结直肠癌ras P21表达和DNA含量分析
四川省泸州医学院附属医院胃肠外科 四川省泸州市 646000
中山医科大学附一院 广东省广州市 510080
项目负责人 徐亮四川省泸州医学院附属医院胃肠外科 四川省泸州市 646000
收稿日期 1999-03-06 接收日期 1999-03-30
Subject headings coloreclal neoplasms; ras P21 gene; deoxyribonucleic acid/analysis
主题词 结直肠肿瘤；ras P21基因；脱氧核糖核酸/分析
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 以1994-12/1995-05施行手术的大肠良、恶性肿瘤46例，其中结直肠癌35例，肿瘤8例，腺瘤恶变3例. 手术切除的标本经冲洗清洁后，分别切取癌组织、癌旁2cm处移行粘膜及距癌肿10cm以上正常粘膜，0.5cm×0.3cm×0.3cm，腺瘤及腺瘤恶变者只取肿瘤组织. 所取组织均行石蜡包埋存档备检.
1.2 方法 DNA检测的单细胞悬液样品的制备. 将石蜡包埋组织切片(厚40μm),按Hedley et al[1]法制备. 细胞免疫荧光染色样品经二甲苯脱蜡后，用间接免疫荧光标记法. 对照组：正常结肠粘膜；PBS液代替第1抗体的阴性对照；仅加第1抗体的阳性对照；仅加第2抗体的阳性对照. 按要求测量流式细胞术，最后分析测量资料，按Morkve[2]方法进行. 术后9mo开始信访、电话或门诊随访.
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2 结果
2.1 P21表达情况 正常粘膜P21表达阴性，癌旁移行粘膜P21表达量为1.1±0.2，阳性率为60%，癌组织P21表达量为1.4±0.3阳性率为65.7%，两者阳性率比较无差异(P>0.05)，P21表达量比较有显著性差异(P<0.05). 腺瘤恶变的P21表达量为1.5±0.2，腺瘤的P21表达量为1.0±0.2，两者比较有显著性差异(P<0.01)，但前者与癌组织比较无显著性差异(P>0.05.)
2.2 P21表达与大肠癌分期及病理分型 P21表达量与阳性率与大肠癌Dukes分期及病理组织学分类均无关(P>0.05).
2.3 DNA含量分析 正常结肠粘膜DNA含量分析均为二倍体细胞，癌组织DNA含量异倍体率为74.3%(26/35). Dukes分期各期之间异倍体率比较. P>0.05，但C+D期的DI值与A+B的DI值比较，P<0.05. 表明分期越晚，DI值越高. 乳头状腺癌的DI值和异倍体率均低于其他组织类型(P<0.05)，但其他各组织学类型之间的DNA异倍体率无显著差异(P>0.05).
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2.4 大肠癌DNA倍体与PI值及P21表达 二倍体癌的PI值为18.6±2.5，与异倍体癌的PI值23.3±2.6比较，有显著性差异(P<0.05)；且前者P21阳性率为33.3%，后者为77.0%，两者比较也有显著性差异(P<0.01). P21表达阳性的大肠癌PI值为23.1±2.2，P21表达阴性者为19.2±2.4，两者比较，P<0.05.
在结直肠肿瘤46例中，除3例失访外，其余43例获随访12mo～36mo. 其中7例分别在术后9，11，12，18，30，32和36mo发现肝或腹腔转移，该7例中有6例癌组织的DNA均为异倍体，3例P21为阳性表达.
3 讨论
大肠癌的发生是与多种基因有关的多步骤过程，ras基因变化可能是较早期的基因变化，它通过第12，13或61位密码子的点突变或基因产物Ras P21的过度表达参与肿瘤的发生. Ras P21是ras基因的共同编码蛋白，位于细胞浆膜内面. 具有与鸟苷酸结合的能力GTP酶活性，参与细胞的信号传递. ras基因突变激活后，P21过度表达，细胞信号传递发生紊乱，刺激细胞异常生长，最终导致恶性转化[3]. 有研究表明，ras基因的激活及P21的过度表达与大肠癌密切相关，癌组织中40%～65%有k-ras基因突变，伴ras基因突变者较不伴ras基因突变者的转移率高[4，5].
, 百拇医药
本研究以同时含有可分割的大肠正常粘膜、癌旁移行粘膜、癌组织及腺瘤的手术切除标本为研究材料，它们分别代表了大肠癌发生发展的不同阶段，各样本之间有完全相同的遗传特征和相同的致癌因子作用，因而具有高度的可比性. 结果表明，正常粘膜P21表达阴性，腺瘤恶变者 P21表达量与阳性率均高于腺瘤，癌组织的P21表达阳性率与其癌旁移行粘膜趋于一致，但表达量高于移行粘膜，说明P21过度表达参与了大肠癌的发生发展过程，并且可能出现在潜在恶性程度较高及向癌转化的关键阶段中. 因此，可将P21作为大肠癌早期诊断的一个生物学指标. 本研究结果还表明， P21表达量和阳性率与大肠癌的组织学类型及Dukes分期无关，与Scott et al[5]的研究结果相同. 癌旁移行粘膜在病理上有不同程度的上皮细胞增生，在形态学发生明显改变前，有CEA增高，DNA异倍体出现及c-myc和ras基因高表达，因而认为移行粘膜属于癌前病变[6，7]. 本研究发现，移行粘膜 P21表达量可能在细胞的分化及增殖中起着重要作用. 认识这一生物学特性，外科手术时就应切除足够范围的 P21表达阳性的移行粘膜，防止术后局部复发.
, 百拇医药
应用流式细胞术定量分析肿瘤细胞DNA含量，可从核酸代谢分子水平上了解肿瘤细胞的增殖力学规律. 本研究对大肠癌DNA含量的分析表明，癌组织的DNA异倍体率与Dukes分期及组织学类型无明显关系，但DNA含量(DI值)与Dukes分期有一定关系，分期愈晚DI值愈高；其细胞增殖活性是异倍体癌高于二倍体癌. 有文献报道，大肠癌的DNA含量及细胞增殖活性与预后有关，二倍体癌的五年生存率明显高于异倍体癌[8]. 本组随访中，7例复发转移者6例为异倍体癌(P<0.01). 因此，测量DNA含量可能是判断大肠癌预后的理想指标，因为它比临床分期和病理分型更客观精确[1].
肿瘤的发生与DNA含量及细胞周期失控有关，后者又与细胞信号传递紊乱有关，而P21助于认识其生物学行为. 本组异倍体癌的 P21阳性率高于二倍体癌，P21阳性癌的增殖活性高于P21阴性者，提示P21的表达量与DNA倍体有关，晚期结肠癌的P21阳性率较高[1，2，9]. 由此可推测，P21过度表达，使细胞信号系统功能紊乱，DNA含量发生改变，细胞异常增殖，致恶性转化. 因此，对P21表达和DNA含量的检测可帮助早期诊断大肠癌和判断预后，但能否成为一个独立指标，有待进一步探讨.
, 百拇医药
4 参考文献
1 徐亮，卢光宇. 结直肠癌DNA含量分析. 泸州医学院学报. 1996；19：182-185
2 徐亮，卢光宇. 大肠癌ras P21表达的定量研究. 泸州医学院学报. 1998；21：181-183
3 徐亮. 卢光宇. ras癌基因与大肠癌. 泸州医学院学报. 1996；19：325-328
4 Bos JL. Ras oncogene in human cancer. Cancer Res, 1989;49:4682-4684
5 Scott N, Quirke P. Molecular biology of colorectal neoplasia. Gut, 1993;34:289-294
, 百拇医药
6 Jansson DS. An immunohistochemical analysis of ras oncogene expression in epithelial neoplasms of the colon.
Cancer, 1990;65:1329-1339
7 Wang Q. Biopathologic characteristics of DNA content in crypt cells of transitional mucosa adjacent to carcinoma of the rectum
and rectosigmoid. Dis Colon Rectum, 1992;25:670-672
8 Merkel DE, Mcguire WL, Ploidy proliferative activity and prognosis, DNA flow cytometry of solid tumors. Cancer,
1990;65:1194-1196
9 Sun XF. Ras P21 expression in relation to DNA ploidy, S-phase fraction and prognosis in colorectal adenocarcinomas.
Cytometry, 1991;Suppl 5:59-61, 百拇医药(徐 亮 卢光宇)
中山医科大学附一院 广东省广州市 510080
项目负责人 徐亮四川省泸州医学院附属医院胃肠外科 四川省泸州市 646000
收稿日期 1999-03-06 接收日期 1999-03-30
Subject headings coloreclal neoplasms; ras P21 gene; deoxyribonucleic acid/analysis
主题词 结直肠肿瘤；ras P21基因；脱氧核糖核酸/分析
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1 材料和方法
1.1 材料 以1994-12/1995-05施行手术的大肠良、恶性肿瘤46例，其中结直肠癌35例，肿瘤8例，腺瘤恶变3例. 手术切除的标本经冲洗清洁后，分别切取癌组织、癌旁2cm处移行粘膜及距癌肿10cm以上正常粘膜，0.5cm×0.3cm×0.3cm，腺瘤及腺瘤恶变者只取肿瘤组织. 所取组织均行石蜡包埋存档备检.
1.2 方法 DNA检测的单细胞悬液样品的制备. 将石蜡包埋组织切片(厚40μm),按Hedley et al[1]法制备. 细胞免疫荧光染色样品经二甲苯脱蜡后，用间接免疫荧光标记法. 对照组：正常结肠粘膜；PBS液代替第1抗体的阴性对照；仅加第1抗体的阳性对照；仅加第2抗体的阳性对照. 按要求测量流式细胞术，最后分析测量资料，按Morkve[2]方法进行. 术后9mo开始信访、电话或门诊随访.
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2 结果
2.1 P21表达情况 正常粘膜P21表达阴性，癌旁移行粘膜P21表达量为1.1±0.2，阳性率为60%，癌组织P21表达量为1.4±0.3阳性率为65.7%，两者阳性率比较无差异(P>0.05)，P21表达量比较有显著性差异(P<0.05). 腺瘤恶变的P21表达量为1.5±0.2，腺瘤的P21表达量为1.0±0.2，两者比较有显著性差异(P<0.01)，但前者与癌组织比较无显著性差异(P>0.05.)
2.2 P21表达与大肠癌分期及病理分型 P21表达量与阳性率与大肠癌Dukes分期及病理组织学分类均无关(P>0.05).
2.3 DNA含量分析 正常结肠粘膜DNA含量分析均为二倍体细胞，癌组织DNA含量异倍体率为74.3%(26/35). Dukes分期各期之间异倍体率比较. P>0.05，但C+D期的DI值与A+B的DI值比较，P<0.05. 表明分期越晚，DI值越高. 乳头状腺癌的DI值和异倍体率均低于其他组织类型(P<0.05)，但其他各组织学类型之间的DNA异倍体率无显著差异(P>0.05).
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2.4 大肠癌DNA倍体与PI值及P21表达 二倍体癌的PI值为18.6±2.5，与异倍体癌的PI值23.3±2.6比较，有显著性差异(P<0.05)；且前者P21阳性率为33.3%，后者为77.0%，两者比较也有显著性差异(P<0.01). P21表达阳性的大肠癌PI值为23.1±2.2，P21表达阴性者为19.2±2.4，两者比较，P<0.05.
在结直肠肿瘤46例中，除3例失访外，其余43例获随访12mo～36mo. 其中7例分别在术后9，11，12，18，30，32和36mo发现肝或腹腔转移，该7例中有6例癌组织的DNA均为异倍体，3例P21为阳性表达.
3 讨论
大肠癌的发生是与多种基因有关的多步骤过程，ras基因变化可能是较早期的基因变化，它通过第12，13或61位密码子的点突变或基因产物Ras P21的过度表达参与肿瘤的发生. Ras P21是ras基因的共同编码蛋白，位于细胞浆膜内面. 具有与鸟苷酸结合的能力GTP酶活性，参与细胞的信号传递. ras基因突变激活后，P21过度表达，细胞信号传递发生紊乱，刺激细胞异常生长，最终导致恶性转化[3]. 有研究表明，ras基因的激活及P21的过度表达与大肠癌密切相关，癌组织中40%～65%有k-ras基因突变，伴ras基因突变者较不伴ras基因突变者的转移率高[4，5].
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本研究以同时含有可分割的大肠正常粘膜、癌旁移行粘膜、癌组织及腺瘤的手术切除标本为研究材料，它们分别代表了大肠癌发生发展的不同阶段，各样本之间有完全相同的遗传特征和相同的致癌因子作用，因而具有高度的可比性. 结果表明，正常粘膜P21表达阴性，腺瘤恶变者 P21表达量与阳性率均高于腺瘤，癌组织的P21表达阳性率与其癌旁移行粘膜趋于一致，但表达量高于移行粘膜，说明P21过度表达参与了大肠癌的发生发展过程，并且可能出现在潜在恶性程度较高及向癌转化的关键阶段中. 因此，可将P21作为大肠癌早期诊断的一个生物学指标. 本研究结果还表明， P21表达量和阳性率与大肠癌的组织学类型及Dukes分期无关，与Scott et al[5]的研究结果相同. 癌旁移行粘膜在病理上有不同程度的上皮细胞增生，在形态学发生明显改变前，有CEA增高，DNA异倍体出现及c-myc和ras基因高表达，因而认为移行粘膜属于癌前病变[6，7]. 本研究发现，移行粘膜 P21表达量可能在细胞的分化及增殖中起着重要作用. 认识这一生物学特性，外科手术时就应切除足够范围的 P21表达阳性的移行粘膜，防止术后局部复发.
, 百拇医药
应用流式细胞术定量分析肿瘤细胞DNA含量，可从核酸代谢分子水平上了解肿瘤细胞的增殖力学规律. 本研究对大肠癌DNA含量的分析表明，癌组织的DNA异倍体率与Dukes分期及组织学类型无明显关系，但DNA含量(DI值)与Dukes分期有一定关系，分期愈晚DI值愈高；其细胞增殖活性是异倍体癌高于二倍体癌. 有文献报道，大肠癌的DNA含量及细胞增殖活性与预后有关，二倍体癌的五年生存率明显高于异倍体癌[8]. 本组随访中，7例复发转移者6例为异倍体癌(P<0.01). 因此，测量DNA含量可能是判断大肠癌预后的理想指标，因为它比临床分期和病理分型更客观精确[1].
肿瘤的发生与DNA含量及细胞周期失控有关，后者又与细胞信号传递紊乱有关，而P21助于认识其生物学行为. 本组异倍体癌的 P21阳性率高于二倍体癌，P21阳性癌的增殖活性高于P21阴性者，提示P21的表达量与DNA倍体有关，晚期结肠癌的P21阳性率较高[1，2，9]. 由此可推测，P21过度表达，使细胞信号系统功能紊乱，DNA含量发生改变，细胞异常增殖，致恶性转化. 因此，对P21表达和DNA含量的检测可帮助早期诊断大肠癌和判断预后，但能否成为一个独立指标，有待进一步探讨.
, 百拇医药
4 参考文献
1 徐亮，卢光宇. 结直肠癌DNA含量分析. 泸州医学院学报. 1996；19：182-185
2 徐亮，卢光宇. 大肠癌ras P21表达的定量研究. 泸州医学院学报. 1998；21：181-183
3 徐亮. 卢光宇. ras癌基因与大肠癌. 泸州医学院学报. 1996；19：325-328
4 Bos JL. Ras oncogene in human cancer. Cancer Res, 1989;49:4682-4684
5 Scott N, Quirke P. Molecular biology of colorectal neoplasia. Gut, 1993;34:289-294
, 百拇医药
6 Jansson DS. An immunohistochemical analysis of ras oncogene expression in epithelial neoplasms of the colon.
Cancer, 1990;65:1329-1339
7 Wang Q. Biopathologic characteristics of DNA content in crypt cells of transitional mucosa adjacent to carcinoma of the rectum
and rectosigmoid. Dis Colon Rectum, 1992;25:670-672
8 Merkel DE, Mcguire WL, Ploidy proliferative activity and prognosis, DNA flow cytometry of solid tumors. Cancer,
1990;65:1194-1196
9 Sun XF. Ras P21 expression in relation to DNA ploidy, S-phase fraction and prognosis in colorectal adenocarcinomas.
Cytometry, 1991;Suppl 5:59-61, 百拇医药(徐 亮 卢光宇)