烧伤血清对人肝细胞粘弹性的影响
第三军医大学西南医院烧伤研究所 重庆市 400038
王晓军，男，1963-07-03生，山西省寿阳县人，汉族. 1987年第三军医大学毕业，外科主治医师，主要从事多脏器功能衰竭的研究.
项目负责人 王晓军，400038，重庆市，第三军医大学西南医院烧伤研究所，重庆市沙坪坝高滩岩正街1号.
基金资助 国家自然科学基金资助项目，No.39290700-03.*Preject Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39290700-03.
Correspondence to Xiao-Jun Wang, Burn Research Institute, South Hospital, Third Military Medical University, 1 Gaotan Yanjie, Shapingba, Chongqing 400038, China
, http://www.100md.com
Tel. +86·23·68754148
收稿日期 1997-10-18
Effects of sera from burn patients on human hepatocytic viscoelasticity
Xiao-Jun Wang, Xiang-Dong Luo, Qin Luo and Zong-Cheng Yang
Burn Research Institute, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract
, 百拇医药
AIM To study the subcellular changes of human hepatocytic cytoskeleton induced by sera from burn patients.
METHODS In vitro culture of human hepatocytes and cellular mechanics (micropipette aspiration) was employed to dynamically observe the effects of the sera from burn patients on the changes of cultured hepatocytes exhibited by sera hepatocytic enzymes and viscoelasticity.
RESULTS The burn sera could directly injure the hepatocytes, and the injury degree was exacerbated along with the prolonged culture time [from 1h to 24h, AST(U/L): 120±41，146±33，167±21，217±12，P<001；ALT(U/L): 22±04，30±05，37±03，41±06，P<005 and P<001；LDH(U/L): 326±73，401±107，604±166，703±183，P<001]. The viscoelasticity increased significantly two hours after the culture, while the rigidity increased simultaneously, which coincided with the release of hepatic enzymes due to hepatocytic injury [K1(N/m2): 384±46，K2(N/m2): 282±32，U(N.s/m2): 98±11，P<001].
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CONCLUSION The burn sera can directly injure hepatocytes and induce the release of hepatocytic enzymes, and the effect was exacerbated along with time. The injury process of burn sera to hepatocytes examined by biological mechanics exhibited development of injury following prior activation, which cannot be expressed by the changes of hepatocytic enzymes.
Wang XJ, Luo XD, Luo Q, Yang ZC. Effects of sera from burn patients on human hepatocytic viscoelasticity.
, 百拇医药
Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6(1):13-14
Subject headings burns/pathology; immune sera; liver/pathology
摘要
目的 烧伤血清影响人肝细胞亚细胞水平的细胞骨架变化的力学研究.
方法 应用体外人肝细胞的培养和细胞力学(微管吸吮技术)动态观察了烧伤患者(50%以上，Ⅱ～Ⅲ度)血清对肝细胞损伤的酶学变化和粘弹性
的变化.
结果 烧伤血清对肝细胞有直接损伤作用，且随培养时间的延长损伤加重(从1h到24h四个时相点，AST(U/L)分别为12.0±4.1，14.6±3.3，16.7±2.1，21.7±1.2，P<0.01；ALT(U/L)分别为2.2±0.4，3.0±0.5，3.7±0.3，4.1±0.6，P<0.05和P<0.01；LDH(U/L)分别为32.6±7.3，40.1±10.7，60.4±16.6，70.3±18.3，P<0.01). 肝细胞粘弹性的变化，烧伤血清作用2h粘弹性明显增加[K-1(N/m-2)：384±46，K-2(N/m-2)：282±32，U(N.s/m-2)：98±11，P<0.01]，从6h开始到24h肝细胞粘弹性降低，刚性增加，这和肝细胞损伤后酶的变化一致.
, 百拇医药
结论 烧伤血清直接损伤肝细胞，引起酶释放并随作用时间的延长而增加；生物力学技术检测烧伤血清对肝细胞的损伤过程有一个先激活后损伤的过程，这个现象用酶的变化是无法反应出来的.
主题词 烧伤/病理学；免疫血清；肝/病理学
王晓军, 罗向东, 罗勤, 杨宗城. 烧伤血清对人肝细胞粘弹性的影响. 华人消化杂志, 1998;6(1):13-14
0 引言
严重烧伤后肝脏是最先受损的脏器，主要是对肝细胞的损伤，肝细胞损伤的研究以前通过胞质释放酶的变化来反应，但对其亚细胞水平的细胞膜及其骨架的改变研究甚少，而其细胞骨架的改变是细胞受损的重要原因. 作者应用体外人肝细胞的培养和细胞力学(微管吸吮技术)动态观察了烧伤患者(50%以上，Ⅱ～Ⅲ度)血清对肝细胞损伤的酶变化和粘弹性的变化及其相关性的研究，为烧伤血清直接损伤肝细胞在亚细胞水平提供依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①人肝细胞培养[1]：从外伤致死的患者中获得肝细胞，采用离体灌注，胶原酶Ⅳ型消化，用不同的离心速度将肝细胞分离纯化，用1640合成培养基(含100g/L的人AB血清)以2×108/L接种于六孔培养板中，在37℃，50ml/L CO2孵箱内培养，培养4d开始实验. ②烧伤患者烧伤血清：从50%以上Ⅱ～Ⅲ度烧伤患者，在伤后48h内抽血分离血清，56℃ 30min灭活补体制成20%的烧伤血清1640合成培养液.
1.2 方法 ①肝细胞粘弹性的测定：培养4d的肝细胞，用胶原酶消化2min～3min，将附壁的细胞游离，放入特制的培养腔中，分正常对照组和烧伤血清作用组，以孵育1，2，6，12，24h，用微管吸吮系统测定每个细胞的变形情况，用数学模型计算出K1,K2, U的变化[2]. ②肝细胞培养液中AST，ALT，LDH测定：正常对照组和烧伤血清作用组均分为1，2，12，24h 4个时相点，用本院检验科Beckman CX7全自动生化分析仪测定.
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统计学处理以均值±标准误(x-±s)表示，采用t检验.
2 结果
2.1 烧伤血清对肝细胞的影响 烧伤血清直接对肝细胞有损伤作用，且随培养时间的延长损伤加重(表1).
2.2 肝细胞粘弹性的变化 表2.
表1 肝细胞培养液中AST，ALT，LDH的变化 (x-±s, n=10)
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aP<0.05，bP<0.01，vs 正常对照组.
表2 肝细胞粘弹性的变化 (x-±s,n=20)
, http://www.100md.com
aP<0.05，bP<0.01，vs 正常对照组.
3 讨论
烧伤血清对多种组织细胞均有损伤作用[3]. 烧伤血清是含有烧伤后多种毒性成分的、较接近活体上的多因素损伤，对肝细胞的损伤主要是其毒性成分干扰细胞膜正常功能，使胞浆内释放AST，ALT，LDH. 本结果看出，随烧伤血清作用时间的延长，三种酶释放增加，说明肝细胞损伤加重.
微管吸吮技术是一种评价单个细胞或细胞对变形或粘附特性的重要手段，它通过测量在一定负压作用下，细胞的变形过程或细胞间的临界粘附力值，用于阐明细胞的力学性质和细胞间相互作用. 肝细胞是具有丰富的细胞器，可以产生大量的酶，用于消化系统和发挥解毒功能，而大量的酶则反应肝细胞内质网系统具有量大、活性高的特点，正常肝细胞具有较高的粘弹性，且其特性与白细胞非常相似，所以我们参照Sung et al[4]和龙勉 et al[2]有关白细胞粘弹性的实验结果和理论分析，选用标准线性固定模型拟合肝细胞变形的实验数据. 该模型由两条平行的“臂”组成，其中一“臂”为弹性系数K1的弹性元件，另一“臂”则由弹性系数K2的弹性元件与弹性系数为U的粘性元件串联而成. 弹性系数K1与K2与时间无关， 主要反应细胞的初始变形速度，粘性系数U反应了时间的依赖性，而U和两个弹性系数的组合可以反应细胞的蠕变速度.
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从实验结果看烧伤血清作用2h后，其K1，K2，U和正常对照组相比明显减小，说明烧伤血清作用2h肝细胞的粘弹性明显增加，造成这种情况的原因是烧伤血清在2h内对肝细胞有激活作用，反应细胞粘弹性的细胞骨架(主要是细胞膜、微管、微丝和中间丝等)受到烧伤血清的激活，造成了细胞粘弹性增加. 从6h开始到24h，K1、K2、U均高于正常对照组，细胞粘弹性降低、刚性增加，这和肝细胞损伤酶的释放相一致，原因是一方面由于烧伤血清直接对细胞骨架的损伤加重，另一方面是肝细胞内酶的释放影响了细胞的粘弹性.
4 参考文献
1 王晓军，罗向东，罗勤，杨宗城. 人肝细胞和肝窦内皮细胞的分离和培养. 第三军医大学学报，1996；16(5)：379-380
, 百拇医药 2 龙勉，王宪航，吴云鹏，吴泽志.肝癌细胞粘弹性实验研究.生物物理理学报，1996；3(12)：169-171
3 罗向东，杨宗城，黎鳌，罗勤. 家兔烧伤早期内脏血管内皮细胞损伤的变化. 第三军医大学学报，1995；17(4)：279-282
4 Sung KL, Kuhlman P, Madldomado F, Lollo BA, Chien S, Brian AA. Force contribution of IFA-1/ICAM-1 complex to T cell adhesion.
J Cell Science, 1992;103(1):259-266, 百拇医药(王晓军 罗向东 罗勤 杨宗城)
王晓军，男，1963-07-03生，山西省寿阳县人，汉族. 1987年第三军医大学毕业，外科主治医师，主要从事多脏器功能衰竭的研究.
项目负责人 王晓军，400038，重庆市，第三军医大学西南医院烧伤研究所，重庆市沙坪坝高滩岩正街1号.
基金资助 国家自然科学基金资助项目，No.39290700-03.*Preject Supported by the National Natural Science Foundation of China, No.39290700-03.
Correspondence to Xiao-Jun Wang, Burn Research Institute, South Hospital, Third Military Medical University, 1 Gaotan Yanjie, Shapingba, Chongqing 400038, China
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Tel. +86·23·68754148
收稿日期 1997-10-18
Effects of sera from burn patients on human hepatocytic viscoelasticity
Xiao-Jun Wang, Xiang-Dong Luo, Qin Luo and Zong-Cheng Yang
Burn Research Institute, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Abstract
, 百拇医药
AIM To study the subcellular changes of human hepatocytic cytoskeleton induced by sera from burn patients.
METHODS In vitro culture of human hepatocytes and cellular mechanics (micropipette aspiration) was employed to dynamically observe the effects of the sera from burn patients on the changes of cultured hepatocytes exhibited by sera hepatocytic enzymes and viscoelasticity.
RESULTS The burn sera could directly injure the hepatocytes, and the injury degree was exacerbated along with the prolonged culture time [from 1h to 24h, AST(U/L): 120±41，146±33，167±21，217±12，P<001；ALT(U/L): 22±04，30±05，37±03，41±06，P<005 and P<001；LDH(U/L): 326±73，401±107，604±166，703±183，P<001]. The viscoelasticity increased significantly two hours after the culture, while the rigidity increased simultaneously, which coincided with the release of hepatic enzymes due to hepatocytic injury [K1(N/m2): 384±46，K2(N/m2): 282±32，U(N.s/m2): 98±11，P<001].
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CONCLUSION The burn sera can directly injure hepatocytes and induce the release of hepatocytic enzymes, and the effect was exacerbated along with time. The injury process of burn sera to hepatocytes examined by biological mechanics exhibited development of injury following prior activation, which cannot be expressed by the changes of hepatocytic enzymes.
Wang XJ, Luo XD, Luo Q, Yang ZC. Effects of sera from burn patients on human hepatocytic viscoelasticity.
, 百拇医药
Huaren Xiaohua Zazhi, 1998;6(1):13-14
Subject headings burns/pathology; immune sera; liver/pathology
摘要
目的 烧伤血清影响人肝细胞亚细胞水平的细胞骨架变化的力学研究.
方法 应用体外人肝细胞的培养和细胞力学(微管吸吮技术)动态观察了烧伤患者(50%以上，Ⅱ～Ⅲ度)血清对肝细胞损伤的酶学变化和粘弹性
的变化.
结果 烧伤血清对肝细胞有直接损伤作用，且随培养时间的延长损伤加重(从1h到24h四个时相点，AST(U/L)分别为12.0±4.1，14.6±3.3，16.7±2.1，21.7±1.2，P<0.01；ALT(U/L)分别为2.2±0.4，3.0±0.5，3.7±0.3，4.1±0.6，P<0.05和P<0.01；LDH(U/L)分别为32.6±7.3，40.1±10.7，60.4±16.6，70.3±18.3，P<0.01). 肝细胞粘弹性的变化，烧伤血清作用2h粘弹性明显增加[K-1(N/m-2)：384±46，K-2(N/m-2)：282±32，U(N.s/m-2)：98±11，P<0.01]，从6h开始到24h肝细胞粘弹性降低，刚性增加，这和肝细胞损伤后酶的变化一致.
, 百拇医药
结论 烧伤血清直接损伤肝细胞，引起酶释放并随作用时间的延长而增加；生物力学技术检测烧伤血清对肝细胞的损伤过程有一个先激活后损伤的过程，这个现象用酶的变化是无法反应出来的.
主题词 烧伤/病理学；免疫血清；肝/病理学
王晓军, 罗向东, 罗勤, 杨宗城. 烧伤血清对人肝细胞粘弹性的影响. 华人消化杂志, 1998;6(1):13-14
0 引言
严重烧伤后肝脏是最先受损的脏器，主要是对肝细胞的损伤，肝细胞损伤的研究以前通过胞质释放酶的变化来反应，但对其亚细胞水平的细胞膜及其骨架的改变研究甚少，而其细胞骨架的改变是细胞受损的重要原因. 作者应用体外人肝细胞的培养和细胞力学(微管吸吮技术)动态观察了烧伤患者(50%以上，Ⅱ～Ⅲ度)血清对肝细胞损伤的酶变化和粘弹性的变化及其相关性的研究，为烧伤血清直接损伤肝细胞在亚细胞水平提供依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 ①人肝细胞培养[1]：从外伤致死的患者中获得肝细胞，采用离体灌注，胶原酶Ⅳ型消化，用不同的离心速度将肝细胞分离纯化，用1640合成培养基(含100g/L的人AB血清)以2×108/L接种于六孔培养板中，在37℃，50ml/L CO2孵箱内培养，培养4d开始实验. ②烧伤患者烧伤血清：从50%以上Ⅱ～Ⅲ度烧伤患者，在伤后48h内抽血分离血清，56℃ 30min灭活补体制成20%的烧伤血清1640合成培养液.
1.2 方法 ①肝细胞粘弹性的测定：培养4d的肝细胞，用胶原酶消化2min～3min，将附壁的细胞游离，放入特制的培养腔中，分正常对照组和烧伤血清作用组，以孵育1，2，6，12，24h，用微管吸吮系统测定每个细胞的变形情况，用数学模型计算出K1,K2, U的变化[2]. ②肝细胞培养液中AST，ALT，LDH测定：正常对照组和烧伤血清作用组均分为1，2，12，24h 4个时相点，用本院检验科Beckman CX7全自动生化分析仪测定.
, http://www.100md.com
统计学处理以均值±标准误(x-±s)表示，采用t检验.
2 结果
2.1 烧伤血清对肝细胞的影响 烧伤血清直接对肝细胞有损伤作用，且随培养时间的延长损伤加重(表1).
2.2 肝细胞粘弹性的变化 表2.
表1 肝细胞培养液中AST，ALT，LDH的变化 (x-±s, n=10)
| 指标 | 分 组 | 1h | 2h | 12h | 24h |
| AST | 正常对照组 | 3.0±0.6 | 3.2±1.1 | 3.7±1.4 | 10.8±1.6 |
| 烧伤血清作用组 | 12.0±4.1b | 14.6±3.3b | 16.7±2.1b | 21.7±2.2b | |
| ALT | 正常对照组 | 1.2±0.3 | 1.0±0.3 | 1.3±0.6 | 2.2±0.4 |
| 烧伤血清作用组 | 2.2±0.4a | 2.9±0.5b | 3.7±0.3b | 4.1±0.6b | |
| LDH | 正常对照组 | 5.0±0.9 | 15.8±4.3 | 21.2±7.5 | 31.5±1.7 |
| 烧伤血清作用组 | 32.6±7.3b | 40.1±10.7b | 60.4±16.6b | 70.3±18.6b |
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aP<0.05，bP<0.01，vs 正常对照组.
表2 肝细胞粘弹性的变化 (x-±s,n=20)
| 指标 | 0h | 1h | 2h | 6h | 12h | 24h |
| K1(N/m2) | 622±81 | 624±84 | 384±46b | 729±110a | 849±129a | 946±137b |
| K2(N/m2) | 484±58 | 493±46 | 283±33b | 535±40a | 525±53a | 628±82a |
| U(N/m2) | 288±34 | 274±37 | 98±11b | 426±59a | 448±53a | 526±60b |
, http://www.100md.com
aP<0.05，bP<0.01，vs 正常对照组.
3 讨论
烧伤血清对多种组织细胞均有损伤作用[3]. 烧伤血清是含有烧伤后多种毒性成分的、较接近活体上的多因素损伤，对肝细胞的损伤主要是其毒性成分干扰细胞膜正常功能，使胞浆内释放AST，ALT，LDH. 本结果看出，随烧伤血清作用时间的延长，三种酶释放增加，说明肝细胞损伤加重.
微管吸吮技术是一种评价单个细胞或细胞对变形或粘附特性的重要手段，它通过测量在一定负压作用下，细胞的变形过程或细胞间的临界粘附力值，用于阐明细胞的力学性质和细胞间相互作用. 肝细胞是具有丰富的细胞器，可以产生大量的酶，用于消化系统和发挥解毒功能，而大量的酶则反应肝细胞内质网系统具有量大、活性高的特点，正常肝细胞具有较高的粘弹性，且其特性与白细胞非常相似，所以我们参照Sung et al[4]和龙勉 et al[2]有关白细胞粘弹性的实验结果和理论分析，选用标准线性固定模型拟合肝细胞变形的实验数据. 该模型由两条平行的“臂”组成，其中一“臂”为弹性系数K1的弹性元件，另一“臂”则由弹性系数K2的弹性元件与弹性系数为U的粘性元件串联而成. 弹性系数K1与K2与时间无关， 主要反应细胞的初始变形速度，粘性系数U反应了时间的依赖性，而U和两个弹性系数的组合可以反应细胞的蠕变速度.
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从实验结果看烧伤血清作用2h后，其K1，K2，U和正常对照组相比明显减小，说明烧伤血清作用2h肝细胞的粘弹性明显增加，造成这种情况的原因是烧伤血清在2h内对肝细胞有激活作用，反应细胞粘弹性的细胞骨架(主要是细胞膜、微管、微丝和中间丝等)受到烧伤血清的激活，造成了细胞粘弹性增加. 从6h开始到24h，K1、K2、U均高于正常对照组，细胞粘弹性降低、刚性增加，这和肝细胞损伤酶的释放相一致，原因是一方面由于烧伤血清直接对细胞骨架的损伤加重，另一方面是肝细胞内酶的释放影响了细胞的粘弹性.
4 参考文献
1 王晓军，罗向东，罗勤，杨宗城. 人肝细胞和肝窦内皮细胞的分离和培养. 第三军医大学学报，1996；16(5)：379-380
, 百拇医药 2 龙勉，王宪航，吴云鹏，吴泽志.肝癌细胞粘弹性实验研究.生物物理理学报，1996；3(12)：169-171
3 罗向东，杨宗城，黎鳌，罗勤. 家兔烧伤早期内脏血管内皮细胞损伤的变化. 第三军医大学学报，1995；17(4)：279-282
4 Sung KL, Kuhlman P, Madldomado F, Lollo BA, Chien S, Brian AA. Force contribution of IFA-1/ICAM-1 complex to T cell adhesion.
J Cell Science, 1992;103(1):259-266, 百拇医药(王晓军 罗向东 罗勤 杨宗城)