胎肝胞质液治疗急性肝衰竭实验研究
1济南军区总医院 山东省济南市 250031
2中国人民解放军第二军医大学
项目负责人:孙自勤
收稿日期 1993-05-03 修回日期 1993-08-15
摘 要本研究用D-Gal造成SD大鼠急性肝衰竭，24h后腹腔内注射人胎肝胞质液(FLC)，进 行疗效观察. 结果发现，FLC能显著提高急性肝衰大鼠的存活率；改善肝功能，使血清ALT、GST等肝功指标很快降至正常；刺激肝细胞DNA合成；促进肝组织修复；加速肝内LPO清除；⑥增强红细胞免疫粘附功能. 经-30保存3mo之FLC与新鲜制备FLC作用相近.
主题词 肝功能衰竭，急性/治疗；疾病模型，动物；胎肝胞质液
, http://www.100md.com
Subjects liver failure, acute/therapy; disease model, animal
孙自勤，郭灵芝，汪伟业，肖瑞明.胎肝胞质液治疗急性肝衰竭实验研究.新消化病学杂志，1993;1(4):198-200
0 引言
肝脏具有很强的潜在再生能力，如果采取有效的支持治疗以使其度过危机期，急性肝衰竭的 康复将成为可能. 国内用胎肝细胞悬液治疗急性肝衰取得了较好的疗效[1]. 但是，胎肝细胞悬液在临床上直接应用有诸多不便，如保存、灭菌、过敏反应等问题. 迫切需要用其更为有效的纯化成分加以取代. 目前国内外对用人胎肝细胞内提取物进行实验研究尚不多，而用人胎肝细胞提取物长期保存制品的实验研究未见报告. 本研究旨在解决：人胎肝胞质液(FLC)对D-氨基半乳糖(D-Gal)诱发的急性肝衰竭有无治疗作用，并探讨其作用机制；②经过长期低温保存之FLC是否同样有效.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠，均为♂性，体重170g～220g，由第二军医大学提供.
1.2 主要试剂 D-Gal，重庆医科大学提供，批号890404；甲基3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，上海原子核研究所，比活性10.36MBq/nmol；丙二醛(MDA)；美国Aldrich公司产品；硫代巴比妥酸，上海试剂二厂；还原型谷胱苷肽，上海酵母厂生产.
1.3 主要仪器 MDF-4850荧光分光光度计，日本产；SCR 20 BA高速离心机，日本产；BECKMAN-LS-5000 CE液闪仪，美国产；752紫外分光光度计，日本产.
1.4 FLC制备 4mo～6mo龄水囊产胎儿，在无菌条件下取出肝脏，洗净残血，去除肝包膜，按4倍体积(W/V)蒙 硌嗡谠冉 髂谥瞥稍冉染000g离心(4，20min)，以除去组织碎块，再经2000g离心(4，60min)弃去沉渣，所得上清液即为FLC，蛋白质含量为17.4mg/mL.
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1.5 急性肝衰竭模型 将D-Gal溶于生理盐水，配成5%溶液，给SD大鼠腹腔注射. 1200mg/kg体重为最适致死剂量，使80%大鼠死于急性肝衰竭，但死亡不很快发生，以允许有充分时间接受治疗. 800mg/kg体重为最适亚致死量，动物一般不死，而抽样处死动物见肝内大片状坏死.
1.6 实验过程 用亚致死量D-Gal复制好急性肝衰竭模型后，随机分为3组，于注射D-Gal后24h分别接受如下处理：A组为对照组，每只大鼠腹腔内注射生理盐水5mL；B组腹腔注射-30保存3mo之FLC，5mL/只；C组注射新鲜制备FLC，5mL/只. 各组于上述处理后12h，24h，48h，72h，5d，7d分批处死动物，取血和肝组织标本测定：①血清ALT；肝组织脂质过氧化物(LPO，硫代巴比妥酸荧光法[2]测定标本中LPO代谢产物MDA的含量)；谷胱苷肽S转移酶(GST)[3]；红细胞免疫粘附功能，参照郭峰[4]报告的方法测定尾静脉血红细胞C3b受体花环形成率(RBCC3bRR)肝细胞DNA合成率. 治疗组和对照组各取部分大鼠分别于中毒后48h和72h(治疗后24h和48h)腹腔注射3H-TdR 7.4MBq/100g体重，并取6只正常大鼠作为对照，接受相同处理. 注射3H-TdR后2h处死动物，取肝组织，按我们过去报告的方法[5]测定肝细胞DNA合成率；⑥肝组织病理学检查.
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1.7 动物存活率 按1200mg/kg体重注射D-Gal随机分为3组，每组15只，分别接受上述处理，(A组一生理盐水，5mL/只，IP；B组—冻存FLC，5mL/只，IP；C组—新鲜制备FLC，5mL/只，IP). 每日观察动物存活情况，连续2wk.
1.8 数据处理 各组间ALT，GST，LPO，RBCC3bRR及肝DNA合成率用方差分析，动物存活率用χ2检验.
2 结果
2.1 FLC对动物存活率的影响 如图1所示，A组长期存活率仅为20%，而B组和C组分别为60%和67%(分别为P<0.05和P<0.01).
2.2 对血清ALT的影响 中毒后48h，A组ALT继续维持在高峰，而B，C两组已呈下降趋势. 中毒后4d，A组也开始下降，但两治疗组下降更为明显，与A组比均为P<0.01，见 表1.
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2.3 FLC对血清GST的影响 注射D-Gal后48h，GST升为正常的4.8倍(P<0.01). 两治疗组于注射FLC后d2即明显低于对照组，分别为对照组的63.9%(P<0.01)和72.4%(P<0.01)，见 表2.
2.4 对肝组织LPO的影响 急性肝衰时，肝组织MDA显著高于正常. 于中毒后48h，肝MDA是正常动物的10.8倍，此时两治疗组分别为对照组的73%(P<0.01)和52%(P<0.01)，见 表3.
2.5 对红细胞免疫粘附功能的影响 RBCC3bRR于注射D-Gal后48h即明显受抑，降至正常的38.6%(P<0.01). 以后缓慢上升. 用FLC治疗后，回升速度加快. 治疗后24h，两治疗组均显著高于对照组(P<0.05)，见 表4.
2.6 对肝细胞DNA合成的影响 于D-Gal中毒后48h与72h，两治疗组肝细胞DNA合成率均显著高于对照组(均为P<0.05). 见图2.
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2.7 对肝组织修复的影响 中毒后48h，两治疗组肝组织出现新生细胞条索与团块，而对照组无明显新生. 中毒后72h，治疗组已见不到大片坏死灶，对照组也出现肝细胞新生，但仍有散在小坏死灶，变性较明显. 中毒后d9，治疗组已形成典型小叶结构，肝细胞形态正常，而此时对照组仍有少数浊肿变性与气球样变性.
表1 FLC对血清ALT的影响 (x-±s，U/L)
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注：A-对照组；B-冻存FLC治疗组；C-新鲜制备FLC治疗组；N-正常动物. 括号内为动物数.
表2 FLC对血清GST的影响 (x-±s，IU/L)
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表3 FLC对肝组织MDA的影响 (x-±s，nmol/g)
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表4 FLC对RBCC3bRR的影响 (x-±s，%)
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图1 FLC对动物存活率的影响.?
图2 FLC对肝细胞DNA合成的影响.
3 讨论
本研究发现，给急性肝衰大鼠注射FLC后，大大促进了肝细胞DNA合成速度，使之达到对照组的2.4倍和正常动物的4.7倍. 并且肝组织学检查也发现用FLC治疗后加速了受损肝脏的修复. 提示FLC具有较强的刺激肝细胞再生作用. 促进肝细胞DNA合成可能是FLC抗肝衰竭作用的关键. 已经发现，幼年哺乳动物肝及成年动物再生肝内含有一种肝细胞刺激物(HSS)，该物质在体内外均有明显刺激肝细胞DNA合成作用. 我们也在人胎肝中发现了这种物质[5，6]. FLC刺激肝DNA合成很可能就是HSS的作用. HSS现已被提纯与克隆化[7].我们还发现，肝损伤后肝内LPO大量堆积[8，9]，后者又可以引起肝细胞膜损伤和多种病变，由此而加重了肝细胞坏死. 用FLC治疗后,可以显著地降低体内LPO，提示FLC具有直接或间接地抗LPO作用. 这在FLC治疗肝衰竭作用机制方面也可能是不容忽视的. 此外，我们还探讨了FLC对红细胞免疫粘附功能的影响. 肝衰时，红细胞C3b受体免疫粘附功能明显受抑，随肝功能恢复而缓慢回升,用FLC治疗加速了其回升. 用FLC治疗后红细胞免疫粘附功能增强可能与体内LPO被清除有关,因为后者能抑制红细胞免疫粘附功能[8，9]，红细胞免疫粘附功能增强后，可能又通过一系列作用加速了肝功恢复. 进一步研究发现，经-30保存3mo之FLC仍能显著提高动物生存率、改善肝功能、增强肝DNA合成、加速体内LPO清除. 这就表明，FLC中的有效成分在低温条件下较稳定，可以长期保存. 我们的研究结果表明，FLC克服了胎肝细胞悬液所存在的弊端，而仍具有明显的抗肝衰效果. 但其具体作用机制尚需进一步阐明.
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4 参考文献1 陈成伟，费瑞高，李继强，et al.人胎肝细胞悬液治疗重症肝炎7例报告.中华消化杂志，1987；7：84-86
2 李建武，吴中立.硫代巴比妥酸荧光分测定血清和肝组织脂质过氧化物.第二军医大学学报，1987；8(6)：371-375
3 胡大荣，李梦东，赵风儒.血清谷胱苷肽S转移酶活性测定及其临床意义.中华医学检验杂志，1987；10：266-269
4 郭峰，虞紫茜，赵中平.红细胞免疫粘附功能的初步研究.中华医学杂志，1982；62：715-716
5 孙自勤，汪伟业，肖瑞明，et al.肝生长刺激物的部分纯化及实验研究.第二军医大学学报，1992；13(增刊)：33-36
6 孙自勤，权启镇，汪伟业，et al.肝生长素对急性肝衰竭的影响.山东医药，1993；33(增刊)：17-18
, 百拇医药
7 Michalopoulos GK, Zarnegar R.Hepatocyte growth factor.Hepatology, 1992；15：149-155
8 孙自勤，汪伟业，何建文，et al.大鼠急性肝衰竭时红细胞C 3b受体免疫粘附功能及脂质过氧化物水平动态变化.
上海免疫学杂志，1993；13(4)：待刊
9 孙自勤，郭灵芝，汪伟业，et al.胎肝细胞质液对急性肝功能衰竭大鼠红细胞免疫粘附功能的影响.
新消化病学杂志，1993；1(2)：74-76, http://www.100md.com
2中国人民解放军第二军医大学
项目负责人:孙自勤
收稿日期 1993-05-03 修回日期 1993-08-15
摘 要本研究用D-Gal造成SD大鼠急性肝衰竭，24h后腹腔内注射人胎肝胞质液(FLC)，进 行疗效观察. 结果发现，FLC能显著提高急性肝衰大鼠的存活率；改善肝功能，使血清ALT、GST等肝功指标很快降至正常；刺激肝细胞DNA合成；促进肝组织修复；加速肝内LPO清除；⑥增强红细胞免疫粘附功能. 经-30保存3mo之FLC与新鲜制备FLC作用相近.
主题词 肝功能衰竭，急性/治疗；疾病模型，动物；胎肝胞质液
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Subjects liver failure, acute/therapy; disease model, animal
孙自勤，郭灵芝，汪伟业，肖瑞明.胎肝胞质液治疗急性肝衰竭实验研究.新消化病学杂志，1993;1(4):198-200
0 引言
肝脏具有很强的潜在再生能力，如果采取有效的支持治疗以使其度过危机期，急性肝衰竭的 康复将成为可能. 国内用胎肝细胞悬液治疗急性肝衰取得了较好的疗效[1]. 但是，胎肝细胞悬液在临床上直接应用有诸多不便，如保存、灭菌、过敏反应等问题. 迫切需要用其更为有效的纯化成分加以取代. 目前国内外对用人胎肝细胞内提取物进行实验研究尚不多，而用人胎肝细胞提取物长期保存制品的实验研究未见报告. 本研究旨在解决：人胎肝胞质液(FLC)对D-氨基半乳糖(D-Gal)诱发的急性肝衰竭有无治疗作用，并探讨其作用机制；②经过长期低温保存之FLC是否同样有效.
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1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠，均为♂性，体重170g～220g，由第二军医大学提供.
1.2 主要试剂 D-Gal，重庆医科大学提供，批号890404；甲基3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，上海原子核研究所，比活性10.36MBq/nmol；丙二醛(MDA)；美国Aldrich公司产品；硫代巴比妥酸，上海试剂二厂；还原型谷胱苷肽，上海酵母厂生产.
1.3 主要仪器 MDF-4850荧光分光光度计，日本产；SCR 20 BA高速离心机，日本产；BECKMAN-LS-5000 CE液闪仪，美国产；752紫外分光光度计，日本产.
1.4 FLC制备 4mo～6mo龄水囊产胎儿，在无菌条件下取出肝脏，洗净残血，去除肝包膜，按4倍体积(W/V)蒙 硌嗡谠冉 髂谥瞥稍冉染000g离心(4，20min)，以除去组织碎块，再经2000g离心(4，60min)弃去沉渣，所得上清液即为FLC，蛋白质含量为17.4mg/mL.
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1.5 急性肝衰竭模型 将D-Gal溶于生理盐水，配成5%溶液，给SD大鼠腹腔注射. 1200mg/kg体重为最适致死剂量，使80%大鼠死于急性肝衰竭，但死亡不很快发生，以允许有充分时间接受治疗. 800mg/kg体重为最适亚致死量，动物一般不死，而抽样处死动物见肝内大片状坏死.
1.6 实验过程 用亚致死量D-Gal复制好急性肝衰竭模型后，随机分为3组，于注射D-Gal后24h分别接受如下处理：A组为对照组，每只大鼠腹腔内注射生理盐水5mL；B组腹腔注射-30保存3mo之FLC，5mL/只；C组注射新鲜制备FLC，5mL/只. 各组于上述处理后12h，24h，48h，72h，5d，7d分批处死动物，取血和肝组织标本测定：①血清ALT；肝组织脂质过氧化物(LPO，硫代巴比妥酸荧光法[2]测定标本中LPO代谢产物MDA的含量)；谷胱苷肽S转移酶(GST)[3]；红细胞免疫粘附功能，参照郭峰[4]报告的方法测定尾静脉血红细胞C3b受体花环形成率(RBCC3bRR)肝细胞DNA合成率. 治疗组和对照组各取部分大鼠分别于中毒后48h和72h(治疗后24h和48h)腹腔注射3H-TdR 7.4MBq/100g体重，并取6只正常大鼠作为对照，接受相同处理. 注射3H-TdR后2h处死动物，取肝组织，按我们过去报告的方法[5]测定肝细胞DNA合成率；⑥肝组织病理学检查.
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1.7 动物存活率 按1200mg/kg体重注射D-Gal随机分为3组，每组15只，分别接受上述处理，(A组一生理盐水，5mL/只，IP；B组—冻存FLC，5mL/只，IP；C组—新鲜制备FLC，5mL/只，IP). 每日观察动物存活情况，连续2wk.
1.8 数据处理 各组间ALT，GST，LPO，RBCC3bRR及肝DNA合成率用方差分析，动物存活率用χ2检验.
2 结果
2.1 FLC对动物存活率的影响 如图1所示，A组长期存活率仅为20%，而B组和C组分别为60%和67%(分别为P<0.05和P<0.01).
2.2 对血清ALT的影响 中毒后48h，A组ALT继续维持在高峰，而B，C两组已呈下降趋势. 中毒后4d，A组也开始下降，但两治疗组下降更为明显，与A组比均为P<0.01，见 表1.
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2.3 FLC对血清GST的影响 注射D-Gal后48h，GST升为正常的4.8倍(P<0.01). 两治疗组于注射FLC后d2即明显低于对照组，分别为对照组的63.9%(P<0.01)和72.4%(P<0.01)，见 表2.
2.4 对肝组织LPO的影响 急性肝衰时，肝组织MDA显著高于正常. 于中毒后48h，肝MDA是正常动物的10.8倍，此时两治疗组分别为对照组的73%(P<0.01)和52%(P<0.01)，见 表3.
2.5 对红细胞免疫粘附功能的影响 RBCC3bRR于注射D-Gal后48h即明显受抑，降至正常的38.6%(P<0.01). 以后缓慢上升. 用FLC治疗后，回升速度加快. 治疗后24h，两治疗组均显著高于对照组(P<0.05)，见 表4.
2.6 对肝细胞DNA合成的影响 于D-Gal中毒后48h与72h，两治疗组肝细胞DNA合成率均显著高于对照组(均为P<0.05). 见图2.
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2.7 对肝组织修复的影响 中毒后48h，两治疗组肝组织出现新生细胞条索与团块，而对照组无明显新生. 中毒后72h，治疗组已见不到大片坏死灶，对照组也出现肝细胞新生，但仍有散在小坏死灶，变性较明显. 中毒后d9，治疗组已形成典型小叶结构，肝细胞形态正常，而此时对照组仍有少数浊肿变性与气球样变性.
表1 FLC对血清ALT的影响 (x-±s，U/L)
| 36h | 48h | 72h | 4d | 6d | 8d |
| A(4) 727.5±115.0 | (6)848.7±234.1 | (6)665.3±242.4 | (6)220.8±76.7 | (5)68.8±40.4 | (4)35.8±1.3 |
| B(4) 705.0±287.7 | (6)558.3±301.9 | (6)202.0±164.5 | (6)95.0±71.0 | 5)33.6±6.3 | (4)39.5±5.2 |
| C(4) 700.0±111.7 | (6)495.8±336.6 | (6)197.7±110.3 | (6)76.0±34.4 | (5)44.4±7.1 | (4)35.0±3.7 |
| N(10) 31.1±11.7 | - | - | - | - | - |
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注：A-对照组；B-冻存FLC治疗组；C-新鲜制备FLC治疗组；N-正常动物. 括号内为动物数.
表2 FLC对血清GST的影响 (x-±s，IU/L)
| 48h | 72h | 4d | 6d | 8d |
| A(6)36.2±4.6 | (6)27.5±9.9 | (6)21.0±8.2 | (5)9. 8±4.5 | (5)8.5±2.7 |
| B(6) 23.1±7.0 | (6)12.0±1.5 | (6)12.7±7.5 | (5)9.0±3.1 | (4)7.0±4.2 |
| A(6)26.2±6.0 | (6)11.0±4.6 | (6)10.0±2.7 | (5)6.9±2.7 | (4)7.4±2.3 |
| N(6)7.5±2.6 | - | - | - | - |
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表3 FLC对肝组织MDA的影响 (x-±s，nmol/g)
| 48h | 72h | 4d | 6d | 8d |
| A(6)1716.4±271.2 | (6)1611.8±297.7 | (6)597.7±313.8 | (4)295.5±112.0 | (6)206.6±101.0 |
| B(6)1223.1±160.2 | (6)919.4±274.3 | (6)288.7±101.8 | (5)177.8±74.2 | (6)210.5±138.1 |
| C(6)897.9±346.3 | (6)815.3±212.3 | (6)299.1±85.7 | (5)240.7±69.9 | (6)188.6±71.6 |
| N(11)163.9±45.3 | - | - | - | - |
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表4 FLC对RBCC3bRR的影响 (x-±s，%)
| 48h | 72h | 4d | 6d | 8d |
| A(6)8.3±3.2 | (6)9.8±2.2 | (6)10.8±4.8 | (5)12.0±4.5 | (5)16.2±4.2 |
| B(6)14.8±3.9 | (5)12.6±3.5 | (6)17.2±1.9 | (5)17.6 ±4.2 | (5)19.2±4.1 |
| C(6)15.7±4.3 | (5)13.8±3.6 | (6)19.2±3.3 | (5)19.6±3.7 | (5)19.0±1.6 |
| N(10)21.5±2.6 | - | - | - | - |
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图1 FLC对动物存活率的影响.?
图2 FLC对肝细胞DNA合成的影响.
3 讨论
本研究发现，给急性肝衰大鼠注射FLC后，大大促进了肝细胞DNA合成速度，使之达到对照组的2.4倍和正常动物的4.7倍. 并且肝组织学检查也发现用FLC治疗后加速了受损肝脏的修复. 提示FLC具有较强的刺激肝细胞再生作用. 促进肝细胞DNA合成可能是FLC抗肝衰竭作用的关键. 已经发现，幼年哺乳动物肝及成年动物再生肝内含有一种肝细胞刺激物(HSS)，该物质在体内外均有明显刺激肝细胞DNA合成作用. 我们也在人胎肝中发现了这种物质[5，6]. FLC刺激肝DNA合成很可能就是HSS的作用. HSS现已被提纯与克隆化[7].我们还发现，肝损伤后肝内LPO大量堆积[8，9]，后者又可以引起肝细胞膜损伤和多种病变，由此而加重了肝细胞坏死. 用FLC治疗后,可以显著地降低体内LPO，提示FLC具有直接或间接地抗LPO作用. 这在FLC治疗肝衰竭作用机制方面也可能是不容忽视的. 此外，我们还探讨了FLC对红细胞免疫粘附功能的影响. 肝衰时，红细胞C3b受体免疫粘附功能明显受抑，随肝功能恢复而缓慢回升,用FLC治疗加速了其回升. 用FLC治疗后红细胞免疫粘附功能增强可能与体内LPO被清除有关,因为后者能抑制红细胞免疫粘附功能[8，9]，红细胞免疫粘附功能增强后，可能又通过一系列作用加速了肝功恢复. 进一步研究发现，经-30保存3mo之FLC仍能显著提高动物生存率、改善肝功能、增强肝DNA合成、加速体内LPO清除. 这就表明，FLC中的有效成分在低温条件下较稳定，可以长期保存. 我们的研究结果表明，FLC克服了胎肝细胞悬液所存在的弊端，而仍具有明显的抗肝衰效果. 但其具体作用机制尚需进一步阐明.
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4 参考文献1 陈成伟，费瑞高，李继强，et al.人胎肝细胞悬液治疗重症肝炎7例报告.中华消化杂志，1987；7：84-86
2 李建武，吴中立.硫代巴比妥酸荧光分测定血清和肝组织脂质过氧化物.第二军医大学学报，1987；8(6)：371-375
3 胡大荣，李梦东，赵风儒.血清谷胱苷肽S转移酶活性测定及其临床意义.中华医学检验杂志，1987；10：266-269
4 郭峰，虞紫茜，赵中平.红细胞免疫粘附功能的初步研究.中华医学杂志，1982；62：715-716
5 孙自勤，汪伟业，肖瑞明，et al.肝生长刺激物的部分纯化及实验研究.第二军医大学学报，1992；13(增刊)：33-36
6 孙自勤，权启镇，汪伟业，et al.肝生长素对急性肝衰竭的影响.山东医药，1993；33(增刊)：17-18
, 百拇医药
7 Michalopoulos GK, Zarnegar R.Hepatocyte growth factor.Hepatology, 1992；15：149-155
8 孙自勤，汪伟业，何建文，et al.大鼠急性肝衰竭时红细胞C 3b受体免疫粘附功能及脂质过氧化物水平动态变化.
上海免疫学杂志，1993；13(4)：待刊
9 孙自勤，郭灵芝，汪伟业，et al.胎肝细胞质液对急性肝功能衰竭大鼠红细胞免疫粘附功能的影响.
新消化病学杂志，1993；1(2)：74-76, http://www.100md.com