幽门螺杆菌的冷冻干燥保存方法
中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 北京市 102206
张建中，男，1964-01-05生，山东省东营市人，汉族. 1984年山东医科大学医学系毕业，1992年中国预防医学科学院硕士，副主任，副研究员，主要从事幽门螺杆菌相关研究，承担全国幽门螺杆菌协作组菌株库的构建和管理工作.
项目负责人 张建中，102206，中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所腹泻病研究室，北京市昌平县流字5号02室.
Correspondence to Dr. Jian-Zhong Zhang, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Changping, Beijing 102206, P.O.Box 5, China
, http://www.100md.com
Tel. +86·10·61739456,\ Fax. +86·10·61739456
E-mail : Helico@public.bta.net.cn
收稿日期 1998-07-06
Dry-freezing storage of Helicobacter pylori
Jian-Zhong Zhang, Xiu-Gao Jiang, Jing-Jing Chen, Zhao-Jun Sun and Tao Sheng
Diarrhea Disease Lab, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To observe the dry-freezing storage results of H.pylori strains.
METHODS Fifteen H.pylori isolates and three C.jejuni isolates (1013cfu/L) were used in this study. The dry-freezing storage solution (containing 10g/L sucrose and 500mL/L new bovine serum) was used, and the skim milk was used as control. The dry-freezed bacteria were tested each year by culturing in the media (Brucella agar with 100mL/L sheep blood) in microaerophilic environment (100mL/L CO2, 50mL/L O2 and 850mL/L N2) at 37℃ for 5 days.
, 百拇医药
RESULTS After dry-freezing, all of the H.pylori isolates (15/15) and C.jejuni isolates (3/3) can survive for at least 4 years. But the skim milk was not useful in H.pylori dry-freezing storage.
CONCLUSION The solution (100g/L sucrose and 500mL/L new bovine serum) can be used successfully in the dry-freezing storage of H.pylori isolates and C.jejuni isolates.
Subject headings Helicobacter pylori; Helicobacter infection; freeze storage
, http://www.100md.com
Zhang JZ, Jiang XG, Chen JJ, Sun ZJ, Sheng T. Dry freezing storage of Helicobacter pylori. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(12):1075-1076
摘要
目的 介绍一种较理想的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)的冷冻干燥保存方法，希望对Hp相关研究有所帮助. 方法 以100g/L蔗糖、500mL/L小牛血清作为冻干保护剂对15株Hp(10.13cfu/L菌液)和3株空肠弯曲菌进行冷冻干燥保存，同时用脱脂牛奶冻干保护剂作为对照. 按常规菌株冻干程序冻干后火焰封管，真空放电检查冻干管真空度良好后，存放于室温环境，用于冻干效果观察. 冻干菌株每年进行复活检查，复活时接种双份布氏血平板，置混合气体环境(100mL/L CO2，50mL/LO2和50mL/L N2)培养5d后观察细菌复活情况.
, 百拇医药
结果 Hp冻干菌株15株经4a复苏观察发现均存活良好，其中已有2株冻干菌株观察时间已达6a，仍存活良好.
结论 以蔗糖血清为主的冻干保护液在Hp菌株冻干中具有良好的保护效果，冻干菌株可达到长期保存的目的. 同时，此保护剂可有效用于弯曲菌属细菌和其他螺杆菌属细菌的冻干保存.
主题词 螺杆菌，幽门；螺杆菌感染；冷冻干燥保存
张建中, 蒋秀高, 陈晶晶, 孙兆军, 盛涛.幽门螺杆菌的冷冻干燥保存方法.华人消化杂志,1998;6(12):1075-1076
0 引言
, 百拇医药
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染相关性疾病已受到国内外广泛关注，但在Hp的基础性研究中，普遍感到Hp的分离比较容易，做到对分离菌株的传代则比较困难，要完成对Hp的长期保存则更加困难，很多研究单位因不能获得长期稳定的菌株，不得不停止相关研究. 在实验室中关键菌株长期、稳定保存的首选方案是对菌株进行冻干保存. 我们最近10a在Hp相关研究过程中，对多种冻干保护剂在Hp冻干保存中，进行了应用观察和比较，并针对Hp的具体情况完成了对保存液的改进. 现将我们认为较满意的一种冻干保护剂和冻干方法介绍如下.
1 材料和方法
1.1 材料 选用菌株为本室保存的NCTC11637，CAMPZ-2等15株，另有3株空肠弯曲菌菌株(本室保存). 实验前各菌株均经过系统鉴定.冻干保护剂配制：用蒸馏水配制200g/L的蔗糖溶液，经115℃，30min灭菌后，将蔗糖溶液与经灭活的小牛血清按1∶1比例混合即成为本实验所用菌株保存液，保存液平时可置普通冰箱冷冻备用.
, http://www.100md.com
1.2 方法 在每支冻干管底部加少许脱脂棉作为支持物，高压灭菌后备用. 冻干时，每支冻干管内放入用培养72h的Hp制备的1013cfu/L菌液约0.1mL，以使管底部的脱脂棉刚好浸透为宜. 将装有Hp菌液的冻干管依次经-20℃和-80℃预冻后，按常规菌株冻干程序冻干后火焰封管，真空放电检查冻干管真空度良好后，用于冻干效果观察. 实验中同时采用脱脂牛奶作为对照用保存液. 冻干菌株每年进行复活检查，复活时将冻干管打开，用布氏肉汤0.2mL左右冲洗管底冻干物，并立即接种双份布氏血平板，置混合气体环境(100mL/L CO2，50mL/LO2和850mL/L N2)培养5d后观察细菌复活情况.
2 结果
Hp冻干菌株15株经4a复苏观察发现均存活良好，其中已有两株冻干菌株观察时间已达6a，仍存活良好. 对照用脱脂牛奶保护剂组，15株冻干菌株在冻干后，立即进行复活实验，均未复活成功. 3株空肠弯曲菌冻干菌株经4a复苏观察发现均存活良好.
, http://www.100md.com
3 讨论
国内外各个细菌学研究机构，均将菌株的冻干保存作为常规菌株保藏方法，对于一般细菌，脱脂牛奶即可作为有效的冻干保护剂用于菌株的冻干过程. 但在Hp菌株的冻干过程中，不但脱脂牛奶不能使用，其他多种保存液也不能有效地用于此过程[1]. 各国Hp的主要研究机构都致力于保护剂的研究[2]，使目前冻干菌株的复活率明显提高(一般可达50%左右)，但各自的配方多数未公开交流. 我们在本研究中发现，以蔗糖血清为主的冻干保护液在菌株冻干中具有良好的保护效果，可能是蔗糖作为一种细胞内外双重保护剂，有效地降低了Hp冻干过程中细胞内外的冰晶损伤，配方中取消了常规配方中的二甲基亚砜成分，减少了对Hp复苏过程的毒性. 同时，此保护剂可有效用于弯曲菌属细菌和其他螺杆菌属细菌的冻干保存.
, 百拇医药
Hp在冻干过程中对冻干条件的要求特别严格，特别是不能耐受各种不同程度的溶化现象出现. 我们在常规冻干中，曾有3次出现轻度预冻后溶化，结果造成整批菌株冻干失败，因此应特别引起注意.
4 参考文献
1 Westblom TU, Barthel JS, Havey AD, Gonzalez FJ, Tarka EF, Everett ED.Long term freeze storage of Campylobacter pyloridis.
J Clin Pathol, 1987;40(3):353
2 Spengler A, Gross A, Kaltwasser H. Successful freeze storage and lyophilisation for preservation of Helicobacter pylori.
J Clin Pathol,1992;45(8):737, http://www.100md.com(张建中 蒋秀高 陈晶晶 孙兆军 盛涛)
张建中，男，1964-01-05生，山东省东营市人，汉族. 1984年山东医科大学医学系毕业，1992年中国预防医学科学院硕士，副主任，副研究员，主要从事幽门螺杆菌相关研究，承担全国幽门螺杆菌协作组菌株库的构建和管理工作.
项目负责人 张建中，102206，中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所腹泻病研究室，北京市昌平县流字5号02室.
Correspondence to Dr. Jian-Zhong Zhang, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Changping, Beijing 102206, P.O.Box 5, China
, http://www.100md.com
Tel. +86·10·61739456,\ Fax. +86·10·61739456
E-mail : Helico@public.bta.net.cn
收稿日期 1998-07-06
Dry-freezing storage of Helicobacter pylori
Jian-Zhong Zhang, Xiu-Gao Jiang, Jing-Jing Chen, Zhao-Jun Sun and Tao Sheng
Diarrhea Disease Lab, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To observe the dry-freezing storage results of H.pylori strains.
METHODS Fifteen H.pylori isolates and three C.jejuni isolates (1013cfu/L) were used in this study. The dry-freezing storage solution (containing 10g/L sucrose and 500mL/L new bovine serum) was used, and the skim milk was used as control. The dry-freezed bacteria were tested each year by culturing in the media (Brucella agar with 100mL/L sheep blood) in microaerophilic environment (100mL/L CO2, 50mL/L O2 and 850mL/L N2) at 37℃ for 5 days.
, 百拇医药
RESULTS After dry-freezing, all of the H.pylori isolates (15/15) and C.jejuni isolates (3/3) can survive for at least 4 years. But the skim milk was not useful in H.pylori dry-freezing storage.
CONCLUSION The solution (100g/L sucrose and 500mL/L new bovine serum) can be used successfully in the dry-freezing storage of H.pylori isolates and C.jejuni isolates.
Subject headings Helicobacter pylori; Helicobacter infection; freeze storage
, http://www.100md.com
Zhang JZ, Jiang XG, Chen JJ, Sun ZJ, Sheng T. Dry freezing storage of Helicobacter pylori. Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(12):1075-1076
摘要
目的 介绍一种较理想的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)的冷冻干燥保存方法，希望对Hp相关研究有所帮助. 方法 以100g/L蔗糖、500mL/L小牛血清作为冻干保护剂对15株Hp(10.13cfu/L菌液)和3株空肠弯曲菌进行冷冻干燥保存，同时用脱脂牛奶冻干保护剂作为对照. 按常规菌株冻干程序冻干后火焰封管，真空放电检查冻干管真空度良好后，存放于室温环境，用于冻干效果观察. 冻干菌株每年进行复活检查，复活时接种双份布氏血平板，置混合气体环境(100mL/L CO2，50mL/LO2和50mL/L N2)培养5d后观察细菌复活情况.
, 百拇医药
结果 Hp冻干菌株15株经4a复苏观察发现均存活良好，其中已有2株冻干菌株观察时间已达6a，仍存活良好.
结论 以蔗糖血清为主的冻干保护液在Hp菌株冻干中具有良好的保护效果，冻干菌株可达到长期保存的目的. 同时，此保护剂可有效用于弯曲菌属细菌和其他螺杆菌属细菌的冻干保存.
主题词 螺杆菌，幽门；螺杆菌感染；冷冻干燥保存
张建中, 蒋秀高, 陈晶晶, 孙兆军, 盛涛.幽门螺杆菌的冷冻干燥保存方法.华人消化杂志,1998;6(12):1075-1076
0 引言
, 百拇医药
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染相关性疾病已受到国内外广泛关注，但在Hp的基础性研究中，普遍感到Hp的分离比较容易，做到对分离菌株的传代则比较困难，要完成对Hp的长期保存则更加困难，很多研究单位因不能获得长期稳定的菌株，不得不停止相关研究. 在实验室中关键菌株长期、稳定保存的首选方案是对菌株进行冻干保存. 我们最近10a在Hp相关研究过程中，对多种冻干保护剂在Hp冻干保存中，进行了应用观察和比较，并针对Hp的具体情况完成了对保存液的改进. 现将我们认为较满意的一种冻干保护剂和冻干方法介绍如下.
1 材料和方法
1.1 材料 选用菌株为本室保存的NCTC11637，CAMPZ-2等15株，另有3株空肠弯曲菌菌株(本室保存). 实验前各菌株均经过系统鉴定.冻干保护剂配制：用蒸馏水配制200g/L的蔗糖溶液，经115℃，30min灭菌后，将蔗糖溶液与经灭活的小牛血清按1∶1比例混合即成为本实验所用菌株保存液，保存液平时可置普通冰箱冷冻备用.
, http://www.100md.com
1.2 方法 在每支冻干管底部加少许脱脂棉作为支持物，高压灭菌后备用. 冻干时，每支冻干管内放入用培养72h的Hp制备的1013cfu/L菌液约0.1mL，以使管底部的脱脂棉刚好浸透为宜. 将装有Hp菌液的冻干管依次经-20℃和-80℃预冻后，按常规菌株冻干程序冻干后火焰封管，真空放电检查冻干管真空度良好后，用于冻干效果观察. 实验中同时采用脱脂牛奶作为对照用保存液. 冻干菌株每年进行复活检查，复活时将冻干管打开，用布氏肉汤0.2mL左右冲洗管底冻干物，并立即接种双份布氏血平板，置混合气体环境(100mL/L CO2，50mL/LO2和850mL/L N2)培养5d后观察细菌复活情况.
2 结果
Hp冻干菌株15株经4a复苏观察发现均存活良好，其中已有两株冻干菌株观察时间已达6a，仍存活良好. 对照用脱脂牛奶保护剂组，15株冻干菌株在冻干后，立即进行复活实验，均未复活成功. 3株空肠弯曲菌冻干菌株经4a复苏观察发现均存活良好.
, http://www.100md.com
3 讨论
国内外各个细菌学研究机构，均将菌株的冻干保存作为常规菌株保藏方法，对于一般细菌，脱脂牛奶即可作为有效的冻干保护剂用于菌株的冻干过程. 但在Hp菌株的冻干过程中，不但脱脂牛奶不能使用，其他多种保存液也不能有效地用于此过程[1]. 各国Hp的主要研究机构都致力于保护剂的研究[2]，使目前冻干菌株的复活率明显提高(一般可达50%左右)，但各自的配方多数未公开交流. 我们在本研究中发现，以蔗糖血清为主的冻干保护液在菌株冻干中具有良好的保护效果，可能是蔗糖作为一种细胞内外双重保护剂，有效地降低了Hp冻干过程中细胞内外的冰晶损伤，配方中取消了常规配方中的二甲基亚砜成分，减少了对Hp复苏过程的毒性. 同时，此保护剂可有效用于弯曲菌属细菌和其他螺杆菌属细菌的冻干保存.
, 百拇医药
Hp在冻干过程中对冻干条件的要求特别严格，特别是不能耐受各种不同程度的溶化现象出现. 我们在常规冻干中，曾有3次出现轻度预冻后溶化，结果造成整批菌株冻干失败，因此应特别引起注意.
4 参考文献
1 Westblom TU, Barthel JS, Havey AD, Gonzalez FJ, Tarka EF, Everett ED.Long term freeze storage of Campylobacter pyloridis.
J Clin Pathol, 1987;40(3):353
2 Spengler A, Gross A, Kaltwasser H. Successful freeze storage and lyophilisation for preservation of Helicobacter pylori.
J Clin Pathol,1992;45(8):737, http://www.100md.com(张建中 蒋秀高 陈晶晶 孙兆军 盛涛)