PCR检测石蜡切片中HBV DNA
河南医科大学第二附属医院消化内科 河南省郑州市 450003
项目负责人 张亚琳, 450003, 河南省郑州市, 河南医科大学第二附属医院消化内科. 收搞日期 1995-04-28 接收日期 1995-06-14
关键词 肝肿瘤; 肝炎; 乙型肝炎病毒
张亚琳, 崔广林, 李振峰, 职慧军.PCR检测石蜡切片中HBV DNA.新消化病学杂志，1996；4(1)：54-55
目前，PCR检测乙肝病毒DNA多为血清标本，而对肝组织尤其是石蜡包埋组织方面应用报道甚少.我们尝试把此项技术用于检测石蜡包埋组织中HBV DNA，并与血清检测进行了对照研究.
, 百拇医药
1对象和方法
1.1 对象 本文收集我院及外院1991年-1992年肝癌及癌旁组织双份标本27例，慢性肝炎肝穿刺标本20例，并同时抽取患者静脉血2 ml.所选研究对象中，男34例，女13例；年龄24-59岁，平均42.5岁.组织标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋备用.血清标本经常规蛋白酶K消化，酚-氯仿法提取DNA；DNA提取：取蜡块切10 μ m厚切片，常规脱蜡至水，蛋白酶K消化，酚-氯仿法提取DNA，具体步骤参见文献[1].所提取DNA存于-30℃冰箱待测.
1.2 方法 PCR引物由加拿大雷蒙生物公司馈赠，序列如下：5′--TCTCAGCAATGTCAACGACCG(1679-1690)
, 百拇医药
5′--ACTCTATAACTGTTTCTCTTC(2254-2233)扩增片段长度为576bp， Taq酶购自美国(Promega公司).PCR扩增：反应体积50 μ l(含一对引物各20 pmol/L,Taq酶1 U，1 d NTP 0.2 μmol，10 μl 模板)置DNA扩增仪中依94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，进行30个循环，取后72℃ 延伸7 min.扩增产物分析：取20 μ l扩增产物经含溴乙淀的1.2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线检测仪下观察，若出现预期的576bp DNA条带即为阳性，反之为阴性.结果均经两次复核.在DNA提取、扩增过程中，严防污染，并设立阳性及阴性对照.
结果统计学分析： χ2检验.
2 结果
, http://www.100md.com
HBV DNA检出率在肝癌患者血清中为48.2%(13/27)， 在慢性肝炎患者血清中为60%(12/20)，两者比较，P >0.05.HBV DNA检出率在石蜡包埋肝癌组织中为18.5%(5/27)；与血清检出率比较， P <0.025，在石蜡包埋癌旁组织中为37%(10/27)，与血清检出率比较，P >0.05，癌旁与癌组织比较， P >0.05.石蜡包埋肝炎组织检出率为55%(11/20)，与血清检出率比较， P >0.05.与肝癌组织及癌旁组织比较 P <0.01， P >0.05.
3 讨论
HBV在肝内持续存在并复制是慢性肝炎迁延不愈，反复活动的根本原因，同时，其与肝癌的发生也密切相关.在中国，这种相关程度就更为
显著[2].目前对于肝内是否存在HBV，多采用检测血清中有无HBV DNA，或肝组织Southern吸印杂交；但是，血清PCR仅能检出复制的病毒，不能确定肝内整合型的HBV感染，Southern吸收杂交常因肝穿组织在进行病理诊断后，无多余组织供杂交所需，这样，给研究和临床工作带来诸多困难[3].
, 百拇医药
本文检测结果提示：HBV DNA检出率在肝癌组织、癌旁组织、肝炎组织中分别为：18.5%(5/27)，37.0%(10/27)， 55.0%(11/20)，与国内有关研究相近.肝炎组织与肝癌组织相比，P <0.01，与癌旁组织比较，P >0.05.造成差异的原因可能与下列因素有关：肝癌组织中乙型肝炎病毒DNA与宿主细胞DNA整合率高于肝炎组织，肝癌组织中HBV DNA的复制又低于肝炎组织[4]； 故此，肝癌组织中HBV DNA检出率要低于肝炎组织.而癌旁组织中，大多为肝硬变和慢性肝炎组织，故差异不大.通过与血清检测比较发现：肝癌组织HBV DNA检出率低于血清检出率
( P <0.025)，而癌旁组织检出率与血清检出率差异不大，这可能与肝癌组织中HBV DNA复制较低、血清中的HBV DNA主要来源于癌旁组织有关.另一个可能的原因是：石蜡包埋组织中的HBV DNA多断裂为100-500bp的片断，而本文所用引物序列扩增的DNA长度为576bp，故有可能出现漏检，若改变扩增长度，或许可以提高检出率.
, 百拇医药
4 参考文献
1 王俊茹，刘为纹，邓国仁，等.从福尔马林固定、石蜡包埋组织中提取DNA的研究.第三军医大学学报，1993；15(2)：160-164
2 曾维政，楚人俊，蒋明德，等.肝硬变和原发性肝癌血清肝炎病毒标志物分析.中华内科杂志，1993；32(3)：167-170
3 Lampertico P, Malter JS, Colombo M, et al. Detection of hepatitis B virus DNA in formalin-fixed, paraffin-embedded liver tissue by
the polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1990;137(2):253-256
4 何刮，何南洋，刘兰洲，等.原发性肝癌患者癌细胞及癌旁组织HBV DNA及HBV 抗原的定位研究.实用肿瘤杂志，1992；7(1)：16-20, http://www.100md.com(张亚琳, 崔广林,李振峰, 职慧军)
项目负责人 张亚琳, 450003, 河南省郑州市, 河南医科大学第二附属医院消化内科. 收搞日期 1995-04-28 接收日期 1995-06-14
关键词 肝肿瘤; 肝炎; 乙型肝炎病毒
张亚琳, 崔广林, 李振峰, 职慧军.PCR检测石蜡切片中HBV DNA.新消化病学杂志，1996；4(1)：54-55
目前，PCR检测乙肝病毒DNA多为血清标本，而对肝组织尤其是石蜡包埋组织方面应用报道甚少.我们尝试把此项技术用于检测石蜡包埋组织中HBV DNA，并与血清检测进行了对照研究.
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1对象和方法
1.1 对象 本文收集我院及外院1991年-1992年肝癌及癌旁组织双份标本27例，慢性肝炎肝穿刺标本20例，并同时抽取患者静脉血2 ml.所选研究对象中，男34例，女13例；年龄24-59岁，平均42.5岁.组织标本经10%福尔马林固定、石蜡包埋备用.血清标本经常规蛋白酶K消化，酚-氯仿法提取DNA；DNA提取：取蜡块切10 μ m厚切片，常规脱蜡至水，蛋白酶K消化，酚-氯仿法提取DNA，具体步骤参见文献[1].所提取DNA存于-30℃冰箱待测.
1.2 方法 PCR引物由加拿大雷蒙生物公司馈赠，序列如下：5′--TCTCAGCAATGTCAACGACCG(1679-1690)
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5′--ACTCTATAACTGTTTCTCTTC(2254-2233)扩增片段长度为576bp， Taq酶购自美国(Promega公司).PCR扩增：反应体积50 μ l(含一对引物各20 pmol/L,Taq酶1 U，1 d NTP 0.2 μmol，10 μl 模板)置DNA扩增仪中依94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，进行30个循环，取后72℃ 延伸7 min.扩增产物分析：取20 μ l扩增产物经含溴乙淀的1.2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线检测仪下观察，若出现预期的576bp DNA条带即为阳性，反之为阴性.结果均经两次复核.在DNA提取、扩增过程中，严防污染，并设立阳性及阴性对照.
结果统计学分析： χ2检验.
2 结果
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HBV DNA检出率在肝癌患者血清中为48.2%(13/27)， 在慢性肝炎患者血清中为60%(12/20)，两者比较，P >0.05.HBV DNA检出率在石蜡包埋肝癌组织中为18.5%(5/27)；与血清检出率比较， P <0.025，在石蜡包埋癌旁组织中为37%(10/27)，与血清检出率比较，P >0.05，癌旁与癌组织比较， P >0.05.石蜡包埋肝炎组织检出率为55%(11/20)，与血清检出率比较， P >0.05.与肝癌组织及癌旁组织比较 P <0.01， P >0.05.
3 讨论
HBV在肝内持续存在并复制是慢性肝炎迁延不愈，反复活动的根本原因，同时，其与肝癌的发生也密切相关.在中国，这种相关程度就更为
显著[2].目前对于肝内是否存在HBV，多采用检测血清中有无HBV DNA，或肝组织Southern吸印杂交；但是，血清PCR仅能检出复制的病毒，不能确定肝内整合型的HBV感染，Southern吸收杂交常因肝穿组织在进行病理诊断后，无多余组织供杂交所需，这样，给研究和临床工作带来诸多困难[3].
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本文检测结果提示：HBV DNA检出率在肝癌组织、癌旁组织、肝炎组织中分别为：18.5%(5/27)，37.0%(10/27)， 55.0%(11/20)，与国内有关研究相近.肝炎组织与肝癌组织相比，P <0.01，与癌旁组织比较，P >0.05.造成差异的原因可能与下列因素有关：肝癌组织中乙型肝炎病毒DNA与宿主细胞DNA整合率高于肝炎组织，肝癌组织中HBV DNA的复制又低于肝炎组织[4]； 故此，肝癌组织中HBV DNA检出率要低于肝炎组织.而癌旁组织中，大多为肝硬变和慢性肝炎组织，故差异不大.通过与血清检测比较发现：肝癌组织HBV DNA检出率低于血清检出率
( P <0.025)，而癌旁组织检出率与血清检出率差异不大，这可能与肝癌组织中HBV DNA复制较低、血清中的HBV DNA主要来源于癌旁组织有关.另一个可能的原因是：石蜡包埋组织中的HBV DNA多断裂为100-500bp的片断，而本文所用引物序列扩增的DNA长度为576bp，故有可能出现漏检，若改变扩增长度，或许可以提高检出率.
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4 参考文献
1 王俊茹，刘为纹，邓国仁，等.从福尔马林固定、石蜡包埋组织中提取DNA的研究.第三军医大学学报，1993；15(2)：160-164
2 曾维政，楚人俊，蒋明德，等.肝硬变和原发性肝癌血清肝炎病毒标志物分析.中华内科杂志，1993；32(3)：167-170
3 Lampertico P, Malter JS, Colombo M, et al. Detection of hepatitis B virus DNA in formalin-fixed, paraffin-embedded liver tissue by
the polymerase chain reaction. Am J Pathol, 1990;137(2):253-256
4 何刮，何南洋，刘兰洲，等.原发性肝癌患者癌细胞及癌旁组织HBV DNA及HBV 抗原的定位研究.实用肿瘤杂志，1992；7(1)：16-20, http://www.100md.com(张亚琳, 崔广林,李振峰, 职慧军)