丙型肝炎与原发性肝癌关系研究现状
南京医科大学 江苏省人民医院 210029
杜竞辉，男，1930-10-13生，江西省新淦县人，汉族. 1954年江苏医学院医本科毕业. 南京医科大学外科教授兼第一附属医院(江苏省人民医院)外科主任医师，主要从事普外科肝胆胰疾病的诊治研究，发表论文50篇，主编《普通外科手术图解》等专著4部，获科技成果奖9项.
项目负责人 杜竞辉，210029，南京医科大学第一附属医院(江苏省人民医院)外科，江苏南京广州路300号.
Tel. +86·25·3718836 Ext. 6823
收稿日期 1998-07-26
Subject headings hepatitis C; hepatitis C virus; liver neoplasms/etiology; gene, viral
, http://www.100md.com
主题词 肝炎，丙型；肝肿瘤/病因学；基因，病毒；丙型肝炎病毒
肝癌是世界上常见的恶性肿瘤，其病因研究主要集中在肝炎病毒、化学因素、饮水污染、烟酒嗜好、性激素等，其中肝炎病毒是目前研究的主要课题之一. 发展中国家以乙型肝炎为主、发达国家主要病因为丙型肝炎，随着近年来急性乙型肝炎发病率逐渐下降，肝癌发病率却有上升. 这种情况可能与HCV传播有关. 现就近年来丙型肝炎病毒及其与原发性肝癌关系的研究现状简述如下.
1 丙型肝炎病毒基因
丙型肝炎病毒(HCV)是单股正链RNA病毒，属黄热病毒科，约有9400个核苷酸[1]，根据HCV全基因序列或经PCRC扩增后的基因序列片段的同源性可以分成不同型和(或)亚型. 常用的基因分型方法为基因序列扩增(PCR)分型法和限制性片段长度多态分析法(RFLP). 由于存在不同的分型方法，造成各种分型命名系统并存的混乱局面. 目前主要运用的是1993年Simmonds[2，3]等提出亲缘关系分析法的6型分型法. 即将HCV分为6个型和11个亚型. 有许多学者尝试建立HCV感染细胞模型，并在细胞内检测病毒颗粒. Mizuno et al[4]将HCV全基因组转染入Hela G细胞中，结果用免疫组织化学方法证实细胞中有核心区、包膜糖蛋白区、NS 3区和NS 5区等病毒抗原表达. 免疫电镜下发现核心抗原定位于内质网膜上，核心抗原阳性颗粒存在于胞质液中，直径30nm；普通电镜下可在内质网池中发现一直径为45nm颗粒，外有包膜包裹. 他们认为，HCV核心抗原在胞质液中合成和组装，然后在内质网中形成完整的病毒颗粒. 但到目前为止HCV的体外培养分离尚未成功，HCV病毒蛋白仍很难从培养和血清中分离获得，而且尚未找到HCV保护性中和抗体. 少数有关HCV的中和抗体的报告，还需进一步观察证实，所以HCV感染的预防HCV疫苗的制备是当务之急的前沿课题.
, 百拇医药
2 HCV的检测
抗-HCV的检测是临床上诊断急、慢性丙型肝炎和筛选供血员的主要手段之一，近十年来检测方法经过三次变革. 第一代抗-HCV的检测系使用NS-4区的重组蛋白C-100，5-1-1直接ELISA法，检测率达70%，具有较高的假阳性. 第二代抗-HCV检测所采用的抗原加入了包括来自于Core区(C22-3)，NS-3区(C33c)及NS-4的重组蛋白，使检测率有所提高. 第三代抗-HCV检测方法中，抗原来自Ⅰa型(Orfho EIA 3.0法)或Ⅰb型(Murex VK 488法)的Core, NS-3,NS-4,NS-5区蛋白，可以检测血清中抗体的滴度，从而更能够反映抗体检测敏感性在基因型别间的差异[5-7].
丙型肝炎病毒基因的检测，目前多采用逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)的方法及各种定量PCR方法、该方法灵敏度高，在感染的组织中及癌周组织中检测到HCV-RNA及其负链表明HCV在其组织中复制. 但在操作过程以及cDNA合成步骤中有可能存在假阳性[8，9].
, http://www.100md.com
原位杂交(In Situ Hybridization, ISH)检测方法同样灵敏，不但能显示病毒颗粒的分布，同时也能观察组织特征和细胞亚微结构，在肝癌组织及癌旁组织中直接检测到丙肝病毒基因、丙肝病毒蛋白(特别是核心蛋白)证明丙肝病毒在癌变过程及其癌变后的肝癌细胞中持续存在有可能构成致癌作用的启动因子[10，11].
3 丙型肝炎病毒与原发性肝癌
越来越多的资料表明：HCV感染可致慢性肝炎、肝硬变、肝癌. 我们在1993年检测了101例原发性肝癌患者血清及癌组织中HCV-RNA，阳性率达10%左右. 在HCV-RNA阳性肝癌的癌组织中检测到HCV-RNA负链. 通过对比研究证实HCV为我国肝癌的第二相关因素，并且通常可与HBV合并感染. Akkiz-H et al[12]在22例血清阳性肝癌中检测到HCV-RNA，并对其进行分型研究. 认为Ⅰb型为其主要类型，这可能有两方面因素：Ⅰb型HCV可能具有特殊的致肝细胞病变因素，其次是Ⅰb型比非Ⅰb型病毒在体内存在时间较长，因长期感染而导致肝硬变和肝癌. Sansonno et al[13]1997年用免疫组化方法对E2/NS-1，C22-3，C33c，C100-3和NS-5抗原进行免疫标记，然后用地高辛标记HCV 5’端非编码区特殊探针进行原位杂交，这种同步杂交方法不但能显示HCV-RNA在细胞亚微结构中的位置，同时保存组织形态，用这种方法检查6例HCV-RNA阳性肝癌和3例HCV-RNA阴性HCC，结果HCV-Ags呈细小颗粒状位于癌组织和非癌细胞胞质中，而在癌细胞的胞质中较少. 每个感染的细胞都显示核心(Core)E和NS-3，-4，-5蛋白. 研究表明HCV在感染的肝细胞中复制，在癌变的组织继续存在，这些蛋白相关的蛋白酶的激活可能作为潜在癌变因子.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Choo QL. Isolation of a cDNA clone derived from a blood borne non A,non-B viral hepatitis genome. Science, 1989;244:359-362
2 Simmonds P. Sequence variability in the 5'non-coding region of hepatitis C virus: identification of a new virus type and restrictions
on sequence diversity. J Gen Virol, 1993;74:661-668
3 Simmonds P. A proposed system for the nomenclature of hepatitis C viral genotypes. Hepatology, 1994;19(Suppl):1321-1324
, http://www.100md.com
4 Mizuno M. Virionlike structures in hela G cells transfeted with the fulllength sequence of the hepatitis C viral
genome. Gastroenterology, 1995;109:1933-1940
5 Prescott LE. Detection and clinical features of hepatitis C virus type 6 infections in blood donors from Hong Kong.
J Med Virol, 1996;50:168-175
6 Dhaliwal SK. Influence of viraemia and genotype upon serological reactivity in screening assays for antibody to hepatitis C virus.
, 百拇医药
J Med Virol, 1996;48:184-190
7 Dow BC. Thirdgeneration recombinant immunoblot assay comparison of reactivities according to hepatitis C virus
genotype. Transfusion, 1996;36:547-551-552
8 McGuinness PH. False detection of negativestrand hepatitis C virus RNA [letter; comment]. Lancet, 1994;343:551-552
9 Lanford RE. Lack of detection of negativestrand hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and other
, 百拇医药
extrahepatic tissues by the highly strand-specific rTth reverse transcriptase PCR. J Virol, 1995;69:8079-8083
10 Yamada G. Localization of hepatitis C viral RNA and capsid protein in Human Liver. Dig Dis Sci, 1993;38:882-887
11 Haruna Y. Expression of hepatitis C virus in hepatocellular carcinoma. Cancer, 1994;73:2253-2258
12 Akkiz H. Hepatitis C virus genotypes in patients with hepatocellular carcinoma. J Environ Pathol Toxicol Oncol, 1996;15:85-88
13 Sansonno D. In situ simultaneous detection of hepatitis C virus RNA and hepatitis C virus-related antigens in hepatocellular
carcinoma. Cancer, 1997;80:22-33, 百拇医药(杜竞辉 查文章)
杜竞辉，男，1930-10-13生，江西省新淦县人，汉族. 1954年江苏医学院医本科毕业. 南京医科大学外科教授兼第一附属医院(江苏省人民医院)外科主任医师，主要从事普外科肝胆胰疾病的诊治研究，发表论文50篇，主编《普通外科手术图解》等专著4部，获科技成果奖9项.
项目负责人 杜竞辉，210029，南京医科大学第一附属医院(江苏省人民医院)外科，江苏南京广州路300号.
Tel. +86·25·3718836 Ext. 6823
收稿日期 1998-07-26
Subject headings hepatitis C; hepatitis C virus; liver neoplasms/etiology; gene, viral
, http://www.100md.com
主题词 肝炎，丙型；肝肿瘤/病因学；基因，病毒；丙型肝炎病毒
肝癌是世界上常见的恶性肿瘤，其病因研究主要集中在肝炎病毒、化学因素、饮水污染、烟酒嗜好、性激素等，其中肝炎病毒是目前研究的主要课题之一. 发展中国家以乙型肝炎为主、发达国家主要病因为丙型肝炎，随着近年来急性乙型肝炎发病率逐渐下降，肝癌发病率却有上升. 这种情况可能与HCV传播有关. 现就近年来丙型肝炎病毒及其与原发性肝癌关系的研究现状简述如下.
1 丙型肝炎病毒基因
丙型肝炎病毒(HCV)是单股正链RNA病毒，属黄热病毒科，约有9400个核苷酸[1]，根据HCV全基因序列或经PCRC扩增后的基因序列片段的同源性可以分成不同型和(或)亚型. 常用的基因分型方法为基因序列扩增(PCR)分型法和限制性片段长度多态分析法(RFLP). 由于存在不同的分型方法，造成各种分型命名系统并存的混乱局面. 目前主要运用的是1993年Simmonds[2，3]等提出亲缘关系分析法的6型分型法. 即将HCV分为6个型和11个亚型. 有许多学者尝试建立HCV感染细胞模型，并在细胞内检测病毒颗粒. Mizuno et al[4]将HCV全基因组转染入Hela G细胞中，结果用免疫组织化学方法证实细胞中有核心区、包膜糖蛋白区、NS 3区和NS 5区等病毒抗原表达. 免疫电镜下发现核心抗原定位于内质网膜上，核心抗原阳性颗粒存在于胞质液中，直径30nm；普通电镜下可在内质网池中发现一直径为45nm颗粒，外有包膜包裹. 他们认为，HCV核心抗原在胞质液中合成和组装，然后在内质网中形成完整的病毒颗粒. 但到目前为止HCV的体外培养分离尚未成功，HCV病毒蛋白仍很难从培养和血清中分离获得，而且尚未找到HCV保护性中和抗体. 少数有关HCV的中和抗体的报告，还需进一步观察证实，所以HCV感染的预防HCV疫苗的制备是当务之急的前沿课题.
, 百拇医药
2 HCV的检测
抗-HCV的检测是临床上诊断急、慢性丙型肝炎和筛选供血员的主要手段之一，近十年来检测方法经过三次变革. 第一代抗-HCV的检测系使用NS-4区的重组蛋白C-100，5-1-1直接ELISA法，检测率达70%，具有较高的假阳性. 第二代抗-HCV检测所采用的抗原加入了包括来自于Core区(C22-3)，NS-3区(C33c)及NS-4的重组蛋白，使检测率有所提高. 第三代抗-HCV检测方法中，抗原来自Ⅰa型(Orfho EIA 3.0法)或Ⅰb型(Murex VK 488法)的Core, NS-3,NS-4,NS-5区蛋白，可以检测血清中抗体的滴度，从而更能够反映抗体检测敏感性在基因型别间的差异[5-7].
丙型肝炎病毒基因的检测，目前多采用逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)的方法及各种定量PCR方法、该方法灵敏度高，在感染的组织中及癌周组织中检测到HCV-RNA及其负链表明HCV在其组织中复制. 但在操作过程以及cDNA合成步骤中有可能存在假阳性[8，9].
, http://www.100md.com
原位杂交(In Situ Hybridization, ISH)检测方法同样灵敏，不但能显示病毒颗粒的分布，同时也能观察组织特征和细胞亚微结构，在肝癌组织及癌旁组织中直接检测到丙肝病毒基因、丙肝病毒蛋白(特别是核心蛋白)证明丙肝病毒在癌变过程及其癌变后的肝癌细胞中持续存在有可能构成致癌作用的启动因子[10，11].
3 丙型肝炎病毒与原发性肝癌
越来越多的资料表明：HCV感染可致慢性肝炎、肝硬变、肝癌. 我们在1993年检测了101例原发性肝癌患者血清及癌组织中HCV-RNA，阳性率达10%左右. 在HCV-RNA阳性肝癌的癌组织中检测到HCV-RNA负链. 通过对比研究证实HCV为我国肝癌的第二相关因素，并且通常可与HBV合并感染. Akkiz-H et al[12]在22例血清阳性肝癌中检测到HCV-RNA，并对其进行分型研究. 认为Ⅰb型为其主要类型，这可能有两方面因素：Ⅰb型HCV可能具有特殊的致肝细胞病变因素，其次是Ⅰb型比非Ⅰb型病毒在体内存在时间较长，因长期感染而导致肝硬变和肝癌. Sansonno et al[13]1997年用免疫组化方法对E2/NS-1，C22-3，C33c，C100-3和NS-5抗原进行免疫标记，然后用地高辛标记HCV 5’端非编码区特殊探针进行原位杂交，这种同步杂交方法不但能显示HCV-RNA在细胞亚微结构中的位置，同时保存组织形态，用这种方法检查6例HCV-RNA阳性肝癌和3例HCV-RNA阴性HCC，结果HCV-Ags呈细小颗粒状位于癌组织和非癌细胞胞质中，而在癌细胞的胞质中较少. 每个感染的细胞都显示核心(Core)E和NS-3，-4，-5蛋白. 研究表明HCV在感染的肝细胞中复制，在癌变的组织继续存在，这些蛋白相关的蛋白酶的激活可能作为潜在癌变因子.
, 百拇医药
4 参考文献
1 Choo QL. Isolation of a cDNA clone derived from a blood borne non A,non-B viral hepatitis genome. Science, 1989;244:359-362
2 Simmonds P. Sequence variability in the 5'non-coding region of hepatitis C virus: identification of a new virus type and restrictions
on sequence diversity. J Gen Virol, 1993;74:661-668
3 Simmonds P. A proposed system for the nomenclature of hepatitis C viral genotypes. Hepatology, 1994;19(Suppl):1321-1324
, http://www.100md.com
4 Mizuno M. Virionlike structures in hela G cells transfeted with the fulllength sequence of the hepatitis C viral
genome. Gastroenterology, 1995;109:1933-1940
5 Prescott LE. Detection and clinical features of hepatitis C virus type 6 infections in blood donors from Hong Kong.
J Med Virol, 1996;50:168-175
6 Dhaliwal SK. Influence of viraemia and genotype upon serological reactivity in screening assays for antibody to hepatitis C virus.
, 百拇医药
J Med Virol, 1996;48:184-190
7 Dow BC. Thirdgeneration recombinant immunoblot assay comparison of reactivities according to hepatitis C virus
genotype. Transfusion, 1996;36:547-551-552
8 McGuinness PH. False detection of negativestrand hepatitis C virus RNA [letter; comment]. Lancet, 1994;343:551-552
9 Lanford RE. Lack of detection of negativestrand hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and other
, 百拇医药
extrahepatic tissues by the highly strand-specific rTth reverse transcriptase PCR. J Virol, 1995;69:8079-8083
10 Yamada G. Localization of hepatitis C viral RNA and capsid protein in Human Liver. Dig Dis Sci, 1993;38:882-887
11 Haruna Y. Expression of hepatitis C virus in hepatocellular carcinoma. Cancer, 1994;73:2253-2258
12 Akkiz H. Hepatitis C virus genotypes in patients with hepatocellular carcinoma. J Environ Pathol Toxicol Oncol, 1996;15:85-88
13 Sansonno D. In situ simultaneous detection of hepatitis C virus RNA and hepatitis C virus-related antigens in hepatocellular
carcinoma. Cancer, 1997;80:22-33, 百拇医药(杜竞辉 查文章)