糖尿病大鼠肾脏组织中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶的表达特征及意义
段惠军1，王丽晖2，史永红1，刘青娟1，何 宁1，高 峰1
(1河北医科大学病理教研室，河北 石家庄 050017； 2白求恩国际和平医院肾脏病科，河北 石家庄 050082)
【摘要】 目的：探讨糖尿病(DM)大鼠肾组织p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及其下游转录因子cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的表达特征及与肾小球肥大、细胞外基质积聚的关系。方法：70只雄性Wistar大鼠，行右肾切除术2周后，随机分为两组：右肾切除对照组(CN)和DM组。DM组经腹腔注射链脲佐菌素(STZ， 65 mg/kg)诱发DM。CN组注射等量枸橼酸缓冲液。两组分别于注射后第1、2、4、8和12周各取6只大鼠，收集24 h尿液，测定尿蛋白(Upro)、肌酐(UCr)；股动脉放血分离血清，测血糖(Glu)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)，并计算肌酐清除率(CCr)；免疫组化法检测肾皮质磷酸化p38 MAPK (P-p38 MAPK)及其磷酸化CREB(P-CREB)的表达特征，并检测转化生长因子-β1(TGF-β1)、纤维粘连蛋白(FN)及层粘连蛋白(LN)的表达，应用图像分析系统进行定量分析。流式细胞术检测P-p38 MAPK和P-CREB蛋白的表达。结果：与CN组比较，DM组P-p38 MAPK在第1、2、4和8周升高(P均<0.01)，第12周降至正常。DM组P-CREB在第2、4和8周增高(P均<0.01)，在12周时降至正常。TGF-β1、FN、LN分别于第2、4周开始升高。结论：肾小球p38 MAPK及其下游转录因子CREB活性在早期糖尿病肾病大鼠肾组织中升高，p38 MAPK途径的激活有可能在糖尿病肾病的早期肾小球肥大和细胞外基质积聚中发挥一定作用。
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【关键词】 糖尿病肾病；p38丝裂原活化蛋白激酶；cAMP反应元件结合蛋白；信号转导；磷酸化
Expression of phosphorylating-p38 mitogen-activated protein kinase of kidney in rats with diabetes mellitus and its significance
DUAN Hui-jun1, WANG Li-hui2, SHI Yong-hong1, LIU Qing-juan1, HE Ning1， GAO Feng1.
1. Department of Pathology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China; 2. Department of Nephrology, Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, Hebei, China
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【Abstract】 Objective: To investigate the expression of the p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) and cAMP-response element binding protein (CREB) of kidney in experimental diabetes mellitus rats, and the relationship with glomerular hypertrophy and extracellular matrix(ECM) accumulation. Methods: Seventy male Wistar rats with nephrectomy of right kidney of 2 weeks were randomly divided in two groups: control group and diabetic group. Diabetic models were established by injecting intraperitoneally streptozocin (STZ, 65 mg/kg) and the control group was injected citric acid-buffered liquid. Six rats of each group were killed at 1, 2, 4, 8 and 12 weeks after injecting STZ respectively. Urine of 24 hours was collected, protein and creatinine in urine(Upro, UCr), serum glucose(Glu), serum creatinine(SCr), blood urea nitrogen(BUN) were determined, and creatinine clearance was calculated. Immunohistochemistry was used to analyze activation of phosphorylating-p38 MAPK(P-p38 MAPK) and phosphorylating-CREB(P-CREB) in renal cortex, the expressions of transferase growth factor-β1(TGF-β1), fibronectin(FN), laminin(LN) in glomeruli were also analysed by computer image-pattern analysis system. Flow cytometry was used to detect the expression of P-p38 MAPK and P-CREB. Results: The expressions of TGF-β1, FN and LN in diabetic rats were increased in 2 and 4 weeks(all P<0.01). Compared with control group， expression of P-p38 MAPK in diabetic rats was significantly increased in 1, 2, 4, 8 weeks(all P<0.01), then decreased to normal in 12 weeks. P-CREB was increased in 2, 4, 8 weeks in diabetic rats(all P<0.01), and decrease to normal in 12 weeks. Conclusion: Glomerular p38 MAPK and CREB activities are increased in early diabetic mellitus in rats. This activation of p38 MAPK pathway in diabetic glomeruli may, in part, plays a role in the pathogenesis of early glomerular hypertrophy and ECM accumulation.
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【Key words】 diabetic nephropathy; p38 mitogen-activated protein kinase; cAMP response element-binding protein; signal transduction; phosphorylation
CLC number:R587.1;R363.21 Document code:A Article ID:1008-9691(2004)06-0372-05
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(DM)微血管并发症之一，其基本病理改变主要为早期肾脏细胞增殖肥大，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)增多，晚期为肾小球硬化。研究表明，肾脏血流动力学、蛋白质非酶糖化、多元醇通路激活、细胞增殖和凋亡等多种因素与DN的发生、发展有关，其中有些因素可引起肾脏细胞内信号转导通路改变。近年研究表明，丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族信号转导通路的激活，一定程度上导致和加速了DN的发生(1)。p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)作为细胞信号传递系统的交汇点，其磷酸化后可以直接激活转录因子，参与机体的应激反应。为进一步明确p38 MAPK信号转导途径在DN发生、发展中的作用，我们采用了DM大鼠模型，观察肾组织中p38 MAPK及其下游转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的表达情况，并探讨p38 MAPK通路与肾小球肥大、ECM积聚之间的关系。
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1 材料与方法
1.1 试剂与药物：链脲佐菌素(STZ；Sigma公司，美国)，兔抗大鼠磷酸化CREB(P-CREB)，兔抗大鼠磷酸化p38 MAPK(P-p38 MAPK)，小鼠抗大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1；Santa Cruz 公司，美国)，小鼠抗大鼠纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)，小鼠抗大鼠层粘连蛋白(laminin，LN；Neomarker公司，美国)，免疫组化试剂盒(北京中山生物有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及模型制备：按照文献(2)方法，选取体质量为120~150 g的雄性Wistar大鼠70只(由河北医科大学实验动物中心提供)，采用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后行右肾切除术，以加重DM状态下的肾脏病变，2周后切口完全愈合。将大鼠随机分为两组：右肾切除对照组(CN组，n=30)和DM组(n=40)。DM组大鼠按65 mg/kg腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液中，pH为4.5)，48 h后尾尖取血测定血糖(Glu)，留尿测尿糖。以Glu≥16.7 mol/L、尿糖(+ + +)~(+ + + +)作为DM模型成功的标志。CN组注射等体积枸橼酸缓冲液。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。DM组制模后每周测Glu 1次，4只不符合标准，且实验期间死亡6只，均除外。
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1.2.2 标本收集：各组于注射STZ或枸橼酸缓冲液后1、2、4、8和12周各取6只大鼠，称重后分别用代谢笼收集24 h尿;股动脉取血，分离血清；切取肾脏，去掉被膜，用滤纸吸干血迹后称重；部分肾组织置于体积分数为4%的多聚甲醛中固定用于光镜和免疫组化检测。
1.2.3 血、尿生化指标检测：采用日立7170A全自动生化分析仪测定Glu、血尿素氮(BUN)、尿肌酐(UCr)、尿蛋白(Upro)，计算肌酐清除率(CCr)。
1.2.4 病理组织学观察：肾组织经4%多聚甲醛固定后，常规脱水、包埋、切片，片厚2 μM，分别行苏木素-伊红(HE)和过碘酸-雪夫反应(PAS)染色。
1.2.5 免疫组化染色：采用链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶(SP)连结法。切片常规脱蜡水化，一抗为兔抗大鼠P-p38 MAPK及P-CREB，小鼠抗大鼠TGF-β1、FN、LN，滴加二抗生物素化羊抗兔抗体或羊抗小鼠抗体，37 ℃，25 min；滴加SP，37 ℃，20 min；3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素轻度复染；脱水，透明，封片，光镜观察。阳性部位呈棕黄色。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，以乳腺癌作为阳性对照。应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，分别测量出每个肾小球着色阳性面积、积分吸光度和肾小球面积，以前两个参数与肾小球面积之比表示该成分的相对含量和表达强度。P-CREB胞核着色者则检测每个肾小球视野内阳性胞核细胞数与所有肾小球细胞数之比，以每组均值进行比较。每组分析6个标本，每个标本切片取10个完整的肾小球进行分析，取均值代表一只大鼠相应成分在肾小球中的相对含量和表达强度。
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1.2.6 肾皮质P-p38 MAPK和P-CREB蛋白表达：采用间接免疫荧光法，用流式细胞术检测。将肾组织标本用网搓法制成单细胞悬液后，分别加入1∶100稀释兔抗大鼠P-p38 MAPK及P-CREB多克隆抗体，37 ℃温浴30 min; 加入羊抗兔异硫氰酸荧光素(FITC)-IgG，温浴洗涤后进行检测。将所得数据输入计算机，应用相应程序进行资料处理，测定前以标准鸡红细胞调整仪器的变异系数(CV)值在5%以内。按文献(3)方法，以荧光指数(FI)表示P-p38 MAPK和P-CREB的相对含量，FI>1.0为阳性表达。FI=(样品的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/(正常组织平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)。
1.3 统计学方法：数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 120统计软件对数据进行t检验及方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
, 百拇医药 2.1 病理组织学观察：PAS染色的CN组肾小球未见病理改变。DM组从第4周开始，随时间延长，肾小球基底膜逐渐增厚，ECM增多，系膜区扩大。
2.2 各组动物体质量、肾质量、肥大指数(肾/体质量比)及生化指标的变化(表1)：与CN组比较，第1~12周DM组大鼠体质量下降而肾质量变化不明显，肥大指数第2周开始明显升高，CCr第2周开始明显升高，Upro和BUN第4周开始明显升高。
2.3 TGF-β1、LN、FN在肾小球中的表达及定量检测(表2)：TGF-β1在肾小球上皮细胞及系膜区、毛细血管襻、肾小囊壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞胞浆及小管间质均呈阳性表达，且从第2周起DM组表达明显高于CN组。LN及FN阳性染色主要分布于肾小球系膜区、毛细血管基膜、肾小球囊壁和肾小管基底膜、肾间质中。且从第4周起DM组肾小球LN及FN较CN组表达明显增强。
2.4 P-p38 MAPK和P-CREB蛋白在肾脏组织中的定位及定量检测(表3，表4)：免疫组化结果显示，第1~8周DM组P-p38 MAPK呈高水平表达，主要表达在肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞，近端和远端肾小管上皮细胞的胞浆内偶有胞核着色；第12周时P-p38 MAPK在各部位的表达接近CN组。P-CREB在CN组肾小球和肾小管细胞核中有少量着色；而DM组则主要在系膜细胞、内皮细胞、脏层上皮细胞及小管上皮细胞的胞核中表达。第2~8周DM组P-CREB呈高水平表达，第12周与CN组无差别。流式细胞术显示DM组P-p38 MAPK和P-CREB的相对含量较CN组明显增强，变化趋势同免疫组化结果一致。
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3 讨 论
p38 MAPK属于丝裂原活化蛋白激酶家族，是近年来发现的细胞内普遍存在的一条信号转导通路。细胞外的物理应激因子，如高渗透压、热休克、紫外线以及细胞因子、内毒素脂多糖(LPS)等都能激活该途径，诱导细胞内蛋白质合成与分泌、细胞分化及凋亡等生物效应。p38 MAPK还能与细胞内其他信号通路之间相互作用，是细胞内信号传递系统的交汇点或共同通路。p38 MAPK一旦被激活后，可以使一些转录因子如CREB、转录活化因子-1(activating factor-1， ATF-1)、ATF-2及活化蛋白-1(AP-1)等的丝氨酸和苏氨酸位点磷酸化，活化这些转录因子，从而调节目的基因的表达。CREB作为真核生物组成型核转录因子，与AP-1属同一家族，其上的第133位丝氨酸可被多种蛋白激酶激活，例如蛋白激酶A(PKA)、钙调蛋白、p38 MAPK等。此外，磷酸化的CREB可与结合在含有cAMP反应元件(CRE)位点基因启动子上的CREB或ATF形成异聚体或同聚体，然后调控这些基因的表达。FN的启动子在-170 bp含有CRE，所以激活后的CREB可以结合在这个CRE上，导致FN mRNA表达增强(4)。关于p38 MAPK在DN中的作用，Kang等(5)研究发现，DM大鼠肾小球中p38 MAPK蛋白及其mRNA表达高于对照，但其活性仅在第4周和第8周时升高；随后的报道却表明，p38 MAPK活性仅在4周时升高(6)。Imai 等(7)研究发现，循环血压增高可通过激活p38 MAPK而加重高血压DM大鼠的肾组织损害。我们的研究结果表明，p38 MAPK活性在DM第1周时开始升高，第4周和第8周时达高峰，第12周时与CN组无明显差别；CREB活性在第2周时开始升高，第4周和第8周时达高峰，第12周时降至正常。表明p38 MAPK及CREB活性的升高早于TGF-β1、FN、LN和肥大指数，提示p38 MAPK信号转导通路可能参与了DM大鼠早期肾脏肥大及ECM的形成。研究表明，在人类DN患者和实验性DN模型中，肾皮质TGF-β1 mRNA和蛋白表达增多，它不仅抑制细胞增生，诱导细胞肥大，而且还可以通过刺激ECM中FN、LN及胶原等多种成分合成，减少金属基质蛋白酶的表达以及增加金属基质蛋白酶抑制剂的合成等机制，参与DM肾脏细胞肥大和ECM进行性积聚过程，最终引起肾小球硬化(8)。MAPK信号转导通路是否参与TGF-β1在DN中的表达Hayashida等(9)和Inoki等(10)的研究均已证实，TGF-β1可以激活体外培养的系膜细胞的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和C-Jun N端激酶(JNK)这两条MAPK通路，调节AP-1等转录因子，从而影响胶原合成，促进了ECM合成。而我们的实验结果证明，p38 MAPK可能也参与了DN中TGF-β1的表达，第2周时TGF-β1表达明显上调，而此时p38 MAPK及CREB活性开始升高，推测DM时p38 MAPK通路激活后使转录因子CREB活化，从而影响TGF-β1基因的表达，促进ECM的合成。关于MAPK在正常及病理肾组织中分布的研究报道较少。Omori等(11)对不同发育阶段SD大鼠肾脏中MAPK各亚类分布情况进行观察，发现p38在发育期肾脏呈高表达，出生后表达明显减少，成年时代仅在肾小球皮质脏层、远端肾小管和集合管可见表达。我们首次在单侧肾切除的DM模型中观察了p38 MAPK蛋白表达量及活性变化，而且发现p38 MAPK主要分布在肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞，同时发现近端和远端肾小管上皮也可表达p38 MAPK。国内有学者曾经研究小肠缺血-再灌注后P-p38 MAPK的表达特征，认为免疫组化显色磷酸化的p38主要分布在胞浆中(12)，与我们的结论一致。综上所述，p38 MAPK是DM多种致病因素(高糖、高张力、血管紧张素Ⅱ及其他细胞因子)共同信号通路的交汇点，p38 MAPK参与了DM的发生和发展。但在各种应激因素作用下，p38 MAPK通路的激活只是短暂的，而DM的发生、发展却是一个持续渐进的过程。因此，机制仍需深入研究。
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参考文献
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(12)邢峰，付小兵，杨银辉，等.小肠缺血-再灌注后磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶的表达特征及与干细胞定位的关系(J).中国危重病急救医学，2002，14(9):522-525
作者简介：段惠军(1955-)，男(汉族)，河北省石家庄市人，博士后，博士研究生导师，教授。, http://www.100md.com
(1河北医科大学病理教研室，河北 石家庄 050017； 2白求恩国际和平医院肾脏病科，河北 石家庄 050082)
【摘要】 目的：探讨糖尿病(DM)大鼠肾组织p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及其下游转录因子cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的表达特征及与肾小球肥大、细胞外基质积聚的关系。方法：70只雄性Wistar大鼠，行右肾切除术2周后，随机分为两组：右肾切除对照组(CN)和DM组。DM组经腹腔注射链脲佐菌素(STZ， 65 mg/kg)诱发DM。CN组注射等量枸橼酸缓冲液。两组分别于注射后第1、2、4、8和12周各取6只大鼠，收集24 h尿液，测定尿蛋白(Upro)、肌酐(UCr)；股动脉放血分离血清，测血糖(Glu)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)，并计算肌酐清除率(CCr)；免疫组化法检测肾皮质磷酸化p38 MAPK (P-p38 MAPK)及其磷酸化CREB(P-CREB)的表达特征，并检测转化生长因子-β1(TGF-β1)、纤维粘连蛋白(FN)及层粘连蛋白(LN)的表达，应用图像分析系统进行定量分析。流式细胞术检测P-p38 MAPK和P-CREB蛋白的表达。结果：与CN组比较，DM组P-p38 MAPK在第1、2、4和8周升高(P均<0.01)，第12周降至正常。DM组P-CREB在第2、4和8周增高(P均<0.01)，在12周时降至正常。TGF-β1、FN、LN分别于第2、4周开始升高。结论：肾小球p38 MAPK及其下游转录因子CREB活性在早期糖尿病肾病大鼠肾组织中升高，p38 MAPK途径的激活有可能在糖尿病肾病的早期肾小球肥大和细胞外基质积聚中发挥一定作用。
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【关键词】 糖尿病肾病；p38丝裂原活化蛋白激酶；cAMP反应元件结合蛋白；信号转导；磷酸化
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DUAN Hui-jun1, WANG Li-hui2, SHI Yong-hong1, LIU Qing-juan1, HE Ning1， GAO Feng1.
1. Department of Pathology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China; 2. Department of Nephrology, Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, Hebei, China
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【Abstract】 Objective: To investigate the expression of the p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) and cAMP-response element binding protein (CREB) of kidney in experimental diabetes mellitus rats, and the relationship with glomerular hypertrophy and extracellular matrix(ECM) accumulation. Methods: Seventy male Wistar rats with nephrectomy of right kidney of 2 weeks were randomly divided in two groups: control group and diabetic group. Diabetic models were established by injecting intraperitoneally streptozocin (STZ, 65 mg/kg) and the control group was injected citric acid-buffered liquid. Six rats of each group were killed at 1, 2, 4, 8 and 12 weeks after injecting STZ respectively. Urine of 24 hours was collected, protein and creatinine in urine(Upro, UCr), serum glucose(Glu), serum creatinine(SCr), blood urea nitrogen(BUN) were determined, and creatinine clearance was calculated. Immunohistochemistry was used to analyze activation of phosphorylating-p38 MAPK(P-p38 MAPK) and phosphorylating-CREB(P-CREB) in renal cortex, the expressions of transferase growth factor-β1(TGF-β1), fibronectin(FN), laminin(LN) in glomeruli were also analysed by computer image-pattern analysis system. Flow cytometry was used to detect the expression of P-p38 MAPK and P-CREB. Results: The expressions of TGF-β1, FN and LN in diabetic rats were increased in 2 and 4 weeks(all P<0.01). Compared with control group， expression of P-p38 MAPK in diabetic rats was significantly increased in 1, 2, 4, 8 weeks(all P<0.01), then decreased to normal in 12 weeks. P-CREB was increased in 2, 4, 8 weeks in diabetic rats(all P<0.01), and decrease to normal in 12 weeks. Conclusion: Glomerular p38 MAPK and CREB activities are increased in early diabetic mellitus in rats. This activation of p38 MAPK pathway in diabetic glomeruli may, in part, plays a role in the pathogenesis of early glomerular hypertrophy and ECM accumulation.
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【Key words】 diabetic nephropathy; p38 mitogen-activated protein kinase; cAMP response element-binding protein; signal transduction; phosphorylation
CLC number:R587.1;R363.21 Document code:A Article ID:1008-9691(2004)06-0372-05
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(DM)微血管并发症之一，其基本病理改变主要为早期肾脏细胞增殖肥大，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)增多，晚期为肾小球硬化。研究表明，肾脏血流动力学、蛋白质非酶糖化、多元醇通路激活、细胞增殖和凋亡等多种因素与DN的发生、发展有关，其中有些因素可引起肾脏细胞内信号转导通路改变。近年研究表明，丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族信号转导通路的激活，一定程度上导致和加速了DN的发生(1)。p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)作为细胞信号传递系统的交汇点，其磷酸化后可以直接激活转录因子，参与机体的应激反应。为进一步明确p38 MAPK信号转导途径在DN发生、发展中的作用，我们采用了DM大鼠模型，观察肾组织中p38 MAPK及其下游转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)的表达情况，并探讨p38 MAPK通路与肾小球肥大、ECM积聚之间的关系。
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1 材料与方法
1.1 试剂与药物：链脲佐菌素(STZ；Sigma公司，美国)，兔抗大鼠磷酸化CREB(P-CREB)，兔抗大鼠磷酸化p38 MAPK(P-p38 MAPK)，小鼠抗大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1；Santa Cruz 公司，美国)，小鼠抗大鼠纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)，小鼠抗大鼠层粘连蛋白(laminin，LN；Neomarker公司，美国)，免疫组化试剂盒(北京中山生物有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及模型制备：按照文献(2)方法，选取体质量为120~150 g的雄性Wistar大鼠70只(由河北医科大学实验动物中心提供)，采用戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后行右肾切除术，以加重DM状态下的肾脏病变，2周后切口完全愈合。将大鼠随机分为两组：右肾切除对照组(CN组，n=30)和DM组(n=40)。DM组大鼠按65 mg/kg腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液中，pH为4.5)，48 h后尾尖取血测定血糖(Glu)，留尿测尿糖。以Glu≥16.7 mol/L、尿糖(+ + +)~(+ + + +)作为DM模型成功的标志。CN组注射等体积枸橼酸缓冲液。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。DM组制模后每周测Glu 1次，4只不符合标准，且实验期间死亡6只，均除外。
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1.2.2 标本收集：各组于注射STZ或枸橼酸缓冲液后1、2、4、8和12周各取6只大鼠，称重后分别用代谢笼收集24 h尿;股动脉取血，分离血清；切取肾脏，去掉被膜，用滤纸吸干血迹后称重；部分肾组织置于体积分数为4%的多聚甲醛中固定用于光镜和免疫组化检测。
1.2.3 血、尿生化指标检测：采用日立7170A全自动生化分析仪测定Glu、血尿素氮(BUN)、尿肌酐(UCr)、尿蛋白(Upro)，计算肌酐清除率(CCr)。
1.2.4 病理组织学观察：肾组织经4%多聚甲醛固定后，常规脱水、包埋、切片，片厚2 μM，分别行苏木素-伊红(HE)和过碘酸-雪夫反应(PAS)染色。
1.2.5 免疫组化染色：采用链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶(SP)连结法。切片常规脱蜡水化，一抗为兔抗大鼠P-p38 MAPK及P-CREB，小鼠抗大鼠TGF-β1、FN、LN，滴加二抗生物素化羊抗兔抗体或羊抗小鼠抗体，37 ℃，25 min；滴加SP，37 ℃，20 min；3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素轻度复染；脱水，透明，封片，光镜观察。阳性部位呈棕黄色。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，以乳腺癌作为阳性对照。应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，分别测量出每个肾小球着色阳性面积、积分吸光度和肾小球面积，以前两个参数与肾小球面积之比表示该成分的相对含量和表达强度。P-CREB胞核着色者则检测每个肾小球视野内阳性胞核细胞数与所有肾小球细胞数之比，以每组均值进行比较。每组分析6个标本，每个标本切片取10个完整的肾小球进行分析，取均值代表一只大鼠相应成分在肾小球中的相对含量和表达强度。
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1.2.6 肾皮质P-p38 MAPK和P-CREB蛋白表达：采用间接免疫荧光法，用流式细胞术检测。将肾组织标本用网搓法制成单细胞悬液后，分别加入1∶100稀释兔抗大鼠P-p38 MAPK及P-CREB多克隆抗体，37 ℃温浴30 min; 加入羊抗兔异硫氰酸荧光素(FITC)-IgG，温浴洗涤后进行检测。将所得数据输入计算机，应用相应程序进行资料处理，测定前以标准鸡红细胞调整仪器的变异系数(CV)值在5%以内。按文献(3)方法，以荧光指数(FI)表示P-p38 MAPK和P-CREB的相对含量，FI>1.0为阳性表达。FI=(样品的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/(正常组织平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)。
1.3 统计学方法：数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 120统计软件对数据进行t检验及方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
, 百拇医药 2.1 病理组织学观察：PAS染色的CN组肾小球未见病理改变。DM组从第4周开始，随时间延长，肾小球基底膜逐渐增厚，ECM增多，系膜区扩大。
2.2 各组动物体质量、肾质量、肥大指数(肾/体质量比)及生化指标的变化(表1)：与CN组比较，第1~12周DM组大鼠体质量下降而肾质量变化不明显，肥大指数第2周开始明显升高，CCr第2周开始明显升高，Upro和BUN第4周开始明显升高。
2.3 TGF-β1、LN、FN在肾小球中的表达及定量检测(表2)：TGF-β1在肾小球上皮细胞及系膜区、毛细血管襻、肾小囊壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞胞浆及小管间质均呈阳性表达，且从第2周起DM组表达明显高于CN组。LN及FN阳性染色主要分布于肾小球系膜区、毛细血管基膜、肾小球囊壁和肾小管基底膜、肾间质中。且从第4周起DM组肾小球LN及FN较CN组表达明显增强。
2.4 P-p38 MAPK和P-CREB蛋白在肾脏组织中的定位及定量检测(表3，表4)：免疫组化结果显示，第1~8周DM组P-p38 MAPK呈高水平表达，主要表达在肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞，近端和远端肾小管上皮细胞的胞浆内偶有胞核着色；第12周时P-p38 MAPK在各部位的表达接近CN组。P-CREB在CN组肾小球和肾小管细胞核中有少量着色；而DM组则主要在系膜细胞、内皮细胞、脏层上皮细胞及小管上皮细胞的胞核中表达。第2~8周DM组P-CREB呈高水平表达，第12周与CN组无差别。流式细胞术显示DM组P-p38 MAPK和P-CREB的相对含量较CN组明显增强，变化趋势同免疫组化结果一致。
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3 讨 论
p38 MAPK属于丝裂原活化蛋白激酶家族，是近年来发现的细胞内普遍存在的一条信号转导通路。细胞外的物理应激因子，如高渗透压、热休克、紫外线以及细胞因子、内毒素脂多糖(LPS)等都能激活该途径，诱导细胞内蛋白质合成与分泌、细胞分化及凋亡等生物效应。p38 MAPK还能与细胞内其他信号通路之间相互作用，是细胞内信号传递系统的交汇点或共同通路。p38 MAPK一旦被激活后，可以使一些转录因子如CREB、转录活化因子-1(activating factor-1， ATF-1)、ATF-2及活化蛋白-1(AP-1)等的丝氨酸和苏氨酸位点磷酸化，活化这些转录因子，从而调节目的基因的表达。CREB作为真核生物组成型核转录因子，与AP-1属同一家族，其上的第133位丝氨酸可被多种蛋白激酶激活，例如蛋白激酶A(PKA)、钙调蛋白、p38 MAPK等。此外，磷酸化的CREB可与结合在含有cAMP反应元件(CRE)位点基因启动子上的CREB或ATF形成异聚体或同聚体，然后调控这些基因的表达。FN的启动子在-170 bp含有CRE，所以激活后的CREB可以结合在这个CRE上，导致FN mRNA表达增强(4)。关于p38 MAPK在DN中的作用，Kang等(5)研究发现，DM大鼠肾小球中p38 MAPK蛋白及其mRNA表达高于对照，但其活性仅在第4周和第8周时升高；随后的报道却表明，p38 MAPK活性仅在4周时升高(6)。Imai 等(7)研究发现，循环血压增高可通过激活p38 MAPK而加重高血压DM大鼠的肾组织损害。我们的研究结果表明，p38 MAPK活性在DM第1周时开始升高，第4周和第8周时达高峰，第12周时与CN组无明显差别；CREB活性在第2周时开始升高，第4周和第8周时达高峰，第12周时降至正常。表明p38 MAPK及CREB活性的升高早于TGF-β1、FN、LN和肥大指数，提示p38 MAPK信号转导通路可能参与了DM大鼠早期肾脏肥大及ECM的形成。研究表明，在人类DN患者和实验性DN模型中，肾皮质TGF-β1 mRNA和蛋白表达增多，它不仅抑制细胞增生，诱导细胞肥大，而且还可以通过刺激ECM中FN、LN及胶原等多种成分合成，减少金属基质蛋白酶的表达以及增加金属基质蛋白酶抑制剂的合成等机制，参与DM肾脏细胞肥大和ECM进行性积聚过程，最终引起肾小球硬化(8)。MAPK信号转导通路是否参与TGF-β1在DN中的表达Hayashida等(9)和Inoki等(10)的研究均已证实，TGF-β1可以激活体外培养的系膜细胞的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和C-Jun N端激酶(JNK)这两条MAPK通路，调节AP-1等转录因子，从而影响胶原合成，促进了ECM合成。而我们的实验结果证明，p38 MAPK可能也参与了DN中TGF-β1的表达，第2周时TGF-β1表达明显上调，而此时p38 MAPK及CREB活性开始升高，推测DM时p38 MAPK通路激活后使转录因子CREB活化，从而影响TGF-β1基因的表达，促进ECM的合成。关于MAPK在正常及病理肾组织中分布的研究报道较少。Omori等(11)对不同发育阶段SD大鼠肾脏中MAPK各亚类分布情况进行观察，发现p38在发育期肾脏呈高表达，出生后表达明显减少，成年时代仅在肾小球皮质脏层、远端肾小管和集合管可见表达。我们首次在单侧肾切除的DM模型中观察了p38 MAPK蛋白表达量及活性变化，而且发现p38 MAPK主要分布在肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞，同时发现近端和远端肾小管上皮也可表达p38 MAPK。国内有学者曾经研究小肠缺血-再灌注后P-p38 MAPK的表达特征，认为免疫组化显色磷酸化的p38主要分布在胞浆中(12)，与我们的结论一致。综上所述，p38 MAPK是DM多种致病因素(高糖、高张力、血管紧张素Ⅱ及其他细胞因子)共同信号通路的交汇点，p38 MAPK参与了DM的发生和发展。但在各种应激因素作用下，p38 MAPK通路的激活只是短暂的，而DM的发生、发展却是一个持续渐进的过程。因此，机制仍需深入研究。
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作者简介：段惠军(1955-)，男(汉族)，河北省石家庄市人，博士后，博士研究生导师，教授。, http://www.100md.com