8例B细胞淋巴瘤的T细胞基因CD4 V4突变及其相关蛋白的表达
作者：苏祖兰 金亦 张子康 邵春奎 吴秋良 赵美卿 冯志英 侯景辉
单位：苏祖兰 金亦(中山医科大学附属第三医院病理科, 广东 广州 510630)；张子康 邵春奎 吴秋良 赵美卿 冯志英 侯景辉(中山医科大学附属第三医院核医学科, 广东 广州 510630)
关键词：抗原；CD4；遗传学；突变；FasL蛋白；原癌基因蛋白质c-bcl-2；细胞周期蛋白D1；淋巴瘤；B细胞
00zk28
摘 要：【目的】 检测B细胞淋巴瘤组织中T细胞的CD4 V4基因突变情况及其相应病例的Fas/FasL、CD4、bcl-2和Cyclin D1蛋白表达特征。【方法】 PCR-SSCP技术筛选检测56例B细胞淋巴瘤CD4分子的V4外显子突变状况。用免疫组化方法检测有突变的B细胞淋巴瘤组织中L26，UCHL1，CD3，Fas，FasL，bcl-2和Cyclin D1蛋白表达情况。【结果】 8例/56例(14.2%)T细胞CD4 V4外显子有变异。其中小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocyte lymphoma,SLL)和淋巴母细胞性淋巴瘤(lymphoblastic lymphoma,LBL)的Fas，FasL和CD4蛋白均为弱或无表达；滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma,FL)3项均强表达；3例弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBL)和1例套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)Fas和FasL强表达，CD4无或弱表达。Fas和FasL双强表达的4例,均有bcl-2和/或Cyclin D1过表达。【结论】 B细胞淋巴瘤中CD4 V4基因有突变，并提示这种突变与细胞死亡和细胞周期调控异常有关。
, 百拇医药
中图分类号： R730.23 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0098-04
CD4 V4 Mutation of T Cells and Its Ralative Protein Expression
in 8 Cases of B Cell lymphoma
SU Zu-lan, JIN Yi, SHAO Chun-kui, FENG Zhi-ying
( Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630, China)
, 百拇医药
ZHANG Zi-kang
(Affiliated Tomor Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, China)
WU Qiu-liang, ZHAO Mei-qing,HOU Jing-hui
Abstract: 【Objective】 Detection of mutation in CD4 V4 exon and expression of proteins associated with Fas, FasL, bcl-2,CD4 and CyclinD1 in B cell lymphoma. 【Methods】 The exon V4 mutation of CD4 gene was examined on 56 cases of B cell lymphoma specimens by means of PCR-SSCP and the expression of proteins of CD3,CD4, Fas, FasL, bcl-2 and Cyclin D1 by immunohistochemistry. 【Results】 The V4 mutaion rate of CD4 gene was 14.2% (8/56). Among them, CD4, Fas, FasL expressed weak or none in both SLL and LBL; on the contrary, FL was strong; 3/4 cases of DLBL and 1 case MCL expressed both Fas and FasL strong, but CD4 not expressed. Occasionally, they express bcl-2 and /or Cyclin D1 strong too. 【Conclusion】 There are CD4 V4 mutaion in B cell lymphoma and abnormal regulators of cell cycle and death.
, 百拇医药
Key words: antigen, CD4/genetics; mutation; FasL protein; proto-oncogene proteins c-bcl-2; cyclin D1; lymphoma, B-cell
B细胞淋巴瘤是恶性淋巴瘤中最常见的类型, 其发病机理仍未阐明。Lukes等认为本病发生与B淋巴细胞的正常分化或转化途径受阻有关。鉴于T细胞对B细胞的分化和转化调节作用十分重要，有必要弄清楚B细胞淋巴瘤中的T细胞状况。大量研究已经表明在B细胞淋巴瘤组织中,T细胞数量、表型和亚群比例乃至功能均有明显异常[3～6]。也有个别作者注意到CD4分子HIV受体CCR5-delta32缺失可使患AIDS相关淋巴瘤的危险性降低3倍。但是迄今尚未查见B细胞淋巴瘤中T细胞CD4分子本身基因V4外显子突变的报道。我们采用PCR-SSCP方法，检测56例B细胞淋巴瘤石蜡包埋组织标本中CD4的V4外显子的基因突变情况,并且了解与细胞周期调控和死亡有关的蛋白表达特征。为探讨CD4 V4基因变化在B细胞淋巴瘤发病过程中的意义提供实验依据。
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1 材料和方法
1.1 材 料
中山医科大学附属三院和附属肿瘤医院1995～1999年活检切除的未经治疗的淋巴瘤石蜡包埋活检组织标本70例,采用WHO97分类标准,根据形态和免疫组化标记结合临床表现重新诊断分类，得到56例B细胞淋巴瘤。对该56例B细胞淋巴瘤用PCR-SSCP检测CD4 V4突变，有突变的病例再增加作部分免疫标记作为分析对象。另设20例良性淋巴组织作对照。
1.2 PCR-SSCP
1.2.1 DNA制备 按说明书进行。每例石蜡包埋标本切片5 μ厚，共5张，常规烤片脱蜡，自然干燥。另将组织刮入1.5 mL塑料离心管中，加入70 μL消化液(含10 mmol/L Tris-HC，pH8.0，1 mml/L EDTA，10 ml/L 吐温-20，150 mg/L Proteinase K, PK)，37 ℃过夜。煮沸10 min灭活PK。高速离心后取上清作为DNA模板，置-20 ℃备用。
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1.2.2 PCR 根据文献[6]选择V4引物序列,由上海生物工程公司合成。序列如下：正义链5′-GCC ACT CAG CTC CAG AAA-3′，反义链5′-CTT GAT GTT GGA TTC CAG-3′反应体系(每个反应管总反应体系为25 μL)：ddH2O，10×buffer，10 mmoL/L dNTPs，引物1，引物2，DNA模板，Tag酶。扩增条件： 94 ℃ 5 min，温度降至80 ℃，加酶7 min之后，94 ℃变性1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min共35个循环。最后72 ℃延伸10 min。取样品1 μL加5 μL扩增产物混匀，于15 mg/L琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，在紫外分析仪上观察，若在201 bp处出现橙黄色条带，可用于SSCP分析。
1.2.3 SSCP分析 PCR扩增产物加入变性剂充分混匀，瞬间离心，沸水浴10 min，立即冰浴，5 min后在80 mg/L聚丙烯酰胺凝胶上电泳，100 V，快速上样，400 V 10 min后，110 V电泳20 h。100 mL/L乙醇和11.3 mL/L硝酸短暂浸泡电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，再12 mmoL/L硝酸银浸泡20 min，振摇至现出条带,100 mL/L醋酸浸泡2 min终止反应。结果判断：可见棕黄色的电泳条带。B细胞淋巴瘤的标本与良性相比，出现条带增多、减少或位置改变，即为基因突变证据。
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每次电泳均设正常淋巴组织对照。共作了20例良性对照。
1.3 免疫组化
对T细胞的CD4 V4外显子有变异的B细胞淋巴瘤的8例标本增加作Fas，FasL，CD4，bcl-2和CyclinD1等标记检测。均用鼠抗人单克隆抗体(DAKO或迈新公司)，采用SLAB法，按说明书进行。微波法或高压法修复抗原。DAB显色，苏木素复染。结果判断：按病理常规通用标准采用半定量记数，按阳性细胞占切片中肿瘤组织内总细胞数的比例分为4级，即<25%：-，25%～50%：+，50%～75%：++，>75%：+++，其中FasL和bcl-2为核和浆阳性，UCHL1，CD3，CD4，L26均为膜阳性。每次染色用良性淋巴组织(或扁桃体)作对照,并另设PBS代替第一抗体作为阴性对照。
2 结 果
56例B细胞淋巴瘤中CD4 V4外显子有基因变异病例8例，其中突变6例，缺失2例。突变电泳条带见图1，见第3，4泳带箭头处出现泳带增多现象。
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这8例的临床和病理特点：男5例，女3例; 6例为56～68岁的中老年人，1例2岁，1例5.5岁。肿瘤累及部位广泛，2例为肠道，1例鼻咽部，其余为颌下、腹股沟、锁骨上等处淋巴结肿大。2例为复发。组织学代表性图象见图2。
由表1可见，各1例SLL和LBL的Fas，FasL和CD4均为弱或无表达，1例FL上述3项均强表达；Fas,FasL双强表达的4例均有bcl-2和/或Cyclin D1强表达，其中3例为DLBL，1例为MCL。v
图1 PCR-SSCP的某一次电泳条带照片。
Fig.1 PCR-SSCP, one of series times of electrophoresis
1: Benigh lymphoid tissue (as a control); 3: 5 in table 1,follicular cell lymphoma grade Ⅱ (FL-II); or : mutation line; 4: 6 in table 1, defuse large b cell lymphoma (DLBL); 2,5,6: No any more mutaion in this time of electoporesis
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图2 例5有CD4V4基因突变的滤泡性B细胞淋巴瘤的
病理组织形态和免疫组化
Fig.2 Case 5 morphological change and immunological
marker of follicular B cell lymphoma with
mutation of CD4 V4 exon
A: HE, 40×10; B: L26(CD20)positive cells (FL), SLAB, 40×10
表1 8例B细胞淋巴瘤免疫标记特征
Table 1 Immunological Markers of 8 cases B cell lymphoma Case
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Sex
Age(yr)
Subtype
L26
UCHL-1
CD3
CD4
Fas
FasL
bcl-2
CyclinD1
1
F
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56
SLL
+ + +
-/+
-/+
-
+/-
-
+/-
-
2
F
66
DLBL
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+ + +
-/+
-/+
-
+ + +
+ + +
+ +
-
3
F
2
MCL
+ + +
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-
-/+ +
-/+
+ + +
+ + +
+ +
+ + +
4
M
59
DLBL
+ + +
-/+
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-/+ +
-/+
+ + +
+
+/-
+/-
5
M
69
FL-II
+ + +
-
-/+ +
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-/+ +
+ +
+ + +
+ +
-
6
M
62
DLBL
+ + +
-/+ +
-/+ +
-/+
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+ +
+
-/+
+/-
7
M
68
DLBL
+ + +
-/+ +
-/+ +
-
+ +
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+ + +
+ + +
+ + +
8
M
5
LBL
+ + +
-/+
-/+
-/+
-
+/-
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-
-
Note: F:female; M: male; -/+ +：tumor cells/ reactive cells, if no “/” means tumor cells condition; SLL：small lymphocyte lymphoma; MCL：mantle cell lymphoma; DLBL：defuse large B cell lymphoma; FL-II: follicular cell lymphoma grade II; LBL：lymphoblastic lymphoma3 讨 论
T细胞在免疫反应中总是处于核心地位，而在其中发挥更大作用的Th1和Th2细胞均属于CD4阳性细胞,我们认为,在B细胞淋巴瘤这种免疫系统的恶性肿瘤,也应该遵循这个原则。我们早期的研究和其它很多文献已经报道B细胞淋巴瘤中的T细胞有亚型和数量异常，主要表现为CD4减少，CD8增多或不变，CD4/CD8比值下降[2、3]。后来的研究发现B细胞淋巴瘤中的T细胞有明显功能异常,如1993年Ohnish用加入抗T细胞单克隆抗体方法,使原有B细胞淋巴瘤进入冬眠状态[4],而1995年Herbert则用动物实验发现,CD4细胞可使B细胞瘤演变为B细胞转化的终末状态浆细胞瘤[5]，从而说明CD4细胞不仅在B细胞转化过程中，而且在B细胞淋巴瘤的形成中均具有重要作用。与此同时，对CD4细胞基因变异及其在B细胞淋巴瘤发生发展中的可能意义应该引起足够重视[8]。一个有代表性的实例是AIDS患者最常伴发的恶性肿瘤，除了Kaposi′s肉瘤，就是B细胞淋巴瘤，而AIDS患者的CD4细胞被杀灭减少或称凋亡增多是重要特征，这之间的功能联系十分值得重视。新近有研究发现，人为改变CD4分子上的HIV受体基因CCR5-delta32结构，可以使HIV相关B细胞淋巴瘤的感染危险性减少达3倍之多[9]。CD4是55 000 ku的蛋白分子，存在于MHC限制的II类分子的辅助/诱导T细胞上，属于Ig超家族成员，它也是HIV结合受体，通过感染CD4细胞，机体疾患AIDS。
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基于上述考虑，本文侧重对B细胞淋巴瘤的反应性CD4 T细胞的结构基因V4外显子进行基因变异检测，虽然只检测了一个外显子V4,却发现了8例/56例(14.2%)的病例有变异，即B细胞淋巴瘤中的CD4阳性T细胞的确存在基因突变。本研究结果恰好支持了这个设想,这在B细胞淋巴瘤发病机理的研究中是一个突破 。如果把4个外显子均检测,可能发现更多的问题。
另外,发生基因突变的病例多数为弥漫性大B细胞淋巴瘤，支持与B淋巴细胞的转化和凋亡受阻有关。死亡基因蛋白Fas/FasL、抗凋亡基因蛋白bcl-2、影响细胞周期调控的Cyclin D1及CD4蛋白的检测发现，SLL和LBL的Fas、FasL和CD4均为弱或无表达，说明未受抗原刺激的B细胞所对应的淋巴瘤也缺乏激活B细胞才有的Fas和FasL蛋白表达。1例FL则均强表达，而且有bcl-2过表达，MCL有CyclinD1特殊表达，DLCL则或者强表达Fas和FasL，或者表达Cyclin D1，兼有FL和MCL的特征。有文献报道FasL诱导的死亡信号传导以CD4细胞为效应器[7]，本研究病例少，尚不能很好看出这个问题。
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另外，有4例的Fas和FasL均为强阳性，按理该受体与配体结合应该发生正常生理性凋亡而不应发生以Fas表达为主的B淋巴细胞聚集、恶变增殖的现象。但是从bcl-2和CyclinD1的免疫组化检测可见，这4例的bcl-2均为肿瘤细胞中等以上阳性，其中2例的Cyclin D1也明显阳性，提示这4例的CD4基因突变的同时，还出现了B细胞抗凋亡基因和细胞周期调控基因的表达异常。是否与CD4基因突变有因果关系，有待进一步探讨。至于8例发生CD4分子突变的病例多数为中老年，仅2例为幼儿，此现象是否有意义，也值得进一步研究。
本研究的意义在于，证实了B细胞淋巴瘤中的CD4细胞不仅是数量、分布和功能的异常，而且有结构基因V4外显子的突变。由于发生CD4基因变异的B细胞淋巴瘤病例又多伴有CD4蛋白、FasL蛋白、bcl-2蛋白及/或Cyclin D1的异常表达，提示在免疫系统的恶性肿瘤中也遵循免疫调节的一般规律，T细胞在其中起着主导作用。对此，很值得积累更多病例，从激活T细胞淋巴因子受体及信号传导过程等作进一步的深入研究。
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(感谢本校遗传学教研室蒋玮莹副教授、博士，达安基因诊断中心王蒙老师、生物化学研究生童大跃同学等提供PCR-SSCP方法学帮助)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870328)
作者简介：苏祖兰(1944-)，女，四川重庆人，博士，研究员.
参考文献：
[1] Jaffe E S, Harris N L, Diebold J ，et al. World Health Organization classification of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues. A progress report[J]. Am J Clin Pathol, 1999, 111(1 Suppl 1):S8.
, http://www.100md.com
[2] Harris N L， Bhan A K. Distribution of T-cell subsets in follicular and diffuse lymphomas of B-cell type[J]. Am J Pathol, 1983,113(2):172.
[3] 苏祖兰,陈钦材,陈 彬. TH细胞与IL2，IL2R在NHL发病学中的作用[J].中华病理学杂志，1988，17(4)：273.
[4] Ohnishi K， Bonavida B. Regulation of B-cell lymphoma growth in syngeneic SJL/J mice. Establishment of tumor dormancy following administration of anti-CD4 monoclonal antibody into tumor-bearing mice [J]. Leukemia， 1993,7(11):1801.
, 百拇医药
[5] Hilbert D M, Shen M Y, Rapp U R， et al. T cells induce terminal differentiation of transformed B cells to mature plasma cell tumors[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1995,92(3):649.
[6] Hodge T W，Sasso D R，McDougal J S. Humans with OKT4-epitope deficiency have a single nucleotide base change in the CD4 gene, resulting in substitution of TRP240 for ARG240[J]. Hum Immunol， 1991,39(2):99.
[7] el-Khatib M, Stanger B Z, Dogan H, et al. The molecular mechanism of FasL-mediated cytotoxicity by CD4+ Th1 Clones[J]. Cell Immunol, 1995，163(2)：237.
[8] 苏祖兰.B淋巴瘤恶变机理研究进展[J].中国科学基金，2000，14(2)：72.
[9] Dean M, Jacobson L P, McFarlane G, et al. Reduced risk of AIDS lymphoma in individuals heterozygous for the CCR5-delta32 mutation[J]. Cancer Res，1999， 59(15):3561.
收稿日期：2000-06-01, 百拇医药
单位：苏祖兰 金亦(中山医科大学附属第三医院病理科, 广东 广州 510630)；张子康 邵春奎 吴秋良 赵美卿 冯志英 侯景辉(中山医科大学附属第三医院核医学科, 广东 广州 510630)
关键词：抗原；CD4；遗传学；突变；FasL蛋白；原癌基因蛋白质c-bcl-2；细胞周期蛋白D1；淋巴瘤；B细胞
00zk28
摘 要：【目的】 检测B细胞淋巴瘤组织中T细胞的CD4 V4基因突变情况及其相应病例的Fas/FasL、CD4、bcl-2和Cyclin D1蛋白表达特征。【方法】 PCR-SSCP技术筛选检测56例B细胞淋巴瘤CD4分子的V4外显子突变状况。用免疫组化方法检测有突变的B细胞淋巴瘤组织中L26，UCHL1，CD3，Fas，FasL，bcl-2和Cyclin D1蛋白表达情况。【结果】 8例/56例(14.2%)T细胞CD4 V4外显子有变异。其中小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocyte lymphoma,SLL)和淋巴母细胞性淋巴瘤(lymphoblastic lymphoma,LBL)的Fas，FasL和CD4蛋白均为弱或无表达；滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma,FL)3项均强表达；3例弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBL)和1例套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)Fas和FasL强表达，CD4无或弱表达。Fas和FasL双强表达的4例,均有bcl-2和/或Cyclin D1过表达。【结论】 B细胞淋巴瘤中CD4 V4基因有突变，并提示这种突变与细胞死亡和细胞周期调控异常有关。
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中图分类号： R730.23 文献标识码： A
文章编号： 1000-257X(2000)04S0-0098-04
CD4 V4 Mutation of T Cells and Its Ralative Protein Expression
in 8 Cases of B Cell lymphoma
SU Zu-lan, JIN Yi, SHAO Chun-kui, FENG Zhi-ying
( Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630, China)
, 百拇医药
ZHANG Zi-kang
(Affiliated Tomor Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060, China)
WU Qiu-liang, ZHAO Mei-qing,HOU Jing-hui
Abstract: 【Objective】 Detection of mutation in CD4 V4 exon and expression of proteins associated with Fas, FasL, bcl-2,CD4 and CyclinD1 in B cell lymphoma. 【Methods】 The exon V4 mutation of CD4 gene was examined on 56 cases of B cell lymphoma specimens by means of PCR-SSCP and the expression of proteins of CD3,CD4, Fas, FasL, bcl-2 and Cyclin D1 by immunohistochemistry. 【Results】 The V4 mutaion rate of CD4 gene was 14.2% (8/56). Among them, CD4, Fas, FasL expressed weak or none in both SLL and LBL; on the contrary, FL was strong; 3/4 cases of DLBL and 1 case MCL expressed both Fas and FasL strong, but CD4 not expressed. Occasionally, they express bcl-2 and /or Cyclin D1 strong too. 【Conclusion】 There are CD4 V4 mutaion in B cell lymphoma and abnormal regulators of cell cycle and death.
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Key words: antigen, CD4/genetics; mutation; FasL protein; proto-oncogene proteins c-bcl-2; cyclin D1; lymphoma, B-cell
B细胞淋巴瘤是恶性淋巴瘤中最常见的类型, 其发病机理仍未阐明。Lukes等认为本病发生与B淋巴细胞的正常分化或转化途径受阻有关。鉴于T细胞对B细胞的分化和转化调节作用十分重要，有必要弄清楚B细胞淋巴瘤中的T细胞状况。大量研究已经表明在B细胞淋巴瘤组织中,T细胞数量、表型和亚群比例乃至功能均有明显异常[3～6]。也有个别作者注意到CD4分子HIV受体CCR5-delta32缺失可使患AIDS相关淋巴瘤的危险性降低3倍。但是迄今尚未查见B细胞淋巴瘤中T细胞CD4分子本身基因V4外显子突变的报道。我们采用PCR-SSCP方法，检测56例B细胞淋巴瘤石蜡包埋组织标本中CD4的V4外显子的基因突变情况,并且了解与细胞周期调控和死亡有关的蛋白表达特征。为探讨CD4 V4基因变化在B细胞淋巴瘤发病过程中的意义提供实验依据。
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1 材料和方法
1.1 材 料
中山医科大学附属三院和附属肿瘤医院1995～1999年活检切除的未经治疗的淋巴瘤石蜡包埋活检组织标本70例,采用WHO97分类标准,根据形态和免疫组化标记结合临床表现重新诊断分类，得到56例B细胞淋巴瘤。对该56例B细胞淋巴瘤用PCR-SSCP检测CD4 V4突变，有突变的病例再增加作部分免疫标记作为分析对象。另设20例良性淋巴组织作对照。
1.2 PCR-SSCP
1.2.1 DNA制备 按说明书进行。每例石蜡包埋标本切片5 μ厚，共5张，常规烤片脱蜡，自然干燥。另将组织刮入1.5 mL塑料离心管中，加入70 μL消化液(含10 mmol/L Tris-HC，pH8.0，1 mml/L EDTA，10 ml/L 吐温-20，150 mg/L Proteinase K, PK)，37 ℃过夜。煮沸10 min灭活PK。高速离心后取上清作为DNA模板，置-20 ℃备用。
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1.2.2 PCR 根据文献[6]选择V4引物序列,由上海生物工程公司合成。序列如下：正义链5′-GCC ACT CAG CTC CAG AAA-3′，反义链5′-CTT GAT GTT GGA TTC CAG-3′反应体系(每个反应管总反应体系为25 μL)：ddH2O，10×buffer，10 mmoL/L dNTPs，引物1，引物2，DNA模板，Tag酶。扩增条件： 94 ℃ 5 min，温度降至80 ℃，加酶7 min之后，94 ℃变性1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min共35个循环。最后72 ℃延伸10 min。取样品1 μL加5 μL扩增产物混匀，于15 mg/L琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，在紫外分析仪上观察，若在201 bp处出现橙黄色条带，可用于SSCP分析。
1.2.3 SSCP分析 PCR扩增产物加入变性剂充分混匀，瞬间离心，沸水浴10 min，立即冰浴，5 min后在80 mg/L聚丙烯酰胺凝胶上电泳，100 V，快速上样，400 V 10 min后，110 V电泳20 h。100 mL/L乙醇和11.3 mL/L硝酸短暂浸泡电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，再12 mmoL/L硝酸银浸泡20 min，振摇至现出条带,100 mL/L醋酸浸泡2 min终止反应。结果判断：可见棕黄色的电泳条带。B细胞淋巴瘤的标本与良性相比，出现条带增多、减少或位置改变，即为基因突变证据。
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每次电泳均设正常淋巴组织对照。共作了20例良性对照。
1.3 免疫组化
对T细胞的CD4 V4外显子有变异的B细胞淋巴瘤的8例标本增加作Fas，FasL，CD4，bcl-2和CyclinD1等标记检测。均用鼠抗人单克隆抗体(DAKO或迈新公司)，采用SLAB法，按说明书进行。微波法或高压法修复抗原。DAB显色，苏木素复染。结果判断：按病理常规通用标准采用半定量记数，按阳性细胞占切片中肿瘤组织内总细胞数的比例分为4级，即<25%：-，25%～50%：+，50%～75%：++，>75%：+++，其中FasL和bcl-2为核和浆阳性，UCHL1，CD3，CD4，L26均为膜阳性。每次染色用良性淋巴组织(或扁桃体)作对照,并另设PBS代替第一抗体作为阴性对照。
2 结 果
56例B细胞淋巴瘤中CD4 V4外显子有基因变异病例8例，其中突变6例，缺失2例。突变电泳条带见图1，见第3，4泳带箭头处出现泳带增多现象。
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这8例的临床和病理特点：男5例，女3例; 6例为56～68岁的中老年人，1例2岁，1例5.5岁。肿瘤累及部位广泛，2例为肠道，1例鼻咽部，其余为颌下、腹股沟、锁骨上等处淋巴结肿大。2例为复发。组织学代表性图象见图2。
由表1可见，各1例SLL和LBL的Fas，FasL和CD4均为弱或无表达，1例FL上述3项均强表达；Fas,FasL双强表达的4例均有bcl-2和/或Cyclin D1强表达，其中3例为DLBL，1例为MCL。v
图1 PCR-SSCP的某一次电泳条带照片。
Fig.1 PCR-SSCP, one of series times of electrophoresis
1: Benigh lymphoid tissue (as a control); 3: 5 in table 1,follicular cell lymphoma grade Ⅱ (FL-II); or : mutation line; 4: 6 in table 1, defuse large b cell lymphoma (DLBL); 2,5,6: No any more mutaion in this time of electoporesis
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图2 例5有CD4V4基因突变的滤泡性B细胞淋巴瘤的
病理组织形态和免疫组化
Fig.2 Case 5 morphological change and immunological
marker of follicular B cell lymphoma with
mutation of CD4 V4 exon
A: HE, 40×10; B: L26(CD20)positive cells (FL), SLAB, 40×10
表1 8例B细胞淋巴瘤免疫标记特征
Table 1 Immunological Markers of 8 cases B cell lymphoma Case
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Sex
Age(yr)
Subtype
L26
UCHL-1
CD3
CD4
Fas
FasL
bcl-2
CyclinD1
1
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56
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2
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Note: F:female; M: male; -/+ +：tumor cells/ reactive cells, if no “/” means tumor cells condition; SLL：small lymphocyte lymphoma; MCL：mantle cell lymphoma; DLBL：defuse large B cell lymphoma; FL-II: follicular cell lymphoma grade II; LBL：lymphoblastic lymphoma3 讨 论
T细胞在免疫反应中总是处于核心地位，而在其中发挥更大作用的Th1和Th2细胞均属于CD4阳性细胞,我们认为,在B细胞淋巴瘤这种免疫系统的恶性肿瘤,也应该遵循这个原则。我们早期的研究和其它很多文献已经报道B细胞淋巴瘤中的T细胞有亚型和数量异常，主要表现为CD4减少，CD8增多或不变，CD4/CD8比值下降[2、3]。后来的研究发现B细胞淋巴瘤中的T细胞有明显功能异常,如1993年Ohnish用加入抗T细胞单克隆抗体方法,使原有B细胞淋巴瘤进入冬眠状态[4],而1995年Herbert则用动物实验发现,CD4细胞可使B细胞瘤演变为B细胞转化的终末状态浆细胞瘤[5]，从而说明CD4细胞不仅在B细胞转化过程中，而且在B细胞淋巴瘤的形成中均具有重要作用。与此同时，对CD4细胞基因变异及其在B细胞淋巴瘤发生发展中的可能意义应该引起足够重视[8]。一个有代表性的实例是AIDS患者最常伴发的恶性肿瘤，除了Kaposi′s肉瘤，就是B细胞淋巴瘤，而AIDS患者的CD4细胞被杀灭减少或称凋亡增多是重要特征，这之间的功能联系十分值得重视。新近有研究发现，人为改变CD4分子上的HIV受体基因CCR5-delta32结构，可以使HIV相关B细胞淋巴瘤的感染危险性减少达3倍之多[9]。CD4是55 000 ku的蛋白分子，存在于MHC限制的II类分子的辅助/诱导T细胞上，属于Ig超家族成员，它也是HIV结合受体，通过感染CD4细胞，机体疾患AIDS。
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基于上述考虑，本文侧重对B细胞淋巴瘤的反应性CD4 T细胞的结构基因V4外显子进行基因变异检测，虽然只检测了一个外显子V4,却发现了8例/56例(14.2%)的病例有变异，即B细胞淋巴瘤中的CD4阳性T细胞的确存在基因突变。本研究结果恰好支持了这个设想,这在B细胞淋巴瘤发病机理的研究中是一个突破 。如果把4个外显子均检测,可能发现更多的问题。
另外,发生基因突变的病例多数为弥漫性大B细胞淋巴瘤，支持与B淋巴细胞的转化和凋亡受阻有关。死亡基因蛋白Fas/FasL、抗凋亡基因蛋白bcl-2、影响细胞周期调控的Cyclin D1及CD4蛋白的检测发现，SLL和LBL的Fas、FasL和CD4均为弱或无表达，说明未受抗原刺激的B细胞所对应的淋巴瘤也缺乏激活B细胞才有的Fas和FasL蛋白表达。1例FL则均强表达，而且有bcl-2过表达，MCL有CyclinD1特殊表达，DLCL则或者强表达Fas和FasL，或者表达Cyclin D1，兼有FL和MCL的特征。有文献报道FasL诱导的死亡信号传导以CD4细胞为效应器[7]，本研究病例少，尚不能很好看出这个问题。
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另外，有4例的Fas和FasL均为强阳性，按理该受体与配体结合应该发生正常生理性凋亡而不应发生以Fas表达为主的B淋巴细胞聚集、恶变增殖的现象。但是从bcl-2和CyclinD1的免疫组化检测可见，这4例的bcl-2均为肿瘤细胞中等以上阳性，其中2例的Cyclin D1也明显阳性，提示这4例的CD4基因突变的同时，还出现了B细胞抗凋亡基因和细胞周期调控基因的表达异常。是否与CD4基因突变有因果关系，有待进一步探讨。至于8例发生CD4分子突变的病例多数为中老年，仅2例为幼儿，此现象是否有意义，也值得进一步研究。
本研究的意义在于，证实了B细胞淋巴瘤中的CD4细胞不仅是数量、分布和功能的异常，而且有结构基因V4外显子的突变。由于发生CD4基因变异的B细胞淋巴瘤病例又多伴有CD4蛋白、FasL蛋白、bcl-2蛋白及/或Cyclin D1的异常表达，提示在免疫系统的恶性肿瘤中也遵循免疫调节的一般规律，T细胞在其中起着主导作用。对此，很值得积累更多病例，从激活T细胞淋巴因子受体及信号传导过程等作进一步的深入研究。
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(感谢本校遗传学教研室蒋玮莹副教授、博士，达安基因诊断中心王蒙老师、生物化学研究生童大跃同学等提供PCR-SSCP方法学帮助)
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870328)
作者简介：苏祖兰(1944-)，女，四川重庆人，博士，研究员.
参考文献：
[1] Jaffe E S, Harris N L, Diebold J ，et al. World Health Organization classification of neoplastic diseases of the hematopoietic and lymphoid tissues. A progress report[J]. Am J Clin Pathol, 1999, 111(1 Suppl 1):S8.
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[2] Harris N L， Bhan A K. Distribution of T-cell subsets in follicular and diffuse lymphomas of B-cell type[J]. Am J Pathol, 1983,113(2):172.
[3] 苏祖兰,陈钦材,陈 彬. TH细胞与IL2，IL2R在NHL发病学中的作用[J].中华病理学杂志，1988，17(4)：273.
[4] Ohnishi K， Bonavida B. Regulation of B-cell lymphoma growth in syngeneic SJL/J mice. Establishment of tumor dormancy following administration of anti-CD4 monoclonal antibody into tumor-bearing mice [J]. Leukemia， 1993,7(11):1801.
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[9] Dean M, Jacobson L P, McFarlane G, et al. Reduced risk of AIDS lymphoma in individuals heterozygous for the CCR5-delta32 mutation[J]. Cancer Res，1999， 59(15):3561.
收稿日期：2000-06-01, 百拇医药