汉防己甲素及维拉帕米对成纤维细胞生长增殖的影响
1上海医科大学病理教研室 200032
2上海第二医科大学附属新华医院消化研究室 200092
刘学松，男，1960-04-06生，河北省乐亭县人，汉族.1982年黑龙江中医学院毕业，学士学位，1986年获医学硕士学位，1994年获医学博士学位，现上海医科大学做博士后，主要从事慢性肝病防治研究，发表论文10篇，编写《中药药理研究方法学》等专著2部.
卫生部青年基金资助项目(No.131932)
项目负责人:上海市医学院路138号
Tel:021-64041900-2533，Fax:021-64039987
, http://www.100md.com 收稿日期:1995-11-20 接受日期: 1995-12-05
Effects of tetrandrine and verapamil on fibroblastic growth and proliferation
Xue-Song Liu, Ding-Guo Li, Han-Ming Lu and Qin-Fang Xu
Research Laboratory of Digestive Diseases, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092, China
AbstractAIM To investigate the mechanism of tetrandrine(Tet) and verapamil(Ver) on liver fibrosis.
, 百拇医药
METHODS Flow cytometry and imaging analysis were used to study the effects of Tet and Ver on fibroblastic proliferation in vitro.
RESULTS Tet and Ver increased the percentages of G1 and G2+M phase in 3T6 fibroblastic cycle (P<0.01), Tet (1.5，2.0μg) reduced RNA content of the fibroblast significantly (P<0.01), and DNA content of the cell was decreased by Ver (15,20μg, P<0.01); protein content of the cell was markedly increased by Tet and Ver.
, http://www.100md.com
CONCLUSION The inhibition of Tet and Ver on fibroblastic growth and proliferation might be responsible for the antifibrotic mechanism.
Subject headings Tetradrine/pharmacology;Verapamil/pharmacology;Fibroblasts/drug effects;Liver cirrhosis/drugtherapy
Liu XS, Li DG, Lu HM,Xu QF.Effects of tetrandrine and verapamil on fibroblastic growth and proliferation.
Xin Xiaohuabingxue,1997；5(2)：82-83
, 百拇医药
摘要
目的 探讨汉防己甲素(Tet)及维拉帕米(Ver)抗肝纤维化的机制.
方法 采用细胞培养、流式细胞术和图像分析法检测Tet及Ver对3T6成纤维细胞增殖的影响.
结果 不同浓度的Tet及Ver可使3T6细胞G1期或G2+M期细胞显著增多(P<0.01)；Tet(1.5，2.0μg)使细胞RNA含量显著下降(P<0.01)；Ver(10，20μg)使细胞DNA含量显著降低(P<0.01)；Tet(1.5，2.0μg)和Ver(5，10μg)均使细胞蛋白质含量显著增加(P<0.01).
结论 Tet及Ver对成纤维细胞的增殖具有抑制作用，可能是抗肝纤维化的机制之一.
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主题词 汉防己甲素/药理学;维拉帕米/药理学;成纤维细胞/药物应用;肝硬化/药物疗法
刘学松,李定国,陆汉明,徐芹芳.汉防己甲素及维拉帕米对成纤维细胞生长增殖的影响.新消化病学杂志,1997；5(2)：82-83
胶原的过度合成和异常沉积是肝纤维化的主要病理过程，而成纤维细胞的增生和分泌大量胶原，则是肝纤维化发生的主要机制之一.我们的研究曾发现，汉防己甲素(Tetrandrine，Tet)可改善大鼠实验性肝纤维化的组织学变化，并降低了肝硬变患者血中PIIIP的含量，显示了抗肝纤维化的作用[1].现应用体外细胞培养，研究Tet、维拉帕米(Verapamil, V er)对成纤维细胞生长增殖的影响，以探讨其抗肝纤维化作用的机制.
1 材料和方法
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1.1 材料 3T6小鼠胚胎成纤维细胞(中科院上海细胞所提供)；Tet(浙江金华制药厂产品)；Ver(Knoll公司产品).
1.2 方法 ①细胞培养：3T6细胞以2.66×104个/ml接种于24孔培养板(Nunclon)，培养孔底衬置盖玻片，用于图像分析仪检测；3T6细胞以8×104个/ml接种于25ml培养瓶，用于流式细胞仪检测.培养基为RPMI 1640(Gibco)含10%小牛血清.细胞贴壁后培养24h，换新鲜培养基并添加不同浓度的Tet(1，1.5，2.0μg/ml)和Ver(5，10，20μg/ml).每一药物浓度孔.细胞经Tet和Ver处理24h后进行检测.吖啶橙(AO)荧光染色，图像分析仪(Vidas)检测细胞DNA，RNA含量：AO荧光染色参照Darzynkiewicz 方法改进[2]，细胞冰浴下75%乙醇固定30min，水洗，加溶液A(0.1% Triton ×-100, 0.08mol/L HCl, 015mol/L NaCl) 15s，加溶液B(120μmol/L AO, 1mmol/L EDTA, 0.15mol/L NaCl，柠檬酸缓冲液pH 6.0)染色10min.荧光显微镜激发光波长为488nm，DNA检测遮挡滤片波长为530nm，RNA检测遮挡滤片为>610nm.每例共随机检测100个细胞.碘化丙啶(PI)和异硫氰荧光素(FITC)染色，流式细胞仪检测细胞周期和细胞总蛋白含量：细胞经胰蛋白酶消化后悬浮打散，75%乙醇固定细胞12h以上；PBS洗细胞2次，调整细胞密度至106个/ml；取细胞悬液，加RNase，15min，FITC(Sigma)，15min，PI(Sigma)，15min，尼龙网过滤，流式细胞仪(Fasc 420)检测.每例检测104个细胞.实验数据处理采用方差分析.
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2 结果
2.1 Tet, Ver对3T6细胞增殖周期的影响 Tet 1.0μg组G1期细胞占整个细胞周期细胞数的百分比，较对照组显著增高(P<0.01)，S期和G2+M期细胞则显著减少(P<0.01).Tet 1.5μg和2.0μg组G2+M期细胞百分比，较对照组显著增高(P<0.01)，G1和S期细胞显著减少(P<0.01). Ver 5μg和20μg组G1期细胞百分比较对照组显著增高(P<0.01)，各组S期细胞显著减少(P<0.05，P<0.01)，Ver 10μg组G2+M期细胞显著增加(P<0.01).
2.2 Tet, Ver对3T6细胞DNA，RNA及蛋白质含量的影响 Tet 1.5μg和2.0μg组细胞RNA含量较对照组显著降低(P<0.01)，蛋白质含量较对照组显著增高(P<0.01).Ver 10μg和20μg组细胞DNA含量较对照组显著降低(P<0.01)；Ver 5μg和10μg组细胞蛋白质含量较对照组显著增加(P<0.01，表1).
, 百拇医药
表1 Tet, Ver对3T6细胞的影响 (x-±s，n=3)
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aP<0.05，bP<0.01，与对照组比较.
3 讨论
研究发现，在G1期和S期之间以及G2期与M期之间存在着影响细胞周期进行的“控制点”.一旦细胞通过了控制点，药物等将不能阻止细胞进入和通过S期或M期.现认为，细胞周期的进行是由一系列的基因及其产物以及生长因子等所调节，药物对细胞周期的影响可能是通过上述环节的影响而实现的[3].本实验中，Tet(1.0μg)，Ver(5，20μg)显著增加了3T6细胞的G1期细胞，但使S期细胞减少，说明它们阻止了细胞由G1期进入S期.适宜的细胞外和细胞内Ca2+浓度对细胞的增殖是必需的，胞浆中Ca2+浓度在G1/S期突发性增加被认为是细胞复制和增殖的原始信号，细胞内G0期过渡为G1期也依赖于细胞内Ca2+池产生的信号[4].Tet和Ver均可阻止Ca2+进入细胞“岗位”，破坏了细胞内外的Ca2+适宜浓度，使细胞受阻于G1期.同时Tet(1.5，2.0μg)， Ver(10μg)还显著增加3?T?6细胞G2+M期细胞.由于有丝分裂是个极短的过程，M期在整个细胞周期中的时间最短，G2+M期细胞的增多是由G2期细胞的增多所引起，说明这些浓度的Tet，Ver阻止了细胞由G2期进入M期.MPF(M_phase promoting factor)对G2/M期的调节具有重要作用，其活性受Ca2+等影响[5].因此，Tet和Ver对3T6细胞G2+M期的影响可能与MPF有关.另外，Tet(1.5,2.0μg)降低了细胞RNA含量，但DNA含量不变，Ver(10，20μg)降低了细胞DNA含量，但RNA无变化，说明DNA和RNA合成具有各自不同的调节系统.蛋白质的合成在整个细胞周期都在进行，至M期含量加倍，与DNA的合成相协调.但Ver (5μg)使细胞蛋白质含量升高，而细胞周期中G1期细胞却增多，出现了细胞的不平衡生长，也是药物影响细胞增殖的一种现象[3].本研究证明，Tet和Ver通过对3T6细胞周期的阻止以及引起的细胞不平衡生长，对其增殖产生了剂量依赖性的抑制作用，这可能是Tet等抗肝纤维化的机制之一.
, 百拇医药
4 参考文献1 权启镇，孙自勤，李定国，等.钙拮抗剂抗肝纤维化的实验与临床研究.新消化病学杂志，1994；2(4)：214-217
2 Darzynkiewicz Z. Differential staining of DNA and RNA in intact cell and isolated cell nuclei with
acridine orange. In: Alan M. Methods in cell biology.Vol. 33. New York; Academic
Press. Inc, 1990:285-298
3 薛少白，张鸿卿，王端顺，等(译).细胞繁殖的生物学.北京：北京师范大学出版社，1985：99-123
, 百拇医药
4 Short AD, Bian J, Chosh TK, et al. Intracellular Ca2+ pool content is linked to control of cell
growth. Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90(11):4986-4990
5 Bement WM, Capco DG. Parallel pathways of cell cycle control during xenopusegg activation.
Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88(12):5172-5176, 百拇医药
2上海第二医科大学附属新华医院消化研究室 200092
刘学松，男，1960-04-06生，河北省乐亭县人，汉族.1982年黑龙江中医学院毕业，学士学位，1986年获医学硕士学位，1994年获医学博士学位，现上海医科大学做博士后，主要从事慢性肝病防治研究，发表论文10篇，编写《中药药理研究方法学》等专著2部.
卫生部青年基金资助项目(No.131932)
项目负责人:上海市医学院路138号
Tel:021-64041900-2533，Fax:021-64039987
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Effects of tetrandrine and verapamil on fibroblastic growth and proliferation
Xue-Song Liu, Ding-Guo Li, Han-Ming Lu and Qin-Fang Xu
Research Laboratory of Digestive Diseases, Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092, China
AbstractAIM To investigate the mechanism of tetrandrine(Tet) and verapamil(Ver) on liver fibrosis.
, 百拇医药
METHODS Flow cytometry and imaging analysis were used to study the effects of Tet and Ver on fibroblastic proliferation in vitro.
RESULTS Tet and Ver increased the percentages of G1 and G2+M phase in 3T6 fibroblastic cycle (P<0.01), Tet (1.5，2.0μg) reduced RNA content of the fibroblast significantly (P<0.01), and DNA content of the cell was decreased by Ver (15,20μg, P<0.01); protein content of the cell was markedly increased by Tet and Ver.
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CONCLUSION The inhibition of Tet and Ver on fibroblastic growth and proliferation might be responsible for the antifibrotic mechanism.
Subject headings Tetradrine/pharmacology;Verapamil/pharmacology;Fibroblasts/drug effects;Liver cirrhosis/drugtherapy
Liu XS, Li DG, Lu HM,Xu QF.Effects of tetrandrine and verapamil on fibroblastic growth and proliferation.
Xin Xiaohuabingxue,1997；5(2)：82-83
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摘要
目的 探讨汉防己甲素(Tet)及维拉帕米(Ver)抗肝纤维化的机制.
方法 采用细胞培养、流式细胞术和图像分析法检测Tet及Ver对3T6成纤维细胞增殖的影响.
结果 不同浓度的Tet及Ver可使3T6细胞G1期或G2+M期细胞显著增多(P<0.01)；Tet(1.5，2.0μg)使细胞RNA含量显著下降(P<0.01)；Ver(10，20μg)使细胞DNA含量显著降低(P<0.01)；Tet(1.5，2.0μg)和Ver(5，10μg)均使细胞蛋白质含量显著增加(P<0.01).
结论 Tet及Ver对成纤维细胞的增殖具有抑制作用，可能是抗肝纤维化的机制之一.
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主题词 汉防己甲素/药理学;维拉帕米/药理学;成纤维细胞/药物应用;肝硬化/药物疗法
刘学松,李定国,陆汉明,徐芹芳.汉防己甲素及维拉帕米对成纤维细胞生长增殖的影响.新消化病学杂志,1997；5(2)：82-83
胶原的过度合成和异常沉积是肝纤维化的主要病理过程，而成纤维细胞的增生和分泌大量胶原，则是肝纤维化发生的主要机制之一.我们的研究曾发现，汉防己甲素(Tetrandrine，Tet)可改善大鼠实验性肝纤维化的组织学变化，并降低了肝硬变患者血中PIIIP的含量，显示了抗肝纤维化的作用[1].现应用体外细胞培养，研究Tet、维拉帕米(Verapamil, V er)对成纤维细胞生长增殖的影响，以探讨其抗肝纤维化作用的机制.
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 3T6小鼠胚胎成纤维细胞(中科院上海细胞所提供)；Tet(浙江金华制药厂产品)；Ver(Knoll公司产品).
1.2 方法 ①细胞培养：3T6细胞以2.66×104个/ml接种于24孔培养板(Nunclon)，培养孔底衬置盖玻片，用于图像分析仪检测；3T6细胞以8×104个/ml接种于25ml培养瓶，用于流式细胞仪检测.培养基为RPMI 1640(Gibco)含10%小牛血清.细胞贴壁后培养24h，换新鲜培养基并添加不同浓度的Tet(1，1.5，2.0μg/ml)和Ver(5，10，20μg/ml).每一药物浓度孔.细胞经Tet和Ver处理24h后进行检测.吖啶橙(AO)荧光染色，图像分析仪(Vidas)检测细胞DNA，RNA含量：AO荧光染色参照Darzynkiewicz 方法改进[2]，细胞冰浴下75%乙醇固定30min，水洗，加溶液A(0.1% Triton ×-100, 0.08mol/L HCl, 015mol/L NaCl) 15s，加溶液B(120μmol/L AO, 1mmol/L EDTA, 0.15mol/L NaCl，柠檬酸缓冲液pH 6.0)染色10min.荧光显微镜激发光波长为488nm，DNA检测遮挡滤片波长为530nm，RNA检测遮挡滤片为>610nm.每例共随机检测100个细胞.碘化丙啶(PI)和异硫氰荧光素(FITC)染色，流式细胞仪检测细胞周期和细胞总蛋白含量：细胞经胰蛋白酶消化后悬浮打散，75%乙醇固定细胞12h以上；PBS洗细胞2次，调整细胞密度至106个/ml；取细胞悬液，加RNase，15min，FITC(Sigma)，15min，PI(Sigma)，15min，尼龙网过滤，流式细胞仪(Fasc 420)检测.每例检测104个细胞.实验数据处理采用方差分析.
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2 结果
2.1 Tet, Ver对3T6细胞增殖周期的影响 Tet 1.0μg组G1期细胞占整个细胞周期细胞数的百分比，较对照组显著增高(P<0.01)，S期和G2+M期细胞则显著减少(P<0.01).Tet 1.5μg和2.0μg组G2+M期细胞百分比，较对照组显著增高(P<0.01)，G1和S期细胞显著减少(P<0.01). Ver 5μg和20μg组G1期细胞百分比较对照组显著增高(P<0.01)，各组S期细胞显著减少(P<0.05，P<0.01)，Ver 10μg组G2+M期细胞显著增加(P<0.01).
2.2 Tet, Ver对3T6细胞DNA，RNA及蛋白质含量的影响 Tet 1.5μg和2.0μg组细胞RNA含量较对照组显著降低(P<0.01)，蛋白质含量较对照组显著增高(P<0.01).Ver 10μg和20μg组细胞DNA含量较对照组显著降低(P<0.01)；Ver 5μg和10μg组细胞蛋白质含量较对照组显著增加(P<0.01，表1).
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表1 Tet, Ver对3T6细胞的影响 (x-±s，n=3)
| 药物 | (μg/ml) | G1(%) | S(%) | G2+M(%) | 蛋白质 | DNA | RNA |
| Tet | 0.0 | 61.3±2.2 | 27.9±1.6 | 10.7±0.7 | 352±27 | 67.8±9.9 | 47.1±1.4 |
| 1.0 | 82.9±0.3b | 9.5±0.3b | 7.6±0.2b | 432±68 | 81.8±11.6 | 46.6±1.6 | |
| 1.5 | 51.6±1.7b | 13.9±2.3b | 34.6±0.8b | 566±20b | 57.9±8.2 | 41.7±1.6b | |
| 2.0 | 52.6±2.6b | 17.9±3.8b | 29.6±1.3b | 543±28b | 66.6±10.1 | 40.5±0.3b | |
| Ver | 0.0 | 52.3±1.6 | 31.4±2.1 | 15.7±2.5 | 1197±50 | 69.6±1.7 | 30.3±1.1 |
| 5.0 | 70.8±3.3b | 11.5±2.0b | 17.6±2.7 | 1553±47b | 64.4±5.0 | 31.9±0.7 | |
| 10.0 | 48.3±2.0 | 27.0±1.9a | 24.8±0.6b | 1779±88b | 55.1±4.8b | 30.4±1.3 | |
| 20.0 | 75.0±1.2b | 7.4±1.6b | 17.6±1.1 | — | 43.5±3.5b | 29.3±0.8 |
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aP<0.05，bP<0.01，与对照组比较.
3 讨论
研究发现，在G1期和S期之间以及G2期与M期之间存在着影响细胞周期进行的“控制点”.一旦细胞通过了控制点，药物等将不能阻止细胞进入和通过S期或M期.现认为，细胞周期的进行是由一系列的基因及其产物以及生长因子等所调节，药物对细胞周期的影响可能是通过上述环节的影响而实现的[3].本实验中，Tet(1.0μg)，Ver(5，20μg)显著增加了3T6细胞的G1期细胞，但使S期细胞减少，说明它们阻止了细胞由G1期进入S期.适宜的细胞外和细胞内Ca2+浓度对细胞的增殖是必需的，胞浆中Ca2+浓度在G1/S期突发性增加被认为是细胞复制和增殖的原始信号，细胞内G0期过渡为G1期也依赖于细胞内Ca2+池产生的信号[4].Tet和Ver均可阻止Ca2+进入细胞“岗位”，破坏了细胞内外的Ca2+适宜浓度，使细胞受阻于G1期.同时Tet(1.5，2.0μg)， Ver(10μg)还显著增加3?T?6细胞G2+M期细胞.由于有丝分裂是个极短的过程，M期在整个细胞周期中的时间最短，G2+M期细胞的增多是由G2期细胞的增多所引起，说明这些浓度的Tet，Ver阻止了细胞由G2期进入M期.MPF(M_phase promoting factor)对G2/M期的调节具有重要作用，其活性受Ca2+等影响[5].因此，Tet和Ver对3T6细胞G2+M期的影响可能与MPF有关.另外，Tet(1.5,2.0μg)降低了细胞RNA含量，但DNA含量不变，Ver(10，20μg)降低了细胞DNA含量，但RNA无变化，说明DNA和RNA合成具有各自不同的调节系统.蛋白质的合成在整个细胞周期都在进行，至M期含量加倍，与DNA的合成相协调.但Ver (5μg)使细胞蛋白质含量升高，而细胞周期中G1期细胞却增多，出现了细胞的不平衡生长，也是药物影响细胞增殖的一种现象[3].本研究证明，Tet和Ver通过对3T6细胞周期的阻止以及引起的细胞不平衡生长，对其增殖产生了剂量依赖性的抑制作用，这可能是Tet等抗肝纤维化的机制之一.
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4 参考文献1 权启镇，孙自勤，李定国，等.钙拮抗剂抗肝纤维化的实验与临床研究.新消化病学杂志，1994；2(4)：214-217
2 Darzynkiewicz Z. Differential staining of DNA and RNA in intact cell and isolated cell nuclei with
acridine orange. In: Alan M. Methods in cell biology.Vol. 33. New York; Academic
Press. Inc, 1990:285-298
3 薛少白，张鸿卿，王端顺，等(译).细胞繁殖的生物学.北京：北京师范大学出版社，1985：99-123
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4 Short AD, Bian J, Chosh TK, et al. Intracellular Ca2+ pool content is linked to control of cell
growth. Proc Natl Acad Sci USA, 1993;90(11):4986-4990
5 Bement WM, Capco DG. Parallel pathways of cell cycle control during xenopusegg activation.
Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88(12):5172-5176, 百拇医药