430071)
关键词：
00zk27
摘 要：【目的】 探讨前列腺增生症(BPH)与CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化之间的关系。【方法】 用PCR-甲基化检测法检测38例BPH中CDKN2基因α、β型外显子1的甲基化情况。【结果】 38例BPH标本中16例(42.1%)有CDKN2基因CpG岛异常甲基化，甲基化序列主要为CmCGG和CCmCGGG。【结论】 CDKN2基因CpG岛异常甲基化是其在BPH中的主要失活机制，参与BPH的发生发展。
, 百拇医药
中图分类号： R697.32 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0095-03
Hypermethylation of the CDKN2 Gene in Human Benign Prostatic Hyperplasia
QIU Qi-yu， GAO Xin， MEI Hua
( Department of Urology, Third Affiliated Hospital, Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630, China)
Lilly ZHANG
, 百拇医药 (Baylor Center For Reproductive Health, Texas 75246, U.S.A)
YAO Xue-jun
(Department of Virology, Hubei Medical University, Wuhan 430071，China)
Abstract: 【Objective】 To study the relationship between inactivation of CDKN2 gene by de novo methylation and the pathogenesis of benign prostatic hyperplasia. 【Methods】 The methylation status of DNA were analyzed by PCR-based methylation assay in 38 BPH cases. 【Results】 de novo methylation of CDKN2 gene were detected in 16 (42.1%) of 38 patients, and the methylation sequences were CmCGG and CCmCGGG. 【Conclusion】 It is suggested that de novo methylation is one of predominant mechanisms of inactivation of the CDKN2 gene and may be associated with the pathogenesis of benign prostatic hyperplasia.
, 百拇医药
Key words: prostatic hyperplasia/genetics; CDKN2 gene; de novo methylation; inactivation
1994年Kamb和Beach的研究小组发现在9p21区域有一个等位基因丢失和另一个等位基因的突变，将此新克隆的基因称为p16基因，又称为多肿瘤抑制基因，后被人类基因组织正式命名为CDKN2 (cyclin dependent kinase inhibitor 2),该基因是直接作用于细胞增殖周期而抑制细胞生长的基因[1]。前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia, BPH)的形成与其细胞的过度增殖有关，CDKN2是直接作用于细胞增殖周期而抑制细胞生长的抑癌基因[1]，作者在研究了该基因的突变缺失与BPH之间的关系后，就CDKN2基因启动子区5′CpG岛异常甲基化与BPH的发病机制之间的关系作了进一步的研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 组织标本
38例BPH标本为1997年3月-1999年12月间湖北医科大学附属第二医院和黄石市中心医院手术切除标本，术后均经病理学检查证实为BPH。标本在切除后1 h放入液氮中保存待用。
1.2 PCR-SSCP分析
苯酚-氯仿/异戊醇法提取组织DNA，分光光密度法测量DNA的含量。扩增CDKN2基因外显子1、2，引物序列、扩增、循环条件参见有关文献[1～3]。扩增产物经甲酰胺变性后，在PAGE凝胶中电泳300 V，1.5 h,硝酸银染色，在干胶仪上干胶后保存。
1.3 PCR-甲基化检测法
为了检测BPH标本中CDKN2基因5′CpG岛甲基化的情况，先用20 U EcoRⅠ酶切(37 ℃、1.5 h)，再分别用40 U的甲基化敏感酶(HpaⅡ 37 ℃、SmaⅠ 30 ℃)、甲基化非敏感酶(MspⅠ 37 ℃)完全消化1 μg标本DNA 2 h，各取消化后的DNA 5 μL为底物，以CDKN2基因外显子1 (包括E1α和E1β)的引物作PCR扩增，扩增条件与前相同。结果在荧光下分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 PCR-SSCP分析
对所有PCR扩增结果阳性的标本进行单链构象多态性(SSCP)电泳分析，结果发现无一例标本出现异常泳动带，说明这些BPH标本中CDKN2基因未发现有突变和微小缺失。
2.2 CDKN2基因异常甲基化分析
用EcoRⅠ内切酶和甲基化敏感酶HpaⅡ和SmaⅠ完全消化后，在所有未甲基化的标本中可见到0.4、0.6、0.9和4.3 kb的片段，如标本的此位点已被甲基化，则只见到4.3 kb的片段。以CDKN2基因外显子1引物扩增消化后的DNA，如标本的外显子1未被甲基化，则PCR无扩增产物；如有甲基化则有PCR扩增产物。同时用EcoRⅠ内切酶和甲基化非敏感酶MspⅠ消化组织DNA作为对照，消化后作外显子1的PCR无扩增产物。
, 百拇医药
2.3 BPH组织CpG岛异常甲基化情况
检测的38例BPH标本中有16例(42.1%)表现为CDKN2基因CpG岛异常甲基化(表1)。其中外显子E1α甲基化为6例，包括HpaⅡ和SmaⅠ位点均甲基化的2例，只SmaⅠ位点甲基化的4例；外显子E1β甲基化为14例(其中4例为E1α和E1β同时甲基化)，包括HpaⅡ位点甲基化的2例和SmaⅠ位点甲基化的12例。这16例标本用甲基化敏感酶消化后作CDKN2基因外显子1的扩增均有产物；而用MspⅠ内切酶消化后作PCR均无扩增产物(图1)。
表1 38例BPH中CDKN2基因的甲基化情况
Table 1 Methylation status of CDKN2 gene in 38 BPH CDKN2 gene
Methylation (%)
, 百拇医药
Non-Methylation (%)
E1α
6(15.8)
32(84.2)
E1β
14(36.8)
24(63.2)
E1α+ E1β
4(10.5)
34(89.5)
Total
16(42.1)
, 百拇医药
22(57.9)
图1 BPH组织PCR-甲基化检测电泳
Fig.1 Results of PCR-based methylation assays in BPH tissues
M: PCR Marker; 1,3,6 have de novo methylation. Their PCR-based methylation assay′s productions is positive 2,4,5,7,8 have not de novo methylation. Their PCR-based methylation assay′s productions is negative
3 讨 论
3.1 DNA甲基化与肿瘤的关系
, 百拇医药
DNA甲基化是指胞嘧啶(cytosine，C)5位碳和6位氮的腺嘌呤(adenine A)形成m5C和m6A，在哺乳动物中DNA的甲基化作用主要存在于CG之间，DNA甲基化参与维持细胞表型和遗传的稳定性，并以某种方式调节基因的转录作用[2]：基因转录作用的能力与甲基化作用水平之间存在着负相关。肿瘤组织DNA常常发生异常甲基化作用，尤其是与细胞生长分化有密切关系的癌基因和抑癌基因的甲基化改变均可引起一系列的生理和病理变化，参与肿瘤的发生发展。DNA的甲基化异常包括DNA低甲基化和高甲基化，致癌因子一方面和DNA相互作用使癌基因的甲基丢失，另一方面又可激发DNA的再甲基化作用使抑癌基因的某些5′端调控区CpG岛发生异常甲基化而导致该基因的失活[3,4]。
3.2 CDKN2基因在人BPHe中的主要失活机制
CDKN2基因是参与调节细胞周期G1/S检查点的肿瘤抑制基因，其蛋白产物p16与CDK4/6结合抑制抑癌蛋白RB的磷酸化，使细胞停滞在G1期，阻止DNA的合成。p16蛋白的失活则导致细胞无限制的生长引起肿瘤的发生。
, http://www.100md.com
本研究已检测了CDKN2基因在人BPH中的变异情况，结果发现CDKN2基因纯合性缺失是其在BPH中的主要失活机制之一。本研究进一步检测了CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化的情况，发现有42.1%的BPH存在CDKN2基因CpG岛异常甲基化，说明CDKN2基因的甲基化亦是其在BPH中的主要失活机制之一，可能导致BPH中p16蛋白表达的缺如而丧失正常的细胞增殖抑制功能，参与BPH的形成。BPH中异常甲基化的位点主要在5′端CG丰富区[5]，HpaⅡ切割的位点为CCGG，SmaⅠ切割的位点为CCCGGG，MspⅠ切割的位点为CCGG和CmCGG，实验结果表明BPH中CDKN2基因甲基化的序列主要为CmCGG和CCmCGGG。
PCR-甲基化检测法[6]的灵敏度高，但可能由于酶切不完全而引起假阳性，我们则用过量的酶量(每1 μgDNA用40 U酶)完全消化组织DNA来防止假阳性。
简言之，本研究包括：①首次检测了人BPH中CDKN2基因5'端CpG岛异常甲基化的情况；②发现42.1% (16/38) 的BPH中存在CDKN2基因异常甲基化，认为CpG岛异常甲基化是CDKN2基因在BPH中的主要失活机制；③BPH中CDKN2基因异常甲基化的序列主要为CmCGG和CCmCGGG。
, 百拇医药
基金项目：中国博士后基金资助项目(1999)
作者简介：邱启裕(1963-)，男，湖北武汉人，医学博士，副教授；主要研究男科学疾病及泌尿系肿瘤.
参考文献：
[1] Kamb A, Gruis N A,Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types [J].Science,1994,264(15)：436.
[2] Gonzalez-Zulueta M, Bender C M, Yang A S,et al. Methylation of 5' CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing [J]. Cancer Res, 1995, 55:4531.
, 百拇医药
[3] Herman J G, Merlo A, Mao L, et al. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers [J]. Cancer Res, 1995,55:4525.
[4] Costello J F, Berger M S, Huang H S, et al. Silencing of p16/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation [J]. Cancer Res, 1996,56:2405.
[5] Reed A L, Califano J, Cairns P, et al. High frequency of p16(CDKN2/MTS1/LNK4A) inactivation in head and neck squamous cell carcinoma [J]. Cancer Res, 1996,56:3630.
[6] Maesawa C, Tamura G, Nishizuka S, et al. Inactivation of the CDKN2 gene by homozygous deletion and de novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma [J]. Cancer Res, 1996, 56:3875.
收稿日期：2000-03-21, 百拇医药
单位：邱启裕 高新 梅骅(中山医科大学附属第三医院泌尿外科， 广东 广州 510630)；Lilly Zhang( 美国贝勒生殖医学研究中心,美国 德克萨斯 75246)；姚学军( 湖北医科大学病毒所, 湖北 武汉 430071)
关键词：
00zk27
摘 要：【目的】 探讨前列腺增生症(BPH)与CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化之间的关系。【方法】 用PCR-甲基化检测法检测38例BPH中CDKN2基因α、β型外显子1的甲基化情况。【结果】 38例BPH标本中16例(42.1%)有CDKN2基因CpG岛异常甲基化，甲基化序列主要为CmCGG和CCmCGGG。【结论】 CDKN2基因CpG岛异常甲基化是其在BPH中的主要失活机制，参与BPH的发生发展。
, 百拇医药
中图分类号： R697.32 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0095-03
Hypermethylation of the CDKN2 Gene in Human Benign Prostatic Hyperplasia
QIU Qi-yu， GAO Xin， MEI Hua
( Department of Urology, Third Affiliated Hospital, Sun Yet-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630, China)
Lilly ZHANG
, 百拇医药 (Baylor Center For Reproductive Health, Texas 75246, U.S.A)
YAO Xue-jun
(Department of Virology, Hubei Medical University, Wuhan 430071，China)
Abstract: 【Objective】 To study the relationship between inactivation of CDKN2 gene by de novo methylation and the pathogenesis of benign prostatic hyperplasia. 【Methods】 The methylation status of DNA were analyzed by PCR-based methylation assay in 38 BPH cases. 【Results】 de novo methylation of CDKN2 gene were detected in 16 (42.1%) of 38 patients, and the methylation sequences were CmCGG and CCmCGGG. 【Conclusion】 It is suggested that de novo methylation is one of predominant mechanisms of inactivation of the CDKN2 gene and may be associated with the pathogenesis of benign prostatic hyperplasia.
, 百拇医药
Key words: prostatic hyperplasia/genetics; CDKN2 gene; de novo methylation; inactivation
1994年Kamb和Beach的研究小组发现在9p21区域有一个等位基因丢失和另一个等位基因的突变，将此新克隆的基因称为p16基因，又称为多肿瘤抑制基因，后被人类基因组织正式命名为CDKN2 (cyclin dependent kinase inhibitor 2),该基因是直接作用于细胞增殖周期而抑制细胞生长的基因[1]。前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia, BPH)的形成与其细胞的过度增殖有关，CDKN2是直接作用于细胞增殖周期而抑制细胞生长的抑癌基因[1]，作者在研究了该基因的突变缺失与BPH之间的关系后，就CDKN2基因启动子区5′CpG岛异常甲基化与BPH的发病机制之间的关系作了进一步的研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 组织标本
38例BPH标本为1997年3月-1999年12月间湖北医科大学附属第二医院和黄石市中心医院手术切除标本，术后均经病理学检查证实为BPH。标本在切除后1 h放入液氮中保存待用。
1.2 PCR-SSCP分析
苯酚-氯仿/异戊醇法提取组织DNA，分光光密度法测量DNA的含量。扩增CDKN2基因外显子1、2，引物序列、扩增、循环条件参见有关文献[1～3]。扩增产物经甲酰胺变性后，在PAGE凝胶中电泳300 V，1.5 h,硝酸银染色，在干胶仪上干胶后保存。
1.3 PCR-甲基化检测法
为了检测BPH标本中CDKN2基因5′CpG岛甲基化的情况，先用20 U EcoRⅠ酶切(37 ℃、1.5 h)，再分别用40 U的甲基化敏感酶(HpaⅡ 37 ℃、SmaⅠ 30 ℃)、甲基化非敏感酶(MspⅠ 37 ℃)完全消化1 μg标本DNA 2 h，各取消化后的DNA 5 μL为底物，以CDKN2基因外显子1 (包括E1α和E1β)的引物作PCR扩增，扩增条件与前相同。结果在荧光下分析。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 PCR-SSCP分析
对所有PCR扩增结果阳性的标本进行单链构象多态性(SSCP)电泳分析，结果发现无一例标本出现异常泳动带，说明这些BPH标本中CDKN2基因未发现有突变和微小缺失。
2.2 CDKN2基因异常甲基化分析
用EcoRⅠ内切酶和甲基化敏感酶HpaⅡ和SmaⅠ完全消化后，在所有未甲基化的标本中可见到0.4、0.6、0.9和4.3 kb的片段，如标本的此位点已被甲基化，则只见到4.3 kb的片段。以CDKN2基因外显子1引物扩增消化后的DNA，如标本的外显子1未被甲基化，则PCR无扩增产物；如有甲基化则有PCR扩增产物。同时用EcoRⅠ内切酶和甲基化非敏感酶MspⅠ消化组织DNA作为对照，消化后作外显子1的PCR无扩增产物。
, 百拇医药
2.3 BPH组织CpG岛异常甲基化情况
检测的38例BPH标本中有16例(42.1%)表现为CDKN2基因CpG岛异常甲基化(表1)。其中外显子E1α甲基化为6例，包括HpaⅡ和SmaⅠ位点均甲基化的2例，只SmaⅠ位点甲基化的4例；外显子E1β甲基化为14例(其中4例为E1α和E1β同时甲基化)，包括HpaⅡ位点甲基化的2例和SmaⅠ位点甲基化的12例。这16例标本用甲基化敏感酶消化后作CDKN2基因外显子1的扩增均有产物；而用MspⅠ内切酶消化后作PCR均无扩增产物(图1)。
表1 38例BPH中CDKN2基因的甲基化情况
Table 1 Methylation status of CDKN2 gene in 38 BPH CDKN2 gene
Methylation (%)
, 百拇医药
Non-Methylation (%)
E1α
6(15.8)
32(84.2)
E1β
14(36.8)
24(63.2)
E1α+ E1β
4(10.5)
34(89.5)
Total
16(42.1)
, 百拇医药
22(57.9)
图1 BPH组织PCR-甲基化检测电泳
Fig.1 Results of PCR-based methylation assays in BPH tissues
M: PCR Marker; 1,3,6 have de novo methylation. Their PCR-based methylation assay′s productions is positive 2,4,5,7,8 have not de novo methylation. Their PCR-based methylation assay′s productions is negative
3 讨 论
3.1 DNA甲基化与肿瘤的关系
, 百拇医药
DNA甲基化是指胞嘧啶(cytosine，C)5位碳和6位氮的腺嘌呤(adenine A)形成m5C和m6A，在哺乳动物中DNA的甲基化作用主要存在于CG之间，DNA甲基化参与维持细胞表型和遗传的稳定性，并以某种方式调节基因的转录作用[2]：基因转录作用的能力与甲基化作用水平之间存在着负相关。肿瘤组织DNA常常发生异常甲基化作用，尤其是与细胞生长分化有密切关系的癌基因和抑癌基因的甲基化改变均可引起一系列的生理和病理变化，参与肿瘤的发生发展。DNA的甲基化异常包括DNA低甲基化和高甲基化，致癌因子一方面和DNA相互作用使癌基因的甲基丢失，另一方面又可激发DNA的再甲基化作用使抑癌基因的某些5′端调控区CpG岛发生异常甲基化而导致该基因的失活[3,4]。
3.2 CDKN2基因在人BPHe中的主要失活机制
CDKN2基因是参与调节细胞周期G1/S检查点的肿瘤抑制基因，其蛋白产物p16与CDK4/6结合抑制抑癌蛋白RB的磷酸化，使细胞停滞在G1期，阻止DNA的合成。p16蛋白的失活则导致细胞无限制的生长引起肿瘤的发生。
, http://www.100md.com
本研究已检测了CDKN2基因在人BPH中的变异情况，结果发现CDKN2基因纯合性缺失是其在BPH中的主要失活机制之一。本研究进一步检测了CDKN2基因5′端CpG岛异常甲基化的情况，发现有42.1%的BPH存在CDKN2基因CpG岛异常甲基化，说明CDKN2基因的甲基化亦是其在BPH中的主要失活机制之一，可能导致BPH中p16蛋白表达的缺如而丧失正常的细胞增殖抑制功能，参与BPH的形成。BPH中异常甲基化的位点主要在5′端CG丰富区[5]，HpaⅡ切割的位点为CCGG，SmaⅠ切割的位点为CCCGGG，MspⅠ切割的位点为CCGG和CmCGG，实验结果表明BPH中CDKN2基因甲基化的序列主要为CmCGG和CCmCGGG。
PCR-甲基化检测法[6]的灵敏度高，但可能由于酶切不完全而引起假阳性，我们则用过量的酶量(每1 μgDNA用40 U酶)完全消化组织DNA来防止假阳性。
简言之，本研究包括：①首次检测了人BPH中CDKN2基因5'端CpG岛异常甲基化的情况；②发现42.1% (16/38) 的BPH中存在CDKN2基因异常甲基化，认为CpG岛异常甲基化是CDKN2基因在BPH中的主要失活机制；③BPH中CDKN2基因异常甲基化的序列主要为CmCGG和CCmCGGG。
, 百拇医药
基金项目：中国博士后基金资助项目(1999)
作者简介：邱启裕(1963-)，男，湖北武汉人，医学博士，副教授；主要研究男科学疾病及泌尿系肿瘤.
参考文献：
[1] Kamb A, Gruis N A,Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types [J].Science,1994,264(15)：436.
[2] Gonzalez-Zulueta M, Bender C M, Yang A S,et al. Methylation of 5' CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing [J]. Cancer Res, 1995, 55:4531.
, 百拇医药
[3] Herman J G, Merlo A, Mao L, et al. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers [J]. Cancer Res, 1995,55:4525.
[4] Costello J F, Berger M S, Huang H S, et al. Silencing of p16/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation [J]. Cancer Res, 1996,56:2405.
[5] Reed A L, Califano J, Cairns P, et al. High frequency of p16(CDKN2/MTS1/LNK4A) inactivation in head and neck squamous cell carcinoma [J]. Cancer Res, 1996,56:3630.
[6] Maesawa C, Tamura G, Nishizuka S, et al. Inactivation of the CDKN2 gene by homozygous deletion and de novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma [J]. Cancer Res, 1996, 56:3875.
收稿日期：2000-03-21, 百拇医药