疱疹病毒的胸苷激酶肿瘤基因治疗
作者：吴砂 朱平 刘志权 黄益玲 张昌菊 韩莉 刘朝奇
单位：吴砂(湖北三峡学院医学院临床医学系96级03班 宜昌 443003)；朱平(临床医学系96级01班)；刘志权(临床医学系96级02班)；黄益玲(湖北三峡学院医学院临床医学系96级03班 宜昌 443003)；张昌菊 韩莉 刘朝奇(免疫学教研室)
关键词：
实用医学进修杂志00zj10
1986年Meolten[1]首次报道，应用I型单纯疱疹病毒-胸苷激酶(Herpes simplex virus-thymidine kinase, HSV-TK)转移到肿瘤细胞，可以提高对肿瘤细胞的杀伤敏感性，称其为药物敏感基因(drug sensitive gene)或自杀基因(Suicide gene)。在疱疹类病毒,细菌及哺乳动物细胞中，都存在TK基因，利用基因工程技术,可将此类基因分离并用于肿瘤治疗。
, 百拇医药
1 TK基因的基本结构
在HSV病毒感染哺乳动物后，有3组病毒基因顺次表达，此3组基因根据先后顺序分类为α、β、γ基因，α基因的表达可诱导β基因的表达，β基因的表达表明病毒DNA正进行合成复制。DNA复制完成后，γ基因才开始表达。HSV-TK被分类为β基因，1980年首次报道了较为完整的HSV-TK基因序列，包括5‘端调控区和3’端非编码区，编码mRNA的基因全长1.3KB。全基因内无内含子，HSV-TK基因的启动子活动需要反式激活，早期调节蛋白ICP4可以同TK上游-254到-221，-385到-254，以及-480到-385(以转录起点为参照)的5‘非转录区结合，形成蛋白-DNA复合物，基因的特异性表达与调节蛋白密切相关[2]
2 治疗肿瘤的机理
胸苷激酶(thymidine kenase ,TK)基因具有催化脱氧胸苷(thymidine,TdR)磷酸化变成一磷酸脱氧胸苷的作用。广泛存在于不同的细胞和病毒中的TK基因,其结构及其蛋白产物的分子量大小、理化性质和生化功能均不同。哺乳动物细胞的TK催化反应特异性强，主要催化TdR磷酸化为一磷酸脱氧胸苷。疱疹类病毒的TK除了催化TdR磷酸化为一磷酸脱氧胸苷外，还可催化一些核苷酸类似物如：无环鸟苷(ACV)和丙氧鸟苷(GCV)等磷酸化。来自于病毒的TK具有催化脱氧胸苷及其类似物(如araAMP及GCV等)的磷酸化,产生细胞毒性代谢产物，从而具有杀伤肿瘤的作用。
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2.1 嘌呤核苷酸类似物
包括ACV、GCV、BCV、6-甲氧基嘌呤阿拉伯核苷(6-methoxy purine arubino nucleoside araM)、阿糖胞苷(thmine arabinoside, araT)等,一般HSV-TK同GCV或ACV联用，VZV-TK同araM或ara-T联用。
2.2 嘧啶核苷类似物
包括BVDM、BVDC、IVDU、IADU等。它们的转变同嘌呤核苷类似物相似，但效果可能更好[3]
2.3 旁观者效应(bystand effect)
Freeman[4]在转导HSV-TK基因的结肠癌细胞系观察到混合细胞中TK+占10%时，可对周围的TK-细胞具有杀伤作用,即旁观者效应。体内实验中1∶1TK+∶TK-细胞混合时几乎所有的肿瘤细胞(14/15)消退.目前主要有以下解释:①凋亡小体介导细胞凋亡,TK基因转导前药攻击引起细胞凋亡,形成的凋亡小体被周围邻近细胞吞噬，使得后者也有TK及TK代谢物，而导致死亡；②裂口连接实现毒性物质交流。裂口连接是细胞间通信的特性。细胞质的离子或分子(包括第二信使和代谢产物)只要分子量小于1000道尔顿或直径小于1.5nm就可自由快速地进出相互接触的细胞。，核苷类似物如GCV磷酸化后其分子量在300～450道尔顿，可通过连接裂口传导入相邻细胞，导致相邻细胞死亡[5]；③免疫系统的作用。自杀基因治疗后,肿瘤组织局部表达多种炎症细胞的mRNA及肿瘤消退的小鼠体内诱出更强的特异性的CTL等,这为通过增加免疫反应以进一步提高自杀基因治疗效果的研究提供新的思路；④血管内皮细胞的转染，肿瘤内血管生成因子的分泌，可介导内皮细胞的有丝分裂和局部血管迅速形成，以逆转录病毒为载体的HSV-TK基因转移可使肿瘤血管内皮转染；⑤Shigcki[6]用TK+和TK-的肝癌细胞混合进行对比实验,发现肝癌细胞的裂解产物没有细胞毒性作用,表明死亡细胞内不存在非特异性的毒性物质。表明在细胞彼此不接触的情况下,主要是由于GCV的环磷酸化产物可以通过细胞膜而使周围细胞死亡,催化此反应的酶可能是将鸟苷酸环化为3',5'-环磷鸟苷酸的鸟苷酸磷酸化酶。
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3 TK基因包装载体
逆转录病毒常作为载体来完成目的基因的转录表达,主要来源于MOLOEY小鼠白血病病毒。使用的逆转录病毒载体经过重组，尽量消除了产生感染性病毒的可能性，而且后续的药物治疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀灭生产逆转录病毒的包装细胞，保证了本疗法的安全性。它的优点是其质粒在真核表达细胞中具有整合到靶细胞基因组中，可随细胞的DNA复制而持续存在于子细胞中，可稳定地近100%感染分裂中的靶细胞，不整合到非分裂的细胞基因组中。逆转录病毒载体携带的外源目的基因容量大等。这些特点在肿瘤基因治疗中具有特别的优越性。常将肿瘤组织细胞特异的转录调节序列(TRS)连接到TK基因上游，构成嵌合基因,TRS促使基因的表达依赖于肿瘤组织某种蛋白质的诱导，从而使之在肿瘤细胞中特异地转录表达，并使药物前体代谢为细胞毒性产物，有选择地杀伤肿瘤细胞。这样便使目的基因定向转移入所有肿瘤细胞。
4 TK基因的临床应用
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4.1 颅脑肿瘤
由于的血脑屏障及特殊的解剖结构，脑瘤的治疗十分困难，但TK基因在脑瘤治疗中显示出其有效性与安全性。逆转录病毒处于增殖状态中整合与表达，脑部肿瘤有丝分裂最活跃，供应肿瘤的内皮细胞新生成，而正常脑细胞相当稳定，使GCV治疗具有很高的特异性杀伤作用，药物对肿瘤血管的毒性作用，也能促进肿瘤的缺血和坏死，另外，大脑具有一定的免疫特权，可在一定程度上允许外源性的逆转录病毒细胞存活较长时间，提高对肿瘤的转导。在国内也用不同的方法在研究HSV-TK对脑瘤的治疗效果[7，8]。因此，1992年美国FDA批准TK基因应用于临床，治疗10例患者，6例存活，相继又批准了几家实验室开展肿瘤TK基因治疗。
4.2 肝癌
Huber等[2]首先应用AFP/VZV-TK嵌合基因联合araM杀伤人类肝癌细胞，IDO将人AFP/HSV-TK基因转导人类AFP分泌型肝癌细胞系，使肝癌细胞在增加AFP分泌同时被GCV杀伤。国内戎煜等[9]利用DNA重组技术将HSV-TK基因至逆转录病毒载体(XM-6/TK)，经PA317细胞包装，转染人肝癌细胞HepG2，转染细胞生长受到严重抑制，细胞数量明显降低。这些都表明HSV-TK在肝癌治疗有很大的潜力。
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4.3 肺癌
研究发现人肺腺癌细胞株A549经HSV-TK转染后，对ACV，GCV及BVDU都较为敏感，不同浓度的GCV作用72小时后有感染的A549/TK存活率比野生型A549用的细胞明显提高，这些结论显示了HSV-TK/GCV系统潜在的临床应用价值[10]。
4.4 其他肿瘤
有人构建了一嵌合基因，将HSV-TK基因置于CEA启动增强子控制下，用腺病毒作载体来转染胃癌细胞MKN、MKN和不分泌CEA的MKN胃癌细胞和一人子宫颈癌细胞H，它们分别感染腺病毒，结果GCV的I分别为21、5.8、320、7400。由此可知细胞特异性对CEA调控的TK基因表达和GCV治疗有非常显著性差别[11]。GCV对胰腺癌细胞也有杀伤作用，0.01～100GCV对转染TK的胰腺癌细胞作用48小时后,其杀伤作用最强[12]。徐人尔等[13]利用HSV-TK的复制型重组腺病毒AD(HSV-TK)结合C57BL/6小鼠B16黑色素瘤的离体及动物实验，导入了HSV-TK基因的B16细胞对GCV杀伤作用十分明显，且旁观者效应也颇为显著，使黑色素瘤扩散受到了明显抑制。
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5 展望
HSV-TK基因转移联合GCV的方法已成为肿瘤基因治疗的重要策略之一。1995年2月,美国NIH已通过了5项用HSV-TK基因/GCV治疗恶性肿瘤的临床方案.其中针对卵巢癌的1项,针对脑肿瘤的4项,还有2项待批准,使用后部分患者效果良好。
尽管在用HSV-TK/GCV治疗肿瘤的应用中有一定困难，但它却不失为一种巧妙合理而可行的方法，与常规的治疗方法相比，无疑更为优秀，有极为广泛的前景。
参考文献
1，Moolten FL. Tumor chemosensitivty conferred by inserted HSV-TK; Paradigm for a prospective cancer control strategy[J]. Cancer Res,1986;46:5276
, 百拇医药
2，Huber BE , Richards CA, Krentsky TA, et al. Retroviralmediated gene therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma: an innovative approach for cancer therapy[J]. Proc Nat Acad Sci USA,1991;88:8039
3，高军,曹广文，等.TK基因及其在肿瘤治疗中的应用[J].国外医学*免疫学分册，1996;19(4):183
4，Freeman SM et al. The effect tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified[J]. Cancer Res,1993;53(21):5274
, 百拇医药
5，James F,Fred G，Barker， et al. The extent of heterocellular communiation mediated by gap junction is prodictive of bystander tumor cytotoxicity in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:11071
6，Shigeki K,Toshiya N ,Kazuhiro M ,et al.Bystander effect caused suicide gene expression indications the feasibility of gene therapy for hepatocellular arinoma[J].Hepatology,1995；22:1838
7，杨学军,浦佩玉,江华为，等.恶性胶质瘤自杀基因治疗中逆转录病毒载体的构建[J].神经生化学通讯，1998；11(1)：3
, http://www.100md.com
8，胡锦,国桢,卢大儒，等.反转录病毒介导的HSV-TK基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究[J].中华神经外科杂志，1998：14(5)：288
9，戎煜，安威.利用HSV-TK基因治疗肝癌的离体研究[J].中国应用生理学杂志，1998；14(3)：268
10，沙慧芳，王恩忠,李国华，等.单纯疱疹病毒胸苷激酶在肺癌基因治疗实验中的初步探讨[J].中华结核和呼吸杂志，1998；21(5)：265
11，何祥梁.消化系统肿瘤TK基因治疗的研究现状[J].实用癌症杂志，1999；14(1)：76
12，陈世状，计磊，许涛，等.丙氧鸟苷对TK基因转染阳性胰腺癌细胞的体外杀伤作用[J].前卫医药杂志，1999；16(1)：2
13，徐人尔，应蓓蓓，赵寿元，李昌本，等，HSV-TK基因的重组腺病毒基因治疗小鼠B16黑色素瘤的实验研究[J].实验生物学报，1997；30(3)：261, http://www.100md.com
单位：吴砂(湖北三峡学院医学院临床医学系96级03班 宜昌 443003)；朱平(临床医学系96级01班)；刘志权(临床医学系96级02班)；黄益玲(湖北三峡学院医学院临床医学系96级03班 宜昌 443003)；张昌菊 韩莉 刘朝奇(免疫学教研室)
关键词：
实用医学进修杂志00zj10
1986年Meolten[1]首次报道，应用I型单纯疱疹病毒-胸苷激酶(Herpes simplex virus-thymidine kinase, HSV-TK)转移到肿瘤细胞，可以提高对肿瘤细胞的杀伤敏感性，称其为药物敏感基因(drug sensitive gene)或自杀基因(Suicide gene)。在疱疹类病毒,细菌及哺乳动物细胞中，都存在TK基因，利用基因工程技术,可将此类基因分离并用于肿瘤治疗。
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1 TK基因的基本结构
在HSV病毒感染哺乳动物后，有3组病毒基因顺次表达，此3组基因根据先后顺序分类为α、β、γ基因，α基因的表达可诱导β基因的表达，β基因的表达表明病毒DNA正进行合成复制。DNA复制完成后，γ基因才开始表达。HSV-TK被分类为β基因，1980年首次报道了较为完整的HSV-TK基因序列，包括5‘端调控区和3’端非编码区，编码mRNA的基因全长1.3KB。全基因内无内含子，HSV-TK基因的启动子活动需要反式激活，早期调节蛋白ICP4可以同TK上游-254到-221，-385到-254，以及-480到-385(以转录起点为参照)的5‘非转录区结合，形成蛋白-DNA复合物，基因的特异性表达与调节蛋白密切相关[2]
2 治疗肿瘤的机理
胸苷激酶(thymidine kenase ,TK)基因具有催化脱氧胸苷(thymidine,TdR)磷酸化变成一磷酸脱氧胸苷的作用。广泛存在于不同的细胞和病毒中的TK基因,其结构及其蛋白产物的分子量大小、理化性质和生化功能均不同。哺乳动物细胞的TK催化反应特异性强，主要催化TdR磷酸化为一磷酸脱氧胸苷。疱疹类病毒的TK除了催化TdR磷酸化为一磷酸脱氧胸苷外，还可催化一些核苷酸类似物如：无环鸟苷(ACV)和丙氧鸟苷(GCV)等磷酸化。来自于病毒的TK具有催化脱氧胸苷及其类似物(如araAMP及GCV等)的磷酸化,产生细胞毒性代谢产物，从而具有杀伤肿瘤的作用。
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2.1 嘌呤核苷酸类似物
包括ACV、GCV、BCV、6-甲氧基嘌呤阿拉伯核苷(6-methoxy purine arubino nucleoside araM)、阿糖胞苷(thmine arabinoside, araT)等,一般HSV-TK同GCV或ACV联用，VZV-TK同araM或ara-T联用。
2.2 嘧啶核苷类似物
包括BVDM、BVDC、IVDU、IADU等。它们的转变同嘌呤核苷类似物相似，但效果可能更好[3]
2.3 旁观者效应(bystand effect)
Freeman[4]在转导HSV-TK基因的结肠癌细胞系观察到混合细胞中TK+占10%时，可对周围的TK-细胞具有杀伤作用,即旁观者效应。体内实验中1∶1TK+∶TK-细胞混合时几乎所有的肿瘤细胞(14/15)消退.目前主要有以下解释:①凋亡小体介导细胞凋亡,TK基因转导前药攻击引起细胞凋亡,形成的凋亡小体被周围邻近细胞吞噬，使得后者也有TK及TK代谢物，而导致死亡；②裂口连接实现毒性物质交流。裂口连接是细胞间通信的特性。细胞质的离子或分子(包括第二信使和代谢产物)只要分子量小于1000道尔顿或直径小于1.5nm就可自由快速地进出相互接触的细胞。，核苷类似物如GCV磷酸化后其分子量在300～450道尔顿，可通过连接裂口传导入相邻细胞，导致相邻细胞死亡[5]；③免疫系统的作用。自杀基因治疗后,肿瘤组织局部表达多种炎症细胞的mRNA及肿瘤消退的小鼠体内诱出更强的特异性的CTL等,这为通过增加免疫反应以进一步提高自杀基因治疗效果的研究提供新的思路；④血管内皮细胞的转染，肿瘤内血管生成因子的分泌，可介导内皮细胞的有丝分裂和局部血管迅速形成，以逆转录病毒为载体的HSV-TK基因转移可使肿瘤血管内皮转染；⑤Shigcki[6]用TK+和TK-的肝癌细胞混合进行对比实验,发现肝癌细胞的裂解产物没有细胞毒性作用,表明死亡细胞内不存在非特异性的毒性物质。表明在细胞彼此不接触的情况下,主要是由于GCV的环磷酸化产物可以通过细胞膜而使周围细胞死亡,催化此反应的酶可能是将鸟苷酸环化为3',5'-环磷鸟苷酸的鸟苷酸磷酸化酶。
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3 TK基因包装载体
逆转录病毒常作为载体来完成目的基因的转录表达,主要来源于MOLOEY小鼠白血病病毒。使用的逆转录病毒载体经过重组，尽量消除了产生感染性病毒的可能性，而且后续的药物治疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀灭生产逆转录病毒的包装细胞，保证了本疗法的安全性。它的优点是其质粒在真核表达细胞中具有整合到靶细胞基因组中，可随细胞的DNA复制而持续存在于子细胞中，可稳定地近100%感染分裂中的靶细胞，不整合到非分裂的细胞基因组中。逆转录病毒载体携带的外源目的基因容量大等。这些特点在肿瘤基因治疗中具有特别的优越性。常将肿瘤组织细胞特异的转录调节序列(TRS)连接到TK基因上游，构成嵌合基因,TRS促使基因的表达依赖于肿瘤组织某种蛋白质的诱导，从而使之在肿瘤细胞中特异地转录表达，并使药物前体代谢为细胞毒性产物，有选择地杀伤肿瘤细胞。这样便使目的基因定向转移入所有肿瘤细胞。
4 TK基因的临床应用
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4.1 颅脑肿瘤
由于的血脑屏障及特殊的解剖结构，脑瘤的治疗十分困难，但TK基因在脑瘤治疗中显示出其有效性与安全性。逆转录病毒处于增殖状态中整合与表达，脑部肿瘤有丝分裂最活跃，供应肿瘤的内皮细胞新生成，而正常脑细胞相当稳定，使GCV治疗具有很高的特异性杀伤作用，药物对肿瘤血管的毒性作用，也能促进肿瘤的缺血和坏死，另外，大脑具有一定的免疫特权，可在一定程度上允许外源性的逆转录病毒细胞存活较长时间，提高对肿瘤的转导。在国内也用不同的方法在研究HSV-TK对脑瘤的治疗效果[7，8]。因此，1992年美国FDA批准TK基因应用于临床，治疗10例患者，6例存活，相继又批准了几家实验室开展肿瘤TK基因治疗。
4.2 肝癌
Huber等[2]首先应用AFP/VZV-TK嵌合基因联合araM杀伤人类肝癌细胞，IDO将人AFP/HSV-TK基因转导人类AFP分泌型肝癌细胞系，使肝癌细胞在增加AFP分泌同时被GCV杀伤。国内戎煜等[9]利用DNA重组技术将HSV-TK基因至逆转录病毒载体(XM-6/TK)，经PA317细胞包装，转染人肝癌细胞HepG2，转染细胞生长受到严重抑制，细胞数量明显降低。这些都表明HSV-TK在肝癌治疗有很大的潜力。
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4.3 肺癌
研究发现人肺腺癌细胞株A549经HSV-TK转染后，对ACV，GCV及BVDU都较为敏感，不同浓度的GCV作用72小时后有感染的A549/TK存活率比野生型A549用的细胞明显提高，这些结论显示了HSV-TK/GCV系统潜在的临床应用价值[10]。
4.4 其他肿瘤
有人构建了一嵌合基因，将HSV-TK基因置于CEA启动增强子控制下，用腺病毒作载体来转染胃癌细胞MKN、MKN和不分泌CEA的MKN胃癌细胞和一人子宫颈癌细胞H，它们分别感染腺病毒，结果GCV的I分别为21、5.8、320、7400。由此可知细胞特异性对CEA调控的TK基因表达和GCV治疗有非常显著性差别[11]。GCV对胰腺癌细胞也有杀伤作用，0.01～100GCV对转染TK的胰腺癌细胞作用48小时后,其杀伤作用最强[12]。徐人尔等[13]利用HSV-TK的复制型重组腺病毒AD(HSV-TK)结合C57BL/6小鼠B16黑色素瘤的离体及动物实验，导入了HSV-TK基因的B16细胞对GCV杀伤作用十分明显，且旁观者效应也颇为显著，使黑色素瘤扩散受到了明显抑制。
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5 展望
HSV-TK基因转移联合GCV的方法已成为肿瘤基因治疗的重要策略之一。1995年2月,美国NIH已通过了5项用HSV-TK基因/GCV治疗恶性肿瘤的临床方案.其中针对卵巢癌的1项,针对脑肿瘤的4项,还有2项待批准,使用后部分患者效果良好。
尽管在用HSV-TK/GCV治疗肿瘤的应用中有一定困难，但它却不失为一种巧妙合理而可行的方法，与常规的治疗方法相比，无疑更为优秀，有极为广泛的前景。
参考文献
1，Moolten FL. Tumor chemosensitivty conferred by inserted HSV-TK; Paradigm for a prospective cancer control strategy[J]. Cancer Res,1986;46:5276
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2，Huber BE , Richards CA, Krentsky TA, et al. Retroviralmediated gene therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma: an innovative approach for cancer therapy[J]. Proc Nat Acad Sci USA,1991;88:8039
3，高军,曹广文，等.TK基因及其在肿瘤治疗中的应用[J].国外医学*免疫学分册，1996;19(4):183
4，Freeman SM et al. The effect tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified[J]. Cancer Res,1993;53(21):5274
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5，James F,Fred G，Barker， et al. The extent of heterocellular communiation mediated by gap junction is prodictive of bystander tumor cytotoxicity in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1995;92:11071
6，Shigeki K,Toshiya N ,Kazuhiro M ,et al.Bystander effect caused suicide gene expression indications the feasibility of gene therapy for hepatocellular arinoma[J].Hepatology,1995；22:1838
7，杨学军,浦佩玉,江华为，等.恶性胶质瘤自杀基因治疗中逆转录病毒载体的构建[J].神经生化学通讯，1998；11(1)：3
, http://www.100md.com
8，胡锦,国桢,卢大儒，等.反转录病毒介导的HSV-TK基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究[J].中华神经外科杂志，1998：14(5)：288
9，戎煜，安威.利用HSV-TK基因治疗肝癌的离体研究[J].中国应用生理学杂志，1998；14(3)：268
10，沙慧芳，王恩忠,李国华，等.单纯疱疹病毒胸苷激酶在肺癌基因治疗实验中的初步探讨[J].中华结核和呼吸杂志，1998；21(5)：265
11，何祥梁.消化系统肿瘤TK基因治疗的研究现状[J].实用癌症杂志，1999；14(1)：76
12，陈世状，计磊，许涛，等.丙氧鸟苷对TK基因转染阳性胰腺癌细胞的体外杀伤作用[J].前卫医药杂志，1999；16(1)：2
13，徐人尔，应蓓蓓，赵寿元，李昌本，等，HSV-TK基因的重组腺病毒基因治疗小鼠B16黑色素瘤的实验研究[J].实验生物学报，1997；30(3)：261, http://www.100md.com