幽门螺杆菌的低温保存方法
中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 102206
张建中，男，1964-01-05生，山东省东营市人，汉族. 1984年山东医科大学医学系毕业，1992年中国预防医学科学院硕士，副主任，副研究员，主要从事幽门螺杆菌相关研究，承担全国幽门螺杆菌协作组菌株库的构建和管理工作.
项目负责人 张建中，102206，中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所腹泻病研究室，北京市昌平县流字5号02室.
Correspondence to Dr. Jian-Zhong Zhang, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Changping, Beijing 102206, P.O.Box 5, ChinaTel. +86·10·61739456,\ Fax. +86·10·61739456
, 百拇医药
E-mail: Helico@public.bta.net.cn
收稿日期 1998-07-06
Long-term freezing storage of Helicobacter pylori
Jian-Zhong Zhang, Xiu-Gao Jiang, Jing-Jing Chen, Zhao-Jun Sun and Tao Sheng
Diarrhea Disease Lab, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To improve the freezing storage results of H.pylori strains.
METHODS Using cryopreservative solution (containing 10mL/L sucrose and 500mL/L new bovine serum), 138 H.pylori isolates were stored under -62℃ condition. The bacteria were tested each 6 months by culture in the media (Brucella agar with 100mL/L sheep blood) at microaerophilic environment (100mL/L CO2, 50mL/L O2 and 850mL/L N2), at 37℃ for 3 days.
, 百拇医药
RESULTS All of the isolates tested were recovered except one isolate (CAPM N107 after 18 months) after two years of storage. The investigation on 7 isolates prolonged to three years and the subcultures are still successful.
CONCLUSION The cryopreservative solution (containing 100mL/L sucrose and 500mL/L new bovine serum, without dimethylsulfoxide, DMSO), is suitable for the freezing storage of H.pylori. Most isolates can be stored for up to two years or longer. This preservative method is easy for routine use.
, 百拇医药
Subject headings Helicobacter pylori; bacterial storage; freeze storage
Zhang JZ, Jiang XG, Chen JJ, Sun ZJ, Sheng T. Long-term freezing storage of Helicobacter pylori.
Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(12):1073-1074
摘要
目的 探索幽门螺杆菌实用性的低温保存方法.
方法 采用以100g/L蔗糖、500mL/L小牛血清作为幽门螺杆菌冷冻保存液，对138株幽门螺杆菌在-62℃条件下进行保存，每6mo进行一次菌株复活，检查菌株存活情况.
, 百拇医药
结果 除一株国内分离株(CAPM N107株)在18mo时复活失败外，其他菌株在保存2.5a后均复活良好，其中对7株菌株的观察已达3a，仍能成功复活.
结论 幽门螺杆菌菌株冷冻保存过程中，若使用100g/L蔗糖小牛血清保存液(不含二甲基亚砜)，配方简单. 同时可免去在-20℃环境的预冻过程，大大简化了操作过程. 菌株保存期一般可达2a以上，适合各科研单位常规保存幽门螺杆菌菌株.
主题词 螺杆菌，幽门；细菌保存；冷冻保存
张建中, 蒋秀高, 陈晶晶, 孙兆军, 盛涛.幽门螺杆菌的低温保存方法.华人消化杂志,1998;6(12):1073-1074
0 引言
, 百拇医药
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, HP)感染相关性疾病已受到国内外广泛关注，在Hp的基础性研究中，菌株的低温冷冻保存能给科研工作带来很大方便，但存在保存期较短的问题，往往需经常复活和保存菌株. 我们近10a对多种冷冻保存液在Hp冷冻保存中进行了应用和比较，并针对Hp的具体情况完成了对保存液的改进. 现介绍如下.
1 材料和方法
1.1 材料 菌株：共采用经系统鉴定的138株(其中国内分离株124株，国际标准菌株2株和爱尔兰分离株12株). 冷冻保存液：用蒸馏水配制200g/L的蔗糖溶液，经115℃，30min灭菌后，将蔗糖溶液与经灭活的小牛血清按1∶1比例混合，即成为本实验所用菌株保存液.
1.2 方法 将冻存液约0.2mL分装在各1.5mL离心管或螺口冻存管中，放-20℃冰箱保存备用. 临用前将保存液取出，室温溶化，用取菌环直接刮取少许新鲜培养的Hp，放入保存液中(约1012cfu/L)，并直接放入-62℃环境保存，每株细菌保存多支，每6mo取出保存菌株，分别接种含100mL/L羊血的布氏琼脂平板后，置37℃混合气体(100mL/L CO2，50mL/L O2和850mL/L N2)环境培养3d，检测细菌存活情况.
, 百拇医药
2 结果
在观察菌株中，除一株国内分离株(CAPM N107株)在18mo时复活失败，其他菌株在保存2.5a后均复活良好，其中对7株菌株的观察已达3a，仍能复活成功.
3 讨论
Hp冷冻保存常规实验室操作带来很大方便，但长期以来存在可靠保存期短，复活率低的问题，以致于造成多个临床和基础研究单位经常发生菌株丢失. 国内外曾经在此领域作过多方面探索，用过的冷冻保存液有脱脂奶粉、布氏肉汤、脱脂奶粉加170mL/L甘油、布氏肉汤加200mL/L甘油、Stuart传送培基、布氏肉汤加100mL/L小牛血清、含150mL/L甘油的10g/L蛋白胨、含150mL/L甘油的大豆胨肉汤、心脑浸液、灭活血清以及脱纤维马、兔或绵羊全血等多种[1-7]；一般在-70℃条件下，在大豆胨肉汤、心脑浸液、灭活血清中Hp仅可存活数周，在脱纤维全血中可存活0.5a，也有在脱纤维全血中加入100mL/L甘油可保存Hp达2a以上的报道，但此保存配方在实际应用中仍不十分方便. 我们在工作中发现，Hp对冰晶损伤非常敏感，经反复2次冻溶的菌株一般不能复活成功. 因此，我们选用了对细胞内外均有良好防止冰晶形成的蔗糖成分作为保存液的主要成分，而且明显加大了小牛血清在保存液中的比例，实验取得了满意效果. 二甲基亚砜往往在一般细菌冷冻保存液中被采用，但在Hp菌株冻存过程中，可在复活阶段造成明显的毒性作用，使用100g/L蔗糖小牛血清时可完全避免二甲基亚砜的使用，提高了Hp的复活率.
, 百拇医药
延长Hp冷冻保存期的关键是延缓细胞内冰晶的生长，要求温度降到-50℃以下，我们在本次实验中选择-62℃作为菌株保存温度， 改变了以往在-80℃条件下保存的办法. 实验表明保存结果仍然满意，因对冰箱的要求明显降低，更易于建立保存条件. Hp菌株冷冻保存过程中，若使用100g/L蔗糖小牛血清保存液，可免去在-20℃环境的预冻过程，大大简化了操作过程.
4 参考文献
1 Han SW, Flamm R, Hachem CY, Kim HY, Clarridge JE, Evana DG et al. Transport and storage of Helicobacter pylori from
gastric mucosal biopsiesand clinical isolates. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1995;14(4):349-352
, 百拇医药
2 Langenberg W,Rauws EAJ, Widjojokusumo A, Tytgat GNJ, Zanen HC. Identification of Campylobacter pyloridis isolates by
restriction endonuclease DNA analysis. J Clin Microbiol, 1986;24(3):414-417
3 Queiroz DMM, Mendes EN, Rocha GA. Indicator medium for isolation of Campylobacter pylori. J Clin Microbiol,1987;25(12):2378-2379
4 Ribeiro CD, Gray SJ. Long term freeze storage of Campylobacter pyloridis.J Clin Pathol,1987;40(10):1265
, 百拇医药
5 Buck GE, Smith JS. Medium supplementation for growth of Campylobacter pyloridis. J Clin Microbiol,1987;25(4):597-599
6 Morgan DR, Freedman R, Depew CE, Kraft WG. Growth of Campylobacter pylori in liquid media. J Clin Microbiol,1987;25(11):2123-2125
7 Shahamat M, Paszko Kolva C, Mai UE, Yamamoto H, Colwell RR. Selected cryopreservatives for long term storage of Helicobacter
pylori at low temperatures. J Clin Pathol, 1992;45(8):735-736, http://www.100md.com(张建中 蒋秀高 陈晶晶 孙兆军 盛涛)
张建中，男，1964-01-05生，山东省东营市人，汉族. 1984年山东医科大学医学系毕业，1992年中国预防医学科学院硕士，副主任，副研究员，主要从事幽门螺杆菌相关研究，承担全国幽门螺杆菌协作组菌株库的构建和管理工作.
项目负责人 张建中，102206，中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所腹泻病研究室，北京市昌平县流字5号02室.
Correspondence to Dr. Jian-Zhong Zhang, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Changping, Beijing 102206, P.O.Box 5, ChinaTel. +86·10·61739456,\ Fax. +86·10·61739456
, 百拇医药
E-mail: Helico@public.bta.net.cn
收稿日期 1998-07-06
Long-term freezing storage of Helicobacter pylori
Jian-Zhong Zhang, Xiu-Gao Jiang, Jing-Jing Chen, Zhao-Jun Sun and Tao Sheng
Diarrhea Disease Lab, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To improve the freezing storage results of H.pylori strains.
METHODS Using cryopreservative solution (containing 10mL/L sucrose and 500mL/L new bovine serum), 138 H.pylori isolates were stored under -62℃ condition. The bacteria were tested each 6 months by culture in the media (Brucella agar with 100mL/L sheep blood) at microaerophilic environment (100mL/L CO2, 50mL/L O2 and 850mL/L N2), at 37℃ for 3 days.
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RESULTS All of the isolates tested were recovered except one isolate (CAPM N107 after 18 months) after two years of storage. The investigation on 7 isolates prolonged to three years and the subcultures are still successful.
CONCLUSION The cryopreservative solution (containing 100mL/L sucrose and 500mL/L new bovine serum, without dimethylsulfoxide, DMSO), is suitable for the freezing storage of H.pylori. Most isolates can be stored for up to two years or longer. This preservative method is easy for routine use.
, 百拇医药
Subject headings Helicobacter pylori; bacterial storage; freeze storage
Zhang JZ, Jiang XG, Chen JJ, Sun ZJ, Sheng T. Long-term freezing storage of Helicobacter pylori.
Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(12):1073-1074
摘要
目的 探索幽门螺杆菌实用性的低温保存方法.
方法 采用以100g/L蔗糖、500mL/L小牛血清作为幽门螺杆菌冷冻保存液，对138株幽门螺杆菌在-62℃条件下进行保存，每6mo进行一次菌株复活，检查菌株存活情况.
, 百拇医药
结果 除一株国内分离株(CAPM N107株)在18mo时复活失败外，其他菌株在保存2.5a后均复活良好，其中对7株菌株的观察已达3a，仍能成功复活.
结论 幽门螺杆菌菌株冷冻保存过程中，若使用100g/L蔗糖小牛血清保存液(不含二甲基亚砜)，配方简单. 同时可免去在-20℃环境的预冻过程，大大简化了操作过程. 菌株保存期一般可达2a以上，适合各科研单位常规保存幽门螺杆菌菌株.
主题词 螺杆菌，幽门；细菌保存；冷冻保存
张建中, 蒋秀高, 陈晶晶, 孙兆军, 盛涛.幽门螺杆菌的低温保存方法.华人消化杂志,1998;6(12):1073-1074
0 引言
, 百拇医药
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, HP)感染相关性疾病已受到国内外广泛关注，在Hp的基础性研究中，菌株的低温冷冻保存能给科研工作带来很大方便，但存在保存期较短的问题，往往需经常复活和保存菌株. 我们近10a对多种冷冻保存液在Hp冷冻保存中进行了应用和比较，并针对Hp的具体情况完成了对保存液的改进. 现介绍如下.
1 材料和方法
1.1 材料 菌株：共采用经系统鉴定的138株(其中国内分离株124株，国际标准菌株2株和爱尔兰分离株12株). 冷冻保存液：用蒸馏水配制200g/L的蔗糖溶液，经115℃，30min灭菌后，将蔗糖溶液与经灭活的小牛血清按1∶1比例混合，即成为本实验所用菌株保存液.
1.2 方法 将冻存液约0.2mL分装在各1.5mL离心管或螺口冻存管中，放-20℃冰箱保存备用. 临用前将保存液取出，室温溶化，用取菌环直接刮取少许新鲜培养的Hp，放入保存液中(约1012cfu/L)，并直接放入-62℃环境保存，每株细菌保存多支，每6mo取出保存菌株，分别接种含100mL/L羊血的布氏琼脂平板后，置37℃混合气体(100mL/L CO2，50mL/L O2和850mL/L N2)环境培养3d，检测细菌存活情况.
, 百拇医药
2 结果
在观察菌株中，除一株国内分离株(CAPM N107株)在18mo时复活失败，其他菌株在保存2.5a后均复活良好，其中对7株菌株的观察已达3a，仍能复活成功.
3 讨论
Hp冷冻保存常规实验室操作带来很大方便，但长期以来存在可靠保存期短，复活率低的问题，以致于造成多个临床和基础研究单位经常发生菌株丢失. 国内外曾经在此领域作过多方面探索，用过的冷冻保存液有脱脂奶粉、布氏肉汤、脱脂奶粉加170mL/L甘油、布氏肉汤加200mL/L甘油、Stuart传送培基、布氏肉汤加100mL/L小牛血清、含150mL/L甘油的10g/L蛋白胨、含150mL/L甘油的大豆胨肉汤、心脑浸液、灭活血清以及脱纤维马、兔或绵羊全血等多种[1-7]；一般在-70℃条件下，在大豆胨肉汤、心脑浸液、灭活血清中Hp仅可存活数周，在脱纤维全血中可存活0.5a，也有在脱纤维全血中加入100mL/L甘油可保存Hp达2a以上的报道，但此保存配方在实际应用中仍不十分方便. 我们在工作中发现，Hp对冰晶损伤非常敏感，经反复2次冻溶的菌株一般不能复活成功. 因此，我们选用了对细胞内外均有良好防止冰晶形成的蔗糖成分作为保存液的主要成分，而且明显加大了小牛血清在保存液中的比例，实验取得了满意效果. 二甲基亚砜往往在一般细菌冷冻保存液中被采用，但在Hp菌株冻存过程中，可在复活阶段造成明显的毒性作用，使用100g/L蔗糖小牛血清时可完全避免二甲基亚砜的使用，提高了Hp的复活率.
, 百拇医药
延长Hp冷冻保存期的关键是延缓细胞内冰晶的生长，要求温度降到-50℃以下，我们在本次实验中选择-62℃作为菌株保存温度， 改变了以往在-80℃条件下保存的办法. 实验表明保存结果仍然满意，因对冰箱的要求明显降低，更易于建立保存条件. Hp菌株冷冻保存过程中，若使用100g/L蔗糖小牛血清保存液，可免去在-20℃环境的预冻过程，大大简化了操作过程.
4 参考文献
1 Han SW, Flamm R, Hachem CY, Kim HY, Clarridge JE, Evana DG et al. Transport and storage of Helicobacter pylori from
gastric mucosal biopsiesand clinical isolates. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1995;14(4):349-352
, 百拇医药
2 Langenberg W,Rauws EAJ, Widjojokusumo A, Tytgat GNJ, Zanen HC. Identification of Campylobacter pyloridis isolates by
restriction endonuclease DNA analysis. J Clin Microbiol, 1986;24(3):414-417
3 Queiroz DMM, Mendes EN, Rocha GA. Indicator medium for isolation of Campylobacter pylori. J Clin Microbiol,1987;25(12):2378-2379
4 Ribeiro CD, Gray SJ. Long term freeze storage of Campylobacter pyloridis.J Clin Pathol,1987;40(10):1265
, 百拇医药
5 Buck GE, Smith JS. Medium supplementation for growth of Campylobacter pyloridis. J Clin Microbiol,1987;25(4):597-599
6 Morgan DR, Freedman R, Depew CE, Kraft WG. Growth of Campylobacter pylori in liquid media. J Clin Microbiol,1987;25(11):2123-2125
7 Shahamat M, Paszko Kolva C, Mai UE, Yamamoto H, Colwell RR. Selected cryopreservatives for long term storage of Helicobacter
pylori at low temperatures. J Clin Pathol, 1992;45(8):735-736, http://www.100md.com(张建中 蒋秀高 陈晶晶 孙兆军 盛涛)