河南食管癌高发区居民食管癌组织p15INK4b 和p16INK4a基因变化的研究
1河南医科大学癌症研究室 河南省郑州市 450052
2Laboratory for Cancer Research, College of Pharmacy, Rutgers University, Piscataway, NJ 08854, USA
*国家自然科学基金.No.39840012和No.39770296；美国NCICA65871和国家人事部重点资助优秀留学回国人员课题.
项目负责人 王立东河南医科大学癌症研究室 河南省郑州市 450052
收稿日期 1998-08-27
, http://www.100md.com
Subject headings esophageal; p15INK4b gene; p16INK4b gene; gene loss
主题词 食管肿瘤；p15INK4b基因；p16INK4b基因；基因缺失
基因丢失导致p16INK4a和(或)p15INK4b对CDK激酶的抑制作用丧失，从而导致细胞增生调节失控[1-3]，目前在多种肿瘤中已发现存在p15INK4b和p16INK4a的失活现象[4-6]. 作者近年对河南食管癌高发区林州市居民的研究证实，肿瘤抑制基因P53蛋白聚集和p53基因突变可发生在食管癌变的极早期阶段，一半以上的食管癌组织出现p53基因的突变[7，8]. 本文研究河南食管癌高发区居民食管癌组织中p15INK4b和p16INK4a纯合缺失和杂合缺失(LOH)的频率、基因启动子区域的甲基化状态，并对DNA测序以检测p16INK4a的突变，探讨p15INK4b和p16INK4a的异常变化与食管癌的关系.
, 百拇医药
1 临床资料
60例外科手术切除标本均来自林州区(原林县)，并均经病理学证实为鳞状细胞癌，在术前均未经化疗与放疗. 选取肿瘤及其邻近正常组织，所有组织均经85%洒精固定，石蜡包埋. 大约20mg正常组织直接用于DNA的提取. 肿瘤组织在显微镜下从相邻4张连续切片上获取. 采用PCR检测p15INK4b和p16INK4a的纯合缺失、杂合缺失及甲基化状态，并经PCR-SSCP-DNA测序，详细方法见以往的报道[7，8].
2 结果
①受检癌组织中，17例发生LOH，位于p15INK4b和p16INK4a之间的D9S942位点的LOH发生率为18%(8/45)，接近p15INK4b的D9S171位点的发生率为53%(10/19)，两者无明显相关性(P=0.682)，提示可能为独立的分子事件. ②60例食管鳞状细胞癌有18%(11/60)的肿瘤组织中存在着p16INK4a的纯合缺失，45%(27/60)存在着p15INK4b的纯合缺失，其中3例同时存在p15INK4b和p16INK4a的纯合缺失. ③对p15INK4b和P16INK4a的纯合缺失与9p21的LOH作了比较，发现D9S942的LOH与p16INK4a的纯合缺失之间无明显相关(P=0.596)，它的发生率在没有p15INK4b缺失的组织中较高(P=0.051)，而D9S171的LOH与p15INK4b的纯合缺失呈明显相关(P=0.015)，无p16INK4a缺失的组织中显著增高. ④对34例原发性鳞癌及其正常组织基因组DNA的CpG岛甲基化状态进行了检测，62%(21/34)的肿瘤组织中出现p16INK4a的异常甲基化，其中10例(29%)表现为高甲基化状态，8例(23%)存在部分甲基化状态，其余3例(10%)显示异常的甲基化模式. 21例甲基化病例中，18例在其正常组织中未发现甲基化现象. 在p15INK4b的启动子区域，仅有8例(24%)存在高甲基化现象. ⑤32例原发性食管鳞癌组织的p16INK4a基因突变分析发现，只有1例在第一外显子出现异常移动带. DNA测序发现该外显子中第20密码子区出现18个碱基对的丢失突变.
, 百拇医药
3 讨论
食管癌组织中p15INK4b纯合缺失和p16INK4a启动子区域甲基化发生频率较高，可能是食管癌发生中的重要分子学事件. p16INK4a启动子区域甲基化可能是p16INK4a失活的主要机制. p16INK4a异常甲基化主要发生在癌组织，而正常组织极少发生. 但p15INK4b和p16INK4a变化之间无明显相关性，提示这两个位于同一染色体、部位很近的基因失活存在不同的机制. p16INK4a基因的表达失活主要是由于启动子区域的异常甲基化，p15INK4b则是基因的缺失. 9p21上高频率的杂合缺失很可能来源于单拷贝p15INK4b基因的早期丢失，进一步探讨p16INK4a和p15INK4b失活在原发性食管鳞状细胞癌发展中的作用时间和相对顺序将加深对其作用机制的理解.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Hartwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer. Science, 1994;266:1821-1828
2 Reynisdottir I, Massague J. The subcellular locations of p15(ink4b) and p27(kip) coordinate their inhibitory interactions with cdk4
and cdk2. Genes Dev, 1997;11;492-503
3 Barret MT, Sanchez CA, Galipeau PC, Neshat K, Emond M, Reid BJ. Allelic loss of 9p21 and mutation of the CDKN2/*!p16 gene
, http://www.100md.com
develop as early lesions during neoplastic progression in Barret's esophagus. Oncogene, 1996;13:1867-1873
4 Flores JF, Walker GJ, Glendening JM, Haluska FG, Castresana JS, Rubio MP, Pastorfice GC, Boyer LA, Kao WH, Bulyk ML,Barnhill RL, Hayward NK, Housman DE, Fountain JW. Loss of the p16INK4a and p15INK4b genes, as well as neighboring 9p21
markers, in sporadic melanoma. Cancer Res, 1996;56:5023-5032
, http://www.100md.com
5 Herman JG, Civin CI, Issa JJ, Collector MI, Sharkis SJ, Baylin SB. Distinct pattern of inactivation of p15INK4B and p16INK4A
characterize the major types of hemotological malignancies. Cancer Res, 1997;57:837-841
6 Yang GY, Zhang Z, Jie L, Seril D, Wang LD, Goldstein S, Yang CS. lmmunohistochemical studies of Waflp21, p16, pRb, and p53
in human esophageal carcinoma and neighboring epithelia from a highrisk area in northern China. Int J Cancer,1997;72:746-751
, 百拇医药
7 Gao H, Wang LD, Zhou Q, Hong JY, Huang TY, Yang CS. P53 tumor suppressor gene mutation in early esophageal
precancerous lesions and carcinoma among high-risk populations in Henan, China. Cancer Res, 1994;54:4342-4346
8 Wang LD, Zhou Q Hong JY, Qiu SL, Yang CS. P53 protein accumulation and gene mutations in multifocal esophageal
precancerous lesions from symptom free subjects in a high incidence area for esophageal carcinoma in Henan,China. Cancer, 1996;77:1244-1249, http://www.100md.com(邹建湘1 王立东1 Xing Eric Poe2 Nie Yan2 白永敏1 Yang Chung.S.2)
2Laboratory for Cancer Research, College of Pharmacy, Rutgers University, Piscataway, NJ 08854, USA
*国家自然科学基金.No.39840012和No.39770296；美国NCICA65871和国家人事部重点资助优秀留学回国人员课题.
项目负责人 王立东河南医科大学癌症研究室 河南省郑州市 450052
收稿日期 1998-08-27
, http://www.100md.com
Subject headings esophageal; p15INK4b gene; p16INK4b gene; gene loss
主题词 食管肿瘤；p15INK4b基因；p16INK4b基因；基因缺失
基因丢失导致p16INK4a和(或)p15INK4b对CDK激酶的抑制作用丧失，从而导致细胞增生调节失控[1-3]，目前在多种肿瘤中已发现存在p15INK4b和p16INK4a的失活现象[4-6]. 作者近年对河南食管癌高发区林州市居民的研究证实，肿瘤抑制基因P53蛋白聚集和p53基因突变可发生在食管癌变的极早期阶段，一半以上的食管癌组织出现p53基因的突变[7，8]. 本文研究河南食管癌高发区居民食管癌组织中p15INK4b和p16INK4a纯合缺失和杂合缺失(LOH)的频率、基因启动子区域的甲基化状态，并对DNA测序以检测p16INK4a的突变，探讨p15INK4b和p16INK4a的异常变化与食管癌的关系.
, 百拇医药
1 临床资料
60例外科手术切除标本均来自林州区(原林县)，并均经病理学证实为鳞状细胞癌，在术前均未经化疗与放疗. 选取肿瘤及其邻近正常组织，所有组织均经85%洒精固定，石蜡包埋. 大约20mg正常组织直接用于DNA的提取. 肿瘤组织在显微镜下从相邻4张连续切片上获取. 采用PCR检测p15INK4b和p16INK4a的纯合缺失、杂合缺失及甲基化状态，并经PCR-SSCP-DNA测序，详细方法见以往的报道[7，8].
2 结果
①受检癌组织中，17例发生LOH，位于p15INK4b和p16INK4a之间的D9S942位点的LOH发生率为18%(8/45)，接近p15INK4b的D9S171位点的发生率为53%(10/19)，两者无明显相关性(P=0.682)，提示可能为独立的分子事件. ②60例食管鳞状细胞癌有18%(11/60)的肿瘤组织中存在着p16INK4a的纯合缺失，45%(27/60)存在着p15INK4b的纯合缺失，其中3例同时存在p15INK4b和p16INK4a的纯合缺失. ③对p15INK4b和P16INK4a的纯合缺失与9p21的LOH作了比较，发现D9S942的LOH与p16INK4a的纯合缺失之间无明显相关(P=0.596)，它的发生率在没有p15INK4b缺失的组织中较高(P=0.051)，而D9S171的LOH与p15INK4b的纯合缺失呈明显相关(P=0.015)，无p16INK4a缺失的组织中显著增高. ④对34例原发性鳞癌及其正常组织基因组DNA的CpG岛甲基化状态进行了检测，62%(21/34)的肿瘤组织中出现p16INK4a的异常甲基化，其中10例(29%)表现为高甲基化状态，8例(23%)存在部分甲基化状态，其余3例(10%)显示异常的甲基化模式. 21例甲基化病例中，18例在其正常组织中未发现甲基化现象. 在p15INK4b的启动子区域，仅有8例(24%)存在高甲基化现象. ⑤32例原发性食管鳞癌组织的p16INK4a基因突变分析发现，只有1例在第一外显子出现异常移动带. DNA测序发现该外显子中第20密码子区出现18个碱基对的丢失突变.
, 百拇医药
3 讨论
食管癌组织中p15INK4b纯合缺失和p16INK4a启动子区域甲基化发生频率较高，可能是食管癌发生中的重要分子学事件. p16INK4a启动子区域甲基化可能是p16INK4a失活的主要机制. p16INK4a异常甲基化主要发生在癌组织，而正常组织极少发生. 但p15INK4b和p16INK4a变化之间无明显相关性，提示这两个位于同一染色体、部位很近的基因失活存在不同的机制. p16INK4a基因的表达失活主要是由于启动子区域的异常甲基化，p15INK4b则是基因的缺失. 9p21上高频率的杂合缺失很可能来源于单拷贝p15INK4b基因的早期丢失，进一步探讨p16INK4a和p15INK4b失活在原发性食管鳞状细胞癌发展中的作用时间和相对顺序将加深对其作用机制的理解.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Hartwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer. Science, 1994;266:1821-1828
2 Reynisdottir I, Massague J. The subcellular locations of p15(ink4b) and p27(kip) coordinate their inhibitory interactions with cdk4
and cdk2. Genes Dev, 1997;11;492-503
3 Barret MT, Sanchez CA, Galipeau PC, Neshat K, Emond M, Reid BJ. Allelic loss of 9p21 and mutation of the CDKN2/*!p16 gene
, http://www.100md.com
develop as early lesions during neoplastic progression in Barret's esophagus. Oncogene, 1996;13:1867-1873
4 Flores JF, Walker GJ, Glendening JM, Haluska FG, Castresana JS, Rubio MP, Pastorfice GC, Boyer LA, Kao WH, Bulyk ML,Barnhill RL, Hayward NK, Housman DE, Fountain JW. Loss of the p16INK4a and p15INK4b genes, as well as neighboring 9p21
markers, in sporadic melanoma. Cancer Res, 1996;56:5023-5032
, http://www.100md.com
5 Herman JG, Civin CI, Issa JJ, Collector MI, Sharkis SJ, Baylin SB. Distinct pattern of inactivation of p15INK4B and p16INK4A
characterize the major types of hemotological malignancies. Cancer Res, 1997;57:837-841
6 Yang GY, Zhang Z, Jie L, Seril D, Wang LD, Goldstein S, Yang CS. lmmunohistochemical studies of Waflp21, p16, pRb, and p53
in human esophageal carcinoma and neighboring epithelia from a highrisk area in northern China. Int J Cancer,1997;72:746-751
, 百拇医药
7 Gao H, Wang LD, Zhou Q, Hong JY, Huang TY, Yang CS. P53 tumor suppressor gene mutation in early esophageal
precancerous lesions and carcinoma among high-risk populations in Henan, China. Cancer Res, 1994;54:4342-4346
8 Wang LD, Zhou Q Hong JY, Qiu SL, Yang CS. P53 protein accumulation and gene mutations in multifocal esophageal
precancerous lesions from symptom free subjects in a high incidence area for esophageal carcinoma in Henan,China. Cancer, 1996;77:1244-1249, http://www.100md.com(邹建湘1 王立东1 Xing Eric Poe2 Nie Yan2 白永敏1 Yang Chung.S.2)