原位杂交法检测慢性肝病组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA
项目负责人:王要军, 250031, 济南军区总医院消化科
摘要
目的：研究慢性肝病组织Ⅰ，Ⅲ型胶原的基因表达，探讨在不同病理状态下肝组织胶原的细胞来源。
方法：采用同位素标记的探针DNA-mRNA原位杂交方法，检测Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA。
结果：正常肝组织未见杂交信号，慢性肝病组织(包括慢性持续性肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬变、活动性肝硬变)中成纤维细胞、窦周细胞、中央静脉内皮细胞均见Ⅰ，Ⅲ型mRNA杂交信号，肝细胞未见阳性信号。
, 百拇医药
结论：在生理和病理条件下肝细胞均不参与Ⅰ，Ⅲ型胶原合成，在慢性肝病条件下，间质细胞是肝脏胶原的主要来源。
主题词 慢性肝病;原位杂交;胶原;mRNA
王要军, 孙自勤.原位杂交法检测慢性肝病组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA.新消化病学杂志,1994;2(4):219-220
AIM To study the gene expression and cellular source of type Ⅰ and Ⅲ collagens in liver tissue of chronic liver disease (CLD).
METHODS Radioisotope 32P-labeled DNA-mRNA in situ hybridization technique was used to detect type Ⅰ and Ⅲ collagen mRNAs in liver tissue.
, 百拇医药
RESULTS There was no positive hybridized signal in normal liver tissue. Type I and III collagen mRNAs positive signals were found in fibroblasts, sinusoidal cells and central vein endothelial cells in liver tissue of CLD (including chronic persistent hepatitis, chronic active hepatitis, hepatic cirrhosis and active hepatic cirrhosis), but no positive signal was found in hepatocytes.
CONCLUSIONS Hepatocytes did not take part in type Ⅰ and Ⅲ collagen synthesis in physiological and patholog ical conditions.The mesenchymal cells in liver tissue in CLD were the main sources of type Ⅰ and Ⅲ collagens.
, 百拇医药
Keywords chronic liver disease;collagen;mRNA;in situ -hybridization
Wang YJ, Sun ZQ. Detection of type and collagen mRNAs in liver tissuewith chronic liver disease by in situ hybridization. Xin XiaohuabingxueZazhi,1994;2(4):219-220
慢性肝病患者肝组织中胶原过度合成是形成肝纤维化进而肝硬变的病理基础。肝组织中何种细胞参与胶原的合成尚有争议[1]，Milani et al[2]于1990年报道了人纤维化肝组织Ⅰ，Ⅲ,IV型胶原基因转录的细胞定位情况，而慢性肝病组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA的表达未见报道。本文试图用原位杂交技术检测慢性肝病肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA，探讨胶原的细胞来源及其生物学意义。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象 2例正常肝组织取自非肝病死亡者。肝病标本为肝穿标本,男11例，女3例。年龄17岁～51岁，平均31岁。患者血清中HBsAg、抗-HBc, HBeAg至少有1项阳性，部分患者HBV-DNA阳性。病理组织学诊断：慢性持续性肝炎(CPH)3例，慢性活动性肝炎(CAH)6例，肝硬变2例，活动性肝硬变3例。含人Ⅰ，Ⅲ型胶原α1链cDNA质粒大肠杆菌均由Vuorio E博士惠赠[3]。
1.2 方法 细菌经扩增后，采用碱变性法抽提质粒。I型胶原质粒DNA经Pvu Ⅱ 和Pst I内切酶酶切，III型胶原质粒DNA经PstI酶切，低融点琼脂糖回收所需DNA，片段长度分别为0.37kb和0.295kb。DNA经α-32P-dCTP缺口平移标记，放射比活为5×107cPm/μg。原位杂交及阴性对照同我们以前报道[4]。
, 百拇医药
2 结果
Ⅰ，Ⅲ型胶原杂交信号分布是完全一致的，只是在不同组织和细胞内两者阳性强度不同。在2例正常肝组织中仅有均匀一致的散在细银颗粒分布，同阴性对照片。3例CPH中1例，2例肝硬变组织中1例，6例CAH，3例活动性肝硬变组织可见炎症及纤维组织沉积区域成纤维细胞、肝小叶窦周细胞及部分中央静脉内皮细胞胞质内可见Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA阳性杂交信号。毛细血管内皮细胞未见阳性信号。在非活动性肝病组织，Ⅲ型胶原mRNA强于Ⅰ型，而在活动性肝病组织(包括CAH和活动性肝硬变)I型胶原mRNA表达强于Ⅲ型。在同一例组织中以窦周细胞表达明显。阴性对照组织均未见阳性杂交信号。
3 讨论
人们对慢性肝病肝组织中细胞外基质尤其是胶原的研究做了大量工作。虽然目前已发现人类至少有20个基因编码的13种不同类型的胶原，但肝脏仅存Ⅰ，Ⅲ，V，VI型胶原。肝脏狄氏间隙胶原沉积增加，尤其是间质胶原的沉积导致肝窦毛细血管化是形成肝纤维化的分子病理学基础[5]。肝脏间质胶原即Ⅰ，Ⅲ型胶原的细胞来源及其病理生物学意义尚不清楚。很多细胞培养及生化结果都提示无论在生理条件下还是病理条件下肝脏间质细胞及主质细胞均能参与Ⅰ，Ⅲ型胶原的合成，但互相矛盾结果颇多。细胞在分离后易发生表现型改变，且肝细胞培养时常受储脂细胞产物的污染。因此细胞培养结果并非绝对可靠。免疫组织化学及免疫电镜研究结果也不尽一致，但对间质细胞包括成纤维细胞、储脂细胞、窦内皮细胞、枯否细胞等的胶原合成能力几乎无否定结果，争论之焦点仍是肝细胞能否合成胶原。 原位分子杂交方法具有敏感性高，可以在基因水平定位等优点，尤其适用于胶原基因转录的研究。因为胶原mRNA T1/2极短，只有数小时，且不能通过细胞转移到另外的细胞，而胶原蛋白产物T1/2较长，达数月至数年，且胶原蛋白还可因细胞吞噬、运转、技术性因素污染而易位，因此检测胶原mRNA更能体现胶原在体内的合成状态[1]。本结果显示在正常肝组织中无胶原mRNA存在。说明生理状态下肝脏Ⅰ，Ⅲ型胶原基因无表达或表达较弱，致使本方法敏感性相对不足。也可能系标本来源过程中mRNA已降解所致。在肝炎和肝硬变组织胶原mRNA信号明显增强，说明Ⅰ，Ⅲ型胶原代谢旺盛。mRNA主要存在于间质细胞包括成纤维细胞、窦周细胞和中央静脉内皮细胞，这些细胞可能是肝病组织胶原的主要来源，在慢性肝病时肝细胞可能不参与胶原的合成。Milani et al[2]和Saber et al[6]原位杂交研究显示肝小叶内储脂细胞表达胶原mRNA。但光镜下难于鉴别储脂细胞、枯否细胞、窦内皮细胞，它们形态相近且都位于窦周狄氏间隙，需作结蛋白染色才能鉴定储脂细胞。我们认为窦周细胞是胶原的主要来源之一，具体何种细胞尚需进一步研究。有人曾提示肝内Ⅰ型胶原的合成可能是肝病活动的标志[7]，本文非活动性肝病胶原mRNA阳性率40%(2/5例)，活动性肝病阳性率则100%(9/9例)，两者虽明显差别，但并非只在活动性尾〔庞薪涸璵RNA，并不支持胶原合成是肝病活动的标志。我们曾报道胶原基因表达与蛋白合成并不完全一致[8]，因而这一问题需进一步研究。
, 百拇医药
4 参考文献1 王要军，戴益民.肝脏胶原基质的病理学进展.国外医学生理、病理科学与临床分册，1992；12(3)：123-125
2 Milani S, Herbst H, Schuppan D, et al. Cellular localization of type 、Ⅲ, and procollagen gene
transcripts in normal and fibrotic human liver.Am J Pathol, 1990;137(1):59-70
3 Sandberg M, Vuorio E. Localization of type Ⅰ，Ⅲ and IV collagen mRNAsin developing human
, 百拇医药
skeletal tissues by in situ hybridization. J Cell Biol,1987;104(4):1077-1084
4 王要军，杨林森，戴益民. 人原发性肝癌Ⅰ型胶原基因的表达. 临床与实验病理学杂志，1993；9(3)：167-169
5 Burt A. Cellular and molecular aspects of hepatic fibrosis. J Pathol,1993;170(2):105-114
6 Saber M, Novikoff P, Shafritz D. Albumin and collagen mRNA expression in normal and
analbuminemic rodent liver: Analysis by in situ hybridization using biotinylated probes.
J Histochem Cytochem, 1990;58(2):199-207
7 Malizia G, Giannuoli G, Caltagirone M, et al. Procollagen type production by hepatocytes:
A marker of progressive liver disease? Lancet,1987;(8567)：1055-1057
8 王要军，孙自勤，戴益民，等.人肝细胞癌组织Ⅲ型胶原的细胞来源.新消化病学杂志，1994；2(1)：21-22, 百拇医药(王要军,孙自勤)
摘要
目的：研究慢性肝病组织Ⅰ，Ⅲ型胶原的基因表达，探讨在不同病理状态下肝组织胶原的细胞来源。
方法：采用同位素标记的探针DNA-mRNA原位杂交方法，检测Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA。
结果：正常肝组织未见杂交信号，慢性肝病组织(包括慢性持续性肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬变、活动性肝硬变)中成纤维细胞、窦周细胞、中央静脉内皮细胞均见Ⅰ，Ⅲ型mRNA杂交信号，肝细胞未见阳性信号。
, 百拇医药
结论：在生理和病理条件下肝细胞均不参与Ⅰ，Ⅲ型胶原合成，在慢性肝病条件下，间质细胞是肝脏胶原的主要来源。
主题词 慢性肝病;原位杂交;胶原;mRNA
王要军, 孙自勤.原位杂交法检测慢性肝病组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA.新消化病学杂志,1994;2(4):219-220
AIM To study the gene expression and cellular source of type Ⅰ and Ⅲ collagens in liver tissue of chronic liver disease (CLD).
METHODS Radioisotope 32P-labeled DNA-mRNA in situ hybridization technique was used to detect type Ⅰ and Ⅲ collagen mRNAs in liver tissue.
, 百拇医药
RESULTS There was no positive hybridized signal in normal liver tissue. Type I and III collagen mRNAs positive signals were found in fibroblasts, sinusoidal cells and central vein endothelial cells in liver tissue of CLD (including chronic persistent hepatitis, chronic active hepatitis, hepatic cirrhosis and active hepatic cirrhosis), but no positive signal was found in hepatocytes.
CONCLUSIONS Hepatocytes did not take part in type Ⅰ and Ⅲ collagen synthesis in physiological and patholog ical conditions.The mesenchymal cells in liver tissue in CLD were the main sources of type Ⅰ and Ⅲ collagens.
, 百拇医药
Keywords chronic liver disease;collagen;mRNA;in situ -hybridization
Wang YJ, Sun ZQ. Detection of type and collagen mRNAs in liver tissuewith chronic liver disease by in situ hybridization. Xin XiaohuabingxueZazhi,1994;2(4):219-220
慢性肝病患者肝组织中胶原过度合成是形成肝纤维化进而肝硬变的病理基础。肝组织中何种细胞参与胶原的合成尚有争议[1]，Milani et al[2]于1990年报道了人纤维化肝组织Ⅰ，Ⅲ,IV型胶原基因转录的细胞定位情况，而慢性肝病组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA的表达未见报道。本文试图用原位杂交技术检测慢性肝病肝组织Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA，探讨胶原的细胞来源及其生物学意义。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 对象 2例正常肝组织取自非肝病死亡者。肝病标本为肝穿标本,男11例，女3例。年龄17岁～51岁，平均31岁。患者血清中HBsAg、抗-HBc, HBeAg至少有1项阳性，部分患者HBV-DNA阳性。病理组织学诊断：慢性持续性肝炎(CPH)3例，慢性活动性肝炎(CAH)6例，肝硬变2例，活动性肝硬变3例。含人Ⅰ，Ⅲ型胶原α1链cDNA质粒大肠杆菌均由Vuorio E博士惠赠[3]。
1.2 方法 细菌经扩增后，采用碱变性法抽提质粒。I型胶原质粒DNA经Pvu Ⅱ 和Pst I内切酶酶切，III型胶原质粒DNA经PstI酶切，低融点琼脂糖回收所需DNA，片段长度分别为0.37kb和0.295kb。DNA经α-32P-dCTP缺口平移标记，放射比活为5×107cPm/μg。原位杂交及阴性对照同我们以前报道[4]。
, 百拇医药
2 结果
Ⅰ，Ⅲ型胶原杂交信号分布是完全一致的，只是在不同组织和细胞内两者阳性强度不同。在2例正常肝组织中仅有均匀一致的散在细银颗粒分布，同阴性对照片。3例CPH中1例，2例肝硬变组织中1例，6例CAH，3例活动性肝硬变组织可见炎症及纤维组织沉积区域成纤维细胞、肝小叶窦周细胞及部分中央静脉内皮细胞胞质内可见Ⅰ，Ⅲ型胶原mRNA阳性杂交信号。毛细血管内皮细胞未见阳性信号。在非活动性肝病组织，Ⅲ型胶原mRNA强于Ⅰ型，而在活动性肝病组织(包括CAH和活动性肝硬变)I型胶原mRNA表达强于Ⅲ型。在同一例组织中以窦周细胞表达明显。阴性对照组织均未见阳性杂交信号。
3 讨论
人们对慢性肝病肝组织中细胞外基质尤其是胶原的研究做了大量工作。虽然目前已发现人类至少有20个基因编码的13种不同类型的胶原，但肝脏仅存Ⅰ，Ⅲ，V，VI型胶原。肝脏狄氏间隙胶原沉积增加，尤其是间质胶原的沉积导致肝窦毛细血管化是形成肝纤维化的分子病理学基础[5]。肝脏间质胶原即Ⅰ，Ⅲ型胶原的细胞来源及其病理生物学意义尚不清楚。很多细胞培养及生化结果都提示无论在生理条件下还是病理条件下肝脏间质细胞及主质细胞均能参与Ⅰ，Ⅲ型胶原的合成，但互相矛盾结果颇多。细胞在分离后易发生表现型改变，且肝细胞培养时常受储脂细胞产物的污染。因此细胞培养结果并非绝对可靠。免疫组织化学及免疫电镜研究结果也不尽一致，但对间质细胞包括成纤维细胞、储脂细胞、窦内皮细胞、枯否细胞等的胶原合成能力几乎无否定结果，争论之焦点仍是肝细胞能否合成胶原。 原位分子杂交方法具有敏感性高，可以在基因水平定位等优点，尤其适用于胶原基因转录的研究。因为胶原mRNA T1/2极短，只有数小时，且不能通过细胞转移到另外的细胞，而胶原蛋白产物T1/2较长，达数月至数年，且胶原蛋白还可因细胞吞噬、运转、技术性因素污染而易位，因此检测胶原mRNA更能体现胶原在体内的合成状态[1]。本结果显示在正常肝组织中无胶原mRNA存在。说明生理状态下肝脏Ⅰ，Ⅲ型胶原基因无表达或表达较弱，致使本方法敏感性相对不足。也可能系标本来源过程中mRNA已降解所致。在肝炎和肝硬变组织胶原mRNA信号明显增强，说明Ⅰ，Ⅲ型胶原代谢旺盛。mRNA主要存在于间质细胞包括成纤维细胞、窦周细胞和中央静脉内皮细胞，这些细胞可能是肝病组织胶原的主要来源，在慢性肝病时肝细胞可能不参与胶原的合成。Milani et al[2]和Saber et al[6]原位杂交研究显示肝小叶内储脂细胞表达胶原mRNA。但光镜下难于鉴别储脂细胞、枯否细胞、窦内皮细胞，它们形态相近且都位于窦周狄氏间隙，需作结蛋白染色才能鉴定储脂细胞。我们认为窦周细胞是胶原的主要来源之一，具体何种细胞尚需进一步研究。有人曾提示肝内Ⅰ型胶原的合成可能是肝病活动的标志[7]，本文非活动性肝病胶原mRNA阳性率40%(2/5例)，活动性肝病阳性率则100%(9/9例)，两者虽明显差别，但并非只在活动性尾〔庞薪涸璵RNA，并不支持胶原合成是肝病活动的标志。我们曾报道胶原基因表达与蛋白合成并不完全一致[8]，因而这一问题需进一步研究。
, 百拇医药
4 参考文献1 王要军，戴益民.肝脏胶原基质的病理学进展.国外医学生理、病理科学与临床分册，1992；12(3)：123-125
2 Milani S, Herbst H, Schuppan D, et al. Cellular localization of type 、Ⅲ, and procollagen gene
transcripts in normal and fibrotic human liver.Am J Pathol, 1990;137(1):59-70
3 Sandberg M, Vuorio E. Localization of type Ⅰ，Ⅲ and IV collagen mRNAsin developing human
, 百拇医药
skeletal tissues by in situ hybridization. J Cell Biol,1987;104(4):1077-1084
4 王要军，杨林森，戴益民. 人原发性肝癌Ⅰ型胶原基因的表达. 临床与实验病理学杂志，1993；9(3)：167-169
5 Burt A. Cellular and molecular aspects of hepatic fibrosis. J Pathol,1993;170(2):105-114
6 Saber M, Novikoff P, Shafritz D. Albumin and collagen mRNA expression in normal and
analbuminemic rodent liver: Analysis by in situ hybridization using biotinylated probes.
J Histochem Cytochem, 1990;58(2):199-207
7 Malizia G, Giannuoli G, Caltagirone M, et al. Procollagen type production by hepatocytes:
A marker of progressive liver disease? Lancet,1987;(8567)：1055-1057
8 王要军，孙自勤，戴益民，等.人肝细胞癌组织Ⅲ型胶原的细胞来源.新消化病学杂志，1994；2(1)：21-22, 百拇医药(王要军,孙自勤)