肝纤维化大鼠血清有机膦酸酯酶的变化
1济南军区军事医学研究所 山东省济南市 250014
2解放军302医院 3山东医科大学
项目负责人 韩刚毅，250014,山东省济南市,济南军区军事医学研究所 收搞日期 1995-05-02 接收日期 1995-05-19
Alteration of serum phosphonate esterase in liver fibrosis in rats
Gang-Yi Han, Xiao-Hong Jin, Chong-Qi Wu, Hui-Fen Wang and Wun-Jun Liu
, 百拇医药
Jinan Institute of Military Medicine, Jinan 250014 Shangdong Province, China
Abstract
AIMS To study the changes of serum phosphonate esterase and other serum enzymes in experimental liver fibrosis in rats.
METHODS Liver fibrosis model was inducd in SD rats by injection of 40% CCl4, 1.0ml/kg body weight, subscutaneously, twice a week for 14 weeks. The animals were sacrificed in 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 weeks respectively. Serum and liver phosphonate esterase (PE), phosphodiesterase Ⅰ (PDE Ⅰ), alkaline phosphatase (ALP), alanine tranasaminase (ALT), hyaluronate(HA) and glycocholic acid (GC) were detected.
, http://www.100md.com
RESULTS The serum PE, PDE Ⅰ and GC were gradually increased during fibrosis of liver. After 14 weeks of CCl4 injection, the serum PE, PDE Ⅰ activities in fibrosis group were elevated twofold compared with control group.
CONCLUSIONS Serum PE, PDE Ⅰ may be used as new markers for liver fibrosis or cirrhosis.
Subject headings liver cirrhosis/enzymology phosphoric monoester hydrolases/blood phosphoric diester hydrolases/blood
, http://www.100md.com
Han GY, Jin XH, Wu CQ, Wang HF,Liu WJ.Alteration of serum phosphonate esterase in liver fibrosis in rats.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(7)：369-370
摘要
目的 评价血清有机膦酸酯酶(PE)与肝纤维化的联系.
方法 用40% CCl 4 1 ml/kg体重皮下注射，2次/周，共14周诱发SD大鼠肝纤维化，分别于1，2，3，5，7，10和14周处死动物，测定血清和肝组织中PE、磷酸二酯酶Ⅰ(PDEⅠ)、单胺氧化酶(MAO)、结合甘胆酸(CG)、β2-微球蛋白(β2-MG)、透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)等.
, 百拇医药
结果 血清PE、PDEⅠ和CG于染毒后逐渐升高并与肝组织纤维化程度相关，AKP和GPT也升高，但呈不规则变化. MAO，β2-MG，HA和PCⅢ无变化. 肝组织中羟脯氨酸含量增加，其它指标无变化.
结论 血清PE活性与肝纤维化程度密切相关，可用作诊断肝硬变.
主题词 肝硬化/酶学;膦酸单脂水解酶类/血液;膦酸二酯水解酶类/血液
韩刚毅，靳晓红，吴纯启，王慧芬，刘文军.肝纤维化大鼠血清有机膦酸酯酶的变化.新消化病学杂志，1996；4(7)：369-370
作者曾报道，在人血清中存在一种能专一性水解有机膦酸单酯键的酶，命名为“有机膦酸酯酶(phosphonate esterase，PE)”[1].随后又观察到在急慢性肝炎及肝硬变患者血清中PE活性普遍升高.其中肝硬变患者血清PE无论是活性均值增高幅度或患者的阳性例数在所有肝病组中都居首位[2].为证实血清PE活性与肝硬变的关系及其临床诊断价值，作者观察四氯化碳致大鼠肝硬变过程中血清PE和磷酸二酯酶Ⅰ(PDEⅠ)等生化指标变化与肝纤维化进程的关系，报道如下.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠，体重140-200g，随机分成2组，雌雄各半.观察3周后，实验组每周2次皮下注射40% CCl4-花生油溶液0.4g CCl4/kg体重，对照组每周2次注射0.6ml/kg 体重纯花生油.按实验设计的时相点，每次从2组实验动物中各随机抽取6只大鼠断头处死，取0.5g新鲜肝组织在10ml生理盐水中用Tefflon玻璃匀浆器制备匀浆，3500r/min离心15min，吸取上层清液，4℃保存，2d内测定生化指标.对硝基苯酚-5-胸腺嘧啶核苷酸(PNPpT)由美国Sigma公司购得，对硝基苯-N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷由上海科技大学研制.对硝基苯酚苯基膦酸酯(PNPpPh)和4-甲基伞形酮苯基膦酸酯(MupPh)由本室合成[3]，对二甲氨基苯甲醛是上海试剂三厂产品.其它试剂均为市售分析纯.采用美国雅培生物制药公司生产的VP-super-system生化分析仪实施生化实验操作.采用核工业部262厂生产的γ-计数器测定放免定量指标.
, 百拇医药
1.2 方法 PE的测定按本室的方法进行[1].PDEⅠ的活性测定与PE相同，仅将酶底物换成对硝基苯酚-5-胸腺嘧啶核苷酸铵盐(PNPpPT).ALT，ALP和γ-GT-测定是采用中生生化技术试剂公司按照国际临床化学联合会(IFCG)推荐方法配制的成套试剂盒，由上述生化自动分析仪操作.N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)按照本室的微量分析方法进行[4].单胺氧化酶(MAO)采用对胺苄偶氮-β-奈酚显色法.血清中结合甘胆酸(CG)和β2微球蛋白(β2-MG)均采用中国原子能科学研究院生产的放免分析药盒测定.采用重庆肿瘤研究所中心的人Ⅲ型前胶原放射免疫试剂盒(非平衡双抗PEG法)测定大鼠血清中Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的含量[5].采用上海市第二军医大学的放免分析试剂盒(双抗方法)测定血清中透明质酸(HA)含量.血清或组织中的蛋白质含量测定是采用Follin方法，以牛血清白蛋白作标准[6].PE同工酶采用本室的同工酶检测技术，以MupPh为检测底物显示组织或血清中PE同工酶谱[7].
, 百拇医药
病理实验选最大的一叶新鲜肝组织居中横切出约2-3mm厚的薄片，进行HE染色，和苦味酸-酸性品红特殊胶原染色(VG染色).分级判断：0级：无胶原纤维增生.Ⅰ级：肝窦隙或汇管区有少量胶原纤维增生.Ⅱ级：胶原纤维明显增多，有菲薄结缔组织间隙形成，联结汇管区与中央静脉将肝小叶分隔成肝细胞岛， 每100倍视野下不超过5个肝细胞岛.Ⅲ级：(即肝纤维化)胶原纤维显著增多，纤维性间隔明显增厚、增多，将肝小叶分隔成更多更小的肝细胞岛，每100倍视野下超过5个肝细胞岛.
2 结果
2.1 病理变化 对照组无变，实验组表1.
表1 实验组不同周次肝纤维化分级比较
, 百拇医药
2.2 酶活性变化 实验组5周后肝组织中PE和AKP活性略高于相应的对照组，而PDEⅠ，GPT，NAG和γ-GT活性直到第14周仍与对照组相同.肝组织中羟脯氨酸含量呈现进行性增加，至14周时染毒组已超过对照组1倍.①血清PE与PDEⅠ在染毒第3周时血清PE活性出现第1次高峰，随后略下降.至第7周时再次升高，并一直持续到染毒后14周都呈现出逐渐增加趋势.血清PDEⅠ在染毒后的变化过程与PE极相似(图1).②血清ALP和ALT自染毒第2周大鼠血清中ALP活性增加，直到染毒第5周时又下降到对照组水平，7周时又升高，呈现出多峰变化曲线.血清ALT在染毒第1，2，3，5周与对照组无显著性差异.至染毒第7周时出现一个较高的LAT活性峰.酶活性增加到对照组的10倍左右，但随后又下降，至染毒14周仍超过对照组1倍.在整个实验过程中血清ALT和ALP呈现不规则的变化曲线，其变化过程与肝纤维化程度不相关.③血清ANG，γ-GT和MAO在整个动物实验过程中，染毒大鼠血清NAG，γ-GT和MAO活性与对照组无显著差异.
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图1 血清PE和PDEⅠ在大鼠肝纤维化过程中的变化·┈·对照组PE .--.实验组PE▲┈▲对照组PDEⅠ △--△实验组PDEⅠ
2.3 其它生化指标 血清中甘胆酸含量于染毒第3周略有升高，染毒第7周已升高到对照组6倍，到染毒14周时又略有下降，是对照组的3.5倍.血清HA在早期略有升高，随后即恢复.血清中其它指标如PCⅢ、β2-MG含量在染毒组与对照组间无差别.采用7%聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离测定肝纤维化大鼠血清PE的同工酶谱，未发现肝硬变大鼠血清中有新的PE同工酶出现.
3 讨论
肝纤维化大鼠血清NAG，γ-GT，MAO活性及HA和β2-MG含量与对照组无差别.而血清ALP和ALT虽有改变，但变化过程与肝纤维化程度不相关.文献报道，急性肝炎、慢性肝炎及肝硬变患者血清中NAG和HA都有活性增高，并认为，该两项指标可用于诊断肝硬变[8].尚待进一步研究.曾有报道认为检测血清甘胆酸含量对慢性肝炎复发、轻度肝硬变具有一定诊断意义[8].据分析其与肝纤维化造成的肝细胞营养不良，胆汁排泄不畅有关.本实验也见动物肝纤维化时血清甘胆酸升高，此结果与文献报道相符.
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Haugen等[9]曾报道肝硬变患者血清PDEⅠ总活性显著高于正常人或其它肝病患者.并认为该酶有希望用于肝病分类.本结果证实大鼠血清PDEⅠ活性确实与实验性肝纤维化过程有关.并曾证明，当胆汁排泄受阻时可导致血清中PDEⅠ活性显著升高.因而，分析PDEⅠ的上述变化可能与甘胆酸的变化机制相同.一般以肝组织中羟脯氨酸的含量代表胶原含量作为指示肝纤维化程度的指标.本观察肝纤维化时，血清PE在CCl4致肝损伤早期(3周前)轻微升高.在染毒7周后随着肝纤维化病理变化逐渐加重，血清PE与肝组织中羟脯氨酸含量成正比增高，直到肝硬变形成.PE与羟脯氨酸的变化过程及升高幅度都很相似.因而，说明血清PE的活性改变与肝硬变时的胶原形成即肝纤维化的病理变化过程有密切关系.寻找新的无创伤性肝纤维化的临床诊断方法，是当前国内外学者所关注的问题.本结果证实，在慢性肝损伤及肝硬变的发展过程中，血清PE活性显著增高，此结果与临床肝病患者血清PE活性的改变一致.提示，检测血清PE对慢性肝损伤，尤其是肝硬变的诊断有较好的临床应用价值.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Han GY, Fan XH, Ji XB, et al. Specific detection and propeties of enzyme hydrolyzing phosphonate ester in serum.
Clin Chem ,1992;39(3):377-380
2 韩刚毅，王慧芬，靳晓红，等.肝脏疾病时人血清PE和PDEⅠ的活性变化.中国临床医学理论与实践，1991；1(4)：357-360
3 韩刚毅.三种苯基膦酸酯类化合物的合成.化学试剂，1990；12(1)：42-44
4 韩刚毅，王实.人尿PDEⅠ微量检测方法及其性质研究.中国临床医学理论与实践，1991；1(11)：2132-2137
, 百拇医药
5 李伟道.人Ⅲ型前胶原的提取、纯化与抗血清的制备应用于肝纤维化的诊断.重庆医药，1990；3(1)45-49
6 Lowrry OH, Rowebrough NJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the folin phonol reagant. J Biol Chem,1951;193(2)265-273
7 Han GY. The synthesis of 5-iodoindoxyl-3-phenyl-phosphonate and its use in analysis of phosphodiesterase Ⅰ. Anal Biochem,1990;185(2):90-93
8 孙自勤. 肝纤维化血清学诊断进展.临床肝胆病杂志，1993；9(4)：195-177
9 Haugen HF, Ritland S, Blomhoff JP, et al. Usefulness of serum nucleotide pyrophosphatase and phosphodiesterase Ⅰ
activities in classifying liver disease. Clin Chem, 1981;27(8):1392-1396, 百拇医药(韩刚毅1 靳晓红1 吴纯启1 王慧芬2 刘文军3)
2解放军302医院 3山东医科大学
项目负责人 韩刚毅，250014,山东省济南市,济南军区军事医学研究所 收搞日期 1995-05-02 接收日期 1995-05-19
Alteration of serum phosphonate esterase in liver fibrosis in rats
Gang-Yi Han, Xiao-Hong Jin, Chong-Qi Wu, Hui-Fen Wang and Wun-Jun Liu
, 百拇医药
Jinan Institute of Military Medicine, Jinan 250014 Shangdong Province, China
Abstract
AIMS To study the changes of serum phosphonate esterase and other serum enzymes in experimental liver fibrosis in rats.
METHODS Liver fibrosis model was inducd in SD rats by injection of 40% CCl4, 1.0ml/kg body weight, subscutaneously, twice a week for 14 weeks. The animals were sacrificed in 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 weeks respectively. Serum and liver phosphonate esterase (PE), phosphodiesterase Ⅰ (PDE Ⅰ), alkaline phosphatase (ALP), alanine tranasaminase (ALT), hyaluronate(HA) and glycocholic acid (GC) were detected.
, http://www.100md.com
RESULTS The serum PE, PDE Ⅰ and GC were gradually increased during fibrosis of liver. After 14 weeks of CCl4 injection, the serum PE, PDE Ⅰ activities in fibrosis group were elevated twofold compared with control group.
CONCLUSIONS Serum PE, PDE Ⅰ may be used as new markers for liver fibrosis or cirrhosis.
Subject headings liver cirrhosis/enzymology phosphoric monoester hydrolases/blood phosphoric diester hydrolases/blood
, http://www.100md.com
Han GY, Jin XH, Wu CQ, Wang HF,Liu WJ.Alteration of serum phosphonate esterase in liver fibrosis in rats.
Xin Xiaohuabingxue Zazhi,1996；4(7)：369-370
摘要
目的 评价血清有机膦酸酯酶(PE)与肝纤维化的联系.
方法 用40% CCl 4 1 ml/kg体重皮下注射，2次/周，共14周诱发SD大鼠肝纤维化，分别于1，2，3，5，7，10和14周处死动物，测定血清和肝组织中PE、磷酸二酯酶Ⅰ(PDEⅠ)、单胺氧化酶(MAO)、结合甘胆酸(CG)、β2-微球蛋白(β2-MG)、透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)等.
, 百拇医药
结果 血清PE、PDEⅠ和CG于染毒后逐渐升高并与肝组织纤维化程度相关，AKP和GPT也升高，但呈不规则变化. MAO，β2-MG，HA和PCⅢ无变化. 肝组织中羟脯氨酸含量增加，其它指标无变化.
结论 血清PE活性与肝纤维化程度密切相关，可用作诊断肝硬变.
主题词 肝硬化/酶学;膦酸单脂水解酶类/血液;膦酸二酯水解酶类/血液
韩刚毅，靳晓红，吴纯启，王慧芬，刘文军.肝纤维化大鼠血清有机膦酸酯酶的变化.新消化病学杂志，1996；4(7)：369-370
作者曾报道，在人血清中存在一种能专一性水解有机膦酸单酯键的酶，命名为“有机膦酸酯酶(phosphonate esterase，PE)”[1].随后又观察到在急慢性肝炎及肝硬变患者血清中PE活性普遍升高.其中肝硬变患者血清PE无论是活性均值增高幅度或患者的阳性例数在所有肝病组中都居首位[2].为证实血清PE活性与肝硬变的关系及其临床诊断价值，作者观察四氯化碳致大鼠肝硬变过程中血清PE和磷酸二酯酶Ⅰ(PDEⅠ)等生化指标变化与肝纤维化进程的关系，报道如下.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 SD大鼠，体重140-200g，随机分成2组，雌雄各半.观察3周后，实验组每周2次皮下注射40% CCl4-花生油溶液0.4g CCl4/kg体重，对照组每周2次注射0.6ml/kg 体重纯花生油.按实验设计的时相点，每次从2组实验动物中各随机抽取6只大鼠断头处死，取0.5g新鲜肝组织在10ml生理盐水中用Tefflon玻璃匀浆器制备匀浆，3500r/min离心15min，吸取上层清液，4℃保存，2d内测定生化指标.对硝基苯酚-5-胸腺嘧啶核苷酸(PNPpT)由美国Sigma公司购得，对硝基苯-N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷由上海科技大学研制.对硝基苯酚苯基膦酸酯(PNPpPh)和4-甲基伞形酮苯基膦酸酯(MupPh)由本室合成[3]，对二甲氨基苯甲醛是上海试剂三厂产品.其它试剂均为市售分析纯.采用美国雅培生物制药公司生产的VP-super-system生化分析仪实施生化实验操作.采用核工业部262厂生产的γ-计数器测定放免定量指标.
, 百拇医药
1.2 方法 PE的测定按本室的方法进行[1].PDEⅠ的活性测定与PE相同，仅将酶底物换成对硝基苯酚-5-胸腺嘧啶核苷酸铵盐(PNPpPT).ALT，ALP和γ-GT-测定是采用中生生化技术试剂公司按照国际临床化学联合会(IFCG)推荐方法配制的成套试剂盒，由上述生化自动分析仪操作.N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)按照本室的微量分析方法进行[4].单胺氧化酶(MAO)采用对胺苄偶氮-β-奈酚显色法.血清中结合甘胆酸(CG)和β2微球蛋白(β2-MG)均采用中国原子能科学研究院生产的放免分析药盒测定.采用重庆肿瘤研究所中心的人Ⅲ型前胶原放射免疫试剂盒(非平衡双抗PEG法)测定大鼠血清中Ⅲ型前胶原(PCⅢ)的含量[5].采用上海市第二军医大学的放免分析试剂盒(双抗方法)测定血清中透明质酸(HA)含量.血清或组织中的蛋白质含量测定是采用Follin方法，以牛血清白蛋白作标准[6].PE同工酶采用本室的同工酶检测技术，以MupPh为检测底物显示组织或血清中PE同工酶谱[7].
, 百拇医药
病理实验选最大的一叶新鲜肝组织居中横切出约2-3mm厚的薄片，进行HE染色，和苦味酸-酸性品红特殊胶原染色(VG染色).分级判断：0级：无胶原纤维增生.Ⅰ级：肝窦隙或汇管区有少量胶原纤维增生.Ⅱ级：胶原纤维明显增多，有菲薄结缔组织间隙形成，联结汇管区与中央静脉将肝小叶分隔成肝细胞岛， 每100倍视野下不超过5个肝细胞岛.Ⅲ级：(即肝纤维化)胶原纤维显著增多，纤维性间隔明显增厚、增多，将肝小叶分隔成更多更小的肝细胞岛，每100倍视野下超过5个肝细胞岛.
2 结果
2.1 病理变化 对照组无变，实验组表1.
表1 实验组不同周次肝纤维化分级比较
| 级别 | 1周 | 3周 | 5周 | 7周 | 10周 | 14周 |
| 0 | 6 | 2 | 0 | 0 | 0 | |
| Ⅰ | 0 | 4 | 6 | 3 | 0 | 0 |
| Ⅱ | 0 | 0 | 0 | 3 | 3 | 1 |
| Ⅲ | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 5 |
, 百拇医药
2.2 酶活性变化 实验组5周后肝组织中PE和AKP活性略高于相应的对照组，而PDEⅠ，GPT，NAG和γ-GT活性直到第14周仍与对照组相同.肝组织中羟脯氨酸含量呈现进行性增加，至14周时染毒组已超过对照组1倍.①血清PE与PDEⅠ在染毒第3周时血清PE活性出现第1次高峰，随后略下降.至第7周时再次升高，并一直持续到染毒后14周都呈现出逐渐增加趋势.血清PDEⅠ在染毒后的变化过程与PE极相似(图1).②血清ALP和ALT自染毒第2周大鼠血清中ALP活性增加，直到染毒第5周时又下降到对照组水平，7周时又升高，呈现出多峰变化曲线.血清ALT在染毒第1，2，3，5周与对照组无显著性差异.至染毒第7周时出现一个较高的LAT活性峰.酶活性增加到对照组的10倍左右，但随后又下降，至染毒14周仍超过对照组1倍.在整个实验过程中血清ALT和ALP呈现不规则的变化曲线，其变化过程与肝纤维化程度不相关.③血清ANG，γ-GT和MAO在整个动物实验过程中，染毒大鼠血清NAG，γ-GT和MAO活性与对照组无显著差异.
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图1 血清PE和PDEⅠ在大鼠肝纤维化过程中的变化·┈·对照组PE .--.实验组PE▲┈▲对照组PDEⅠ △--△实验组PDEⅠ
2.3 其它生化指标 血清中甘胆酸含量于染毒第3周略有升高，染毒第7周已升高到对照组6倍，到染毒14周时又略有下降，是对照组的3.5倍.血清HA在早期略有升高，随后即恢复.血清中其它指标如PCⅢ、β2-MG含量在染毒组与对照组间无差别.采用7%聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离测定肝纤维化大鼠血清PE的同工酶谱，未发现肝硬变大鼠血清中有新的PE同工酶出现.
3 讨论
肝纤维化大鼠血清NAG，γ-GT，MAO活性及HA和β2-MG含量与对照组无差别.而血清ALP和ALT虽有改变，但变化过程与肝纤维化程度不相关.文献报道，急性肝炎、慢性肝炎及肝硬变患者血清中NAG和HA都有活性增高，并认为，该两项指标可用于诊断肝硬变[8].尚待进一步研究.曾有报道认为检测血清甘胆酸含量对慢性肝炎复发、轻度肝硬变具有一定诊断意义[8].据分析其与肝纤维化造成的肝细胞营养不良，胆汁排泄不畅有关.本实验也见动物肝纤维化时血清甘胆酸升高，此结果与文献报道相符.
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Haugen等[9]曾报道肝硬变患者血清PDEⅠ总活性显著高于正常人或其它肝病患者.并认为该酶有希望用于肝病分类.本结果证实大鼠血清PDEⅠ活性确实与实验性肝纤维化过程有关.并曾证明，当胆汁排泄受阻时可导致血清中PDEⅠ活性显著升高.因而，分析PDEⅠ的上述变化可能与甘胆酸的变化机制相同.一般以肝组织中羟脯氨酸的含量代表胶原含量作为指示肝纤维化程度的指标.本观察肝纤维化时，血清PE在CCl4致肝损伤早期(3周前)轻微升高.在染毒7周后随着肝纤维化病理变化逐渐加重，血清PE与肝组织中羟脯氨酸含量成正比增高，直到肝硬变形成.PE与羟脯氨酸的变化过程及升高幅度都很相似.因而，说明血清PE的活性改变与肝硬变时的胶原形成即肝纤维化的病理变化过程有密切关系.寻找新的无创伤性肝纤维化的临床诊断方法，是当前国内外学者所关注的问题.本结果证实，在慢性肝损伤及肝硬变的发展过程中，血清PE活性显著增高，此结果与临床肝病患者血清PE活性的改变一致.提示，检测血清PE对慢性肝损伤，尤其是肝硬变的诊断有较好的临床应用价值.
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4 参考文献
1 Han GY, Fan XH, Ji XB, et al. Specific detection and propeties of enzyme hydrolyzing phosphonate ester in serum.
Clin Chem ,1992;39(3):377-380
2 韩刚毅，王慧芬，靳晓红，等.肝脏疾病时人血清PE和PDEⅠ的活性变化.中国临床医学理论与实践，1991；1(4)：357-360
3 韩刚毅.三种苯基膦酸酯类化合物的合成.化学试剂，1990；12(1)：42-44
4 韩刚毅，王实.人尿PDEⅠ微量检测方法及其性质研究.中国临床医学理论与实践，1991；1(11)：2132-2137
, 百拇医药
5 李伟道.人Ⅲ型前胶原的提取、纯化与抗血清的制备应用于肝纤维化的诊断.重庆医药，1990；3(1)45-49
6 Lowrry OH, Rowebrough NJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the folin phonol reagant. J Biol Chem,1951;193(2)265-273
7 Han GY. The synthesis of 5-iodoindoxyl-3-phenyl-phosphonate and its use in analysis of phosphodiesterase Ⅰ. Anal Biochem,1990;185(2):90-93
8 孙自勤. 肝纤维化血清学诊断进展.临床肝胆病杂志，1993；9(4)：195-177
9 Haugen HF, Ritland S, Blomhoff JP, et al. Usefulness of serum nucleotide pyrophosphatase and phosphodiesterase Ⅰ
activities in classifying liver disease. Clin Chem, 1981;27(8):1392-1396, 百拇医药(韩刚毅1 靳晓红1 吴纯启1 王慧芬2 刘文军3)