结肠癌细胞株p16基因甲基化的研究
第四军医大学唐都医院普通外科 陕西省西安市 710038
赖大年，男，1949-12-30生，重庆市人，汉族，1975年第四军医大学医疗系毕业，学士，1996年第四军医大学硕士，教授，副主任，主要从事胃肠病的诊治研究，发表论文25篇.
项目负责人 赖大年，710038，陕西省西安市，第四军医大学唐都医院普外科.
Correspondence to Dr. Da-Nian Lai, the Department of General Surgery, Tangdu Hospital, the Fourth Military
Medical University, Xian 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Tel. +86·29·3510595 Ext.77331
收稿日期 1999-03-06 接收日期 1999-06-03
Study on P16 gene aberrant methylation of colon cancer cell lines
Da-Nian Lai, Yuan-Feng Xie, Ling Bian and Xiu Yao
Department of General Surgery, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the inactivation mode of P16 gene in colon cancer.
METHODS The methylation rate of P16 gene in colon cancer cell lines (Colo205, HT29, SW480, HR8348, Colo320, LSIGT9695)and 18 cases of normal colonic tissues were examined by using Southern blot method.
RESULTS The aberrant methylation of 5CpG island of P16 gene was found to be positive in 5 of 6 (83.3%) colon cancer cell lines. In contrast, only 5 of 18(27.8%)normal colonic tissues showed aberrant methylation of the 5CpG island of P16 gene.
, 百拇医药
CONCLUSION The P16 gene in colon cancer is inactivated by aberrant methylation. This can provide a new tactics and a new target for gene therapy of colon cancer.
Subject headings colon cancer; P16 gene; methylation; gene therapy
Lai DN, Xie YF, Bian L, Yao X. Study on p16 gene aberrant methylation of colon cancer cell lines.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(8):676-678
, 百拇医药
摘要
目的 研究结肠癌中p16基因的失活方式.
方法 采用Southernblot法鉴定了结肠癌细胞株SW480,Colon205,HR8348,HT29,Colo320,LSIGT9695及18例正常结肠粘膜组织中p16基因的甲基化情况.
结果 在6株结肠癌细胞株中有5株(83.3%)p16基因CpG岛呈异常甲基化状态,与之相对,18例正常结肠粘膜组织中仅5例(27.8%)表现为异常甲基化.
结论 在结肠癌中p16基因因异常甲基化而失活,这为结肠癌的基因治疗提供了新策略、新目标.
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主题词 结肠癌;p16基因;甲基化;基因治疗
赖大年, 解远峰, 卞玲, 要秀.结肠癌细胞株p16基因甲基化的研究.世界华人消化杂志,1999;7(8):676-678
0 引言
P16基因为新发现的抑癌基因，在多种肿瘤中都检测到同源性缺失或杂合子丢失，但结肠癌却几乎是唯一的例外[1]，无论用何种方法都未发现结肠癌中P16基因有上述失活方式. James et al[2]报道在结肠癌细胞中发现P16基因呈异常甲基化状态，并认为此发现意义重大，但Mirella et al[3]认为正常结肠粘膜中也存在P16基因甲基化. 故对甲基化在结肠癌的意义目前仍存在争议. 国内尚无此方面的报道. 本文即通过Southern blot法鉴定结肠癌细胞株及正常结肠粘膜组织之间甲基化率的差异，以确定结肠癌中P16基因是否以甲基化方式失活，以指导临床基因治疗结肠癌.
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1 材料和方法
1.1 材料 本实验共培养结肠癌细胞六株，分别是SW480，Colon205，HR8348，HT29，Colo320，LSIGT9695. 同时培养一株胆管癌细胞QBC939作为阴性对照. 其中SW480由我校口腔中心实验室惠赠. Colo205由我校免疫教研室惠赠. HR8348由本科实验室提供. 其余四株细胞均购自北京301医院. 从本院普外科收集经质控合格的新鲜结肠癌标本18例，每例均在无菌条件下取手术切缘处正常结肠粘膜组织一块. 限制性内切酶HindⅢ及SacⅡ购自西安华美公司，地高辛标记的P16基因探针购自北京中山生物技术有限公司.
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取及纯化： 细胞及组织基因组DNA提取及纯化按《分子克隆实验指南》进行[4]. 用紫外分光光度计检测使其纯度达到2>OD260/OD280>1.8，使其浓度在0.4g/L～0.6g/L左右.
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1.2.2 基因组DNA的限制性酶切： 每份DNA取5ug(约10uL)，加入1kμ/L的HindⅢ 1uL，2kμ/L的SacⅡ 1uL，buffer C 2uL，蒸馏水16uL组成30uL的酶切体系，置于37℃水浴6h. 1%琼脂糖凝胶电泳观察.
1.2.3 Southern blot: 电泳结束后，将琼脂糖凝胶进行碱变性及中和处理，再将胶上DNA用毛细管法转印在硝酸纤维素膜上. 将地高辛标记好的基因探针与滤膜杂交，然后进行显色反应. 方法按姜泊et al[5]所述《分子生物学常用方法》进行.
2 结果
当仅HindⅢ发挥了酶切作用时，可得到一条6kb长的片段；若HindⅢ及SacⅡ均发挥了作用时则可得到一条3.9kb长的片段(图1). 所以，当杂交出的亮带位于6kb处，说明P16基因CpG岛已发生了甲基化，对甲基化敏感的SacⅡ未能发挥作用. 同理，3.9kb处有亮带则表明P16基因CpG岛未甲基化(结果见表1).
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图1 P16基因酶谱. 其中PEl为Southern杂交所用探针，第二行中的长方块为外显子1～3，可见其上有甲基敏感酶SacⅡ(Sa)的酶切位点及对甲基化不敏感的HindⅢ(H3)的酶切位点. 基因下附图为CpG及GpC岛上二核苷酸的密度. 最下边的图为酶切后片段长度.
表1 结肠癌细胞株正常结肠粘膜中P16基因的甲基化情况
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χ2检验 癌细胞株与正常结肠粘膜组织之间 aP<0.05，相差显著.
图2的1处的亮带为阴性对照，为胆管癌细胞QBC939 DNA杂交后结果；4处的空白为电泳时分子量标准物杂交结果，所用为λ-噬菌体HindⅢ酶解片段. 其余各处为样品DNA杂交结果. 以上图注亦适用图3～图5. 图2中样品所加顺序依次为SW480，Colon205，HR8348，HT29，Colo320，LSIGT9695.
图2 结肠癌细胞株转印后杂交结果.
图3 第1至第6例正常组织转印后杂交结果.
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图4 第7至第12例正常组织转印后杂交结果.
图5 第13至第18例正常组织转印后杂交结果.
3 讨论
Southern blot法为研究DNA分子特点的经典方法，灵敏度和可信度都较高. 本实验采用此法在国内首次鉴定了6株结肠癌细胞株及正常结肠粘膜组织之间甲基化率的差异情况. 结果表明两者之间P16基因的甲基化率存在显著差异，说明在结肠癌中P16基因因甲基化而失活，此结果证实了James等人论断正确.
结肠癌为常见的恶性肿瘤，从理论上讲P16基因作为细胞周期直接抑制因子，在结肠癌中亦应有较高的突变率. 令人不解的是经免疫组化和Southern blot法反复检测，目前国内外尚未发现结肠癌中存在常见的纯合性缺失或杂合子丢失等失活方式. DNA甲基化为一少见的DNA失活方式，甲基化一般发生在DNA5起始区或调节CpG岛上[6]. 抑癌基因甲基化后，不能正常转录、翻译出抑癌蛋白，无法发挥抑癌作用，细胞就可能发生癌变. 在结肠癌中甲基化失活方式的发现对结肠癌的临床诊治意义重大. ①P16基因甲基化与结肠癌的诊断 P16基因甲基化失活方式与其他突变方式一样，在结肠癌的发生中起关键性的闸门作用. 与P53基因突变属晚期分子事件不同，P16基因甲基化失活属早期生化事件. P16基因甲基化的发现为结肠癌的早期诊断提供了一条新途径. 临床上可以采用灵敏、无创的方法检测患者P16基因甲基化情况，如检测患者粪便中的P16基因的甲基化率，可普查及诊断早期结肠癌，其准确性及早期性将优于以往的任何方法. ②P16基因甲基化与结肠癌的治疗 目前将P16基因转入癌细胞中已有达到逆转目的的报道. Arap et al[7]将全长P16基因转入人神经母细胞瘤中，观察到明显细胞生长受抑. 目前尚无将P16基因转入结肠癌中有阳性结果的报道. P16基因甲基化的发现，提示如果向结肠癌中转入P16基因，脱甲基剂的应用应引起重视. 由于体内存在甲基化环境，只单纯地转入P16基因，可能短期内有效，但很快会被甲基化而达不到长期逆转异质性的目的，如果联合应用脱甲基剂，就有可能达到预期目的.
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人体是复杂的平衡系统，仅这些结果尚不能解决实际问题，但它为结肠癌的基因治疗提供了新策略和新目标. 以后可以用更灵敏、更准确的方法来获得更详实的资料，如体内的甲基化环境其始动因素及还原因素都是什么结肠癌中的P16基因为什么选择此种甲基化失活方式其他抑癌基因有无这种失活方式各期结肠癌及各种结肠病中P16基因的甲基化率有无差异等，这些都需要科研工作者作进一步的深入研究.
4 参考文献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver FJ, Liu Q, Harshaman K, Tavtigian SV, Stochert E, Day RS. A cell regulator potentially involved in genesis
of many tumor types. Science, 1994;264:436-440
, 百拇医药
2 James G, Herman, Adrian M, LiMao, Rena G, Lapodus, Jean-Pierre JI, Nancy E, Davidson. Inactivity of the CDKN2/p16/MTSl gene
is frequently associated with aberrant methylationin all common human cancer. Cancer Res, 1995;55:4525-4530
3 Mirella GZ, Chrislina M, Bender, Allen SY, TuDuang N, Robert WB, Jan MV, Peter AJ. Methylation of the 5-CpG island of the p16
tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing. Cancer Res, 1995;55:4531-4535
, 百拇医药
4 Sam brook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual 2nd ed. Beijing: Science press, 1992:463-468
5 Jiang B. The common experimental methods in molecular biology. Beijing: People's military medic press, 1996:70-80
6 Jones PA, Taylor SM. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell, 1980;20:85-93
7 Arap W, Nishikawa R, Furnari, Ryo NK, Frank BF, Webster KC, WuHuang HJ. Replacement of the p16/CDKN2 gene suppresses
human glioma cell growth. Cancer Res, 1995;55:1351-1354, 百拇医药(赖大年 解远峰 卞玲 要秀)
赖大年，男，1949-12-30生，重庆市人，汉族，1975年第四军医大学医疗系毕业，学士，1996年第四军医大学硕士，教授，副主任，主要从事胃肠病的诊治研究，发表论文25篇.
项目负责人 赖大年，710038，陕西省西安市，第四军医大学唐都医院普外科.
Correspondence to Dr. Da-Nian Lai, the Department of General Surgery, Tangdu Hospital, the Fourth Military
Medical University, Xian 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Tel. +86·29·3510595 Ext.77331
收稿日期 1999-03-06 接收日期 1999-06-03
Study on P16 gene aberrant methylation of colon cancer cell lines
Da-Nian Lai, Yuan-Feng Xie, Ling Bian and Xiu Yao
Department of General Surgery, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University, Xian 710038, Shaanxi Province, China
, 百拇医药
Abstract
AIM To study the inactivation mode of P16 gene in colon cancer.
METHODS The methylation rate of P16 gene in colon cancer cell lines (Colo205, HT29, SW480, HR8348, Colo320, LSIGT9695)and 18 cases of normal colonic tissues were examined by using Southern blot method.
RESULTS The aberrant methylation of 5CpG island of P16 gene was found to be positive in 5 of 6 (83.3%) colon cancer cell lines. In contrast, only 5 of 18(27.8%)normal colonic tissues showed aberrant methylation of the 5CpG island of P16 gene.
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CONCLUSION The P16 gene in colon cancer is inactivated by aberrant methylation. This can provide a new tactics and a new target for gene therapy of colon cancer.
Subject headings colon cancer; P16 gene; methylation; gene therapy
Lai DN, Xie YF, Bian L, Yao X. Study on p16 gene aberrant methylation of colon cancer cell lines.
Shijie Huaren Xiaohua Zazhi,1999;7(8):676-678
, 百拇医药
摘要
目的 研究结肠癌中p16基因的失活方式.
方法 采用Southernblot法鉴定了结肠癌细胞株SW480,Colon205,HR8348,HT29,Colo320,LSIGT9695及18例正常结肠粘膜组织中p16基因的甲基化情况.
结果 在6株结肠癌细胞株中有5株(83.3%)p16基因CpG岛呈异常甲基化状态,与之相对,18例正常结肠粘膜组织中仅5例(27.8%)表现为异常甲基化.
结论 在结肠癌中p16基因因异常甲基化而失活,这为结肠癌的基因治疗提供了新策略、新目标.
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主题词 结肠癌;p16基因;甲基化;基因治疗
赖大年, 解远峰, 卞玲, 要秀.结肠癌细胞株p16基因甲基化的研究.世界华人消化杂志,1999;7(8):676-678
0 引言
P16基因为新发现的抑癌基因，在多种肿瘤中都检测到同源性缺失或杂合子丢失，但结肠癌却几乎是唯一的例外[1]，无论用何种方法都未发现结肠癌中P16基因有上述失活方式. James et al[2]报道在结肠癌细胞中发现P16基因呈异常甲基化状态，并认为此发现意义重大，但Mirella et al[3]认为正常结肠粘膜中也存在P16基因甲基化. 故对甲基化在结肠癌的意义目前仍存在争议. 国内尚无此方面的报道. 本文即通过Southern blot法鉴定结肠癌细胞株及正常结肠粘膜组织之间甲基化率的差异，以确定结肠癌中P16基因是否以甲基化方式失活，以指导临床基因治疗结肠癌.
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1 材料和方法
1.1 材料 本实验共培养结肠癌细胞六株，分别是SW480，Colon205，HR8348，HT29，Colo320，LSIGT9695. 同时培养一株胆管癌细胞QBC939作为阴性对照. 其中SW480由我校口腔中心实验室惠赠. Colo205由我校免疫教研室惠赠. HR8348由本科实验室提供. 其余四株细胞均购自北京301医院. 从本院普外科收集经质控合格的新鲜结肠癌标本18例，每例均在无菌条件下取手术切缘处正常结肠粘膜组织一块. 限制性内切酶HindⅢ及SacⅡ购自西安华美公司，地高辛标记的P16基因探针购自北京中山生物技术有限公司.
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取及纯化： 细胞及组织基因组DNA提取及纯化按《分子克隆实验指南》进行[4]. 用紫外分光光度计检测使其纯度达到2>OD260/OD280>1.8，使其浓度在0.4g/L～0.6g/L左右.
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1.2.2 基因组DNA的限制性酶切： 每份DNA取5ug(约10uL)，加入1kμ/L的HindⅢ 1uL，2kμ/L的SacⅡ 1uL，buffer C 2uL，蒸馏水16uL组成30uL的酶切体系，置于37℃水浴6h. 1%琼脂糖凝胶电泳观察.
1.2.3 Southern blot: 电泳结束后，将琼脂糖凝胶进行碱变性及中和处理，再将胶上DNA用毛细管法转印在硝酸纤维素膜上. 将地高辛标记好的基因探针与滤膜杂交，然后进行显色反应. 方法按姜泊et al[5]所述《分子生物学常用方法》进行.
2 结果
当仅HindⅢ发挥了酶切作用时，可得到一条6kb长的片段；若HindⅢ及SacⅡ均发挥了作用时则可得到一条3.9kb长的片段(图1). 所以，当杂交出的亮带位于6kb处，说明P16基因CpG岛已发生了甲基化，对甲基化敏感的SacⅡ未能发挥作用. 同理，3.9kb处有亮带则表明P16基因CpG岛未甲基化(结果见表1).
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图1 P16基因酶谱. 其中PEl为Southern杂交所用探针，第二行中的长方块为外显子1～3，可见其上有甲基敏感酶SacⅡ(Sa)的酶切位点及对甲基化不敏感的HindⅢ(H3)的酶切位点. 基因下附图为CpG及GpC岛上二核苷酸的密度. 最下边的图为酶切后片段长度.
表1 结肠癌细胞株正常结肠粘膜中P16基因的甲基化情况
| 项目 | 甲基化 | 未甲基化 | 甲基化率 |
| 癌细胞株 | 5 | 1 | 83.3% |
| 正常粘膜 | 5 | 13 | 27.8% |
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χ2检验 癌细胞株与正常结肠粘膜组织之间 aP<0.05，相差显著.
图2的1处的亮带为阴性对照，为胆管癌细胞QBC939 DNA杂交后结果；4处的空白为电泳时分子量标准物杂交结果，所用为λ-噬菌体HindⅢ酶解片段. 其余各处为样品DNA杂交结果. 以上图注亦适用图3～图5. 图2中样品所加顺序依次为SW480，Colon205，HR8348，HT29，Colo320，LSIGT9695.
图2 结肠癌细胞株转印后杂交结果.
图3 第1至第6例正常组织转印后杂交结果.
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图4 第7至第12例正常组织转印后杂交结果.
图5 第13至第18例正常组织转印后杂交结果.
3 讨论
Southern blot法为研究DNA分子特点的经典方法，灵敏度和可信度都较高. 本实验采用此法在国内首次鉴定了6株结肠癌细胞株及正常结肠粘膜组织之间甲基化率的差异情况. 结果表明两者之间P16基因的甲基化率存在显著差异，说明在结肠癌中P16基因因甲基化而失活，此结果证实了James等人论断正确.
结肠癌为常见的恶性肿瘤，从理论上讲P16基因作为细胞周期直接抑制因子，在结肠癌中亦应有较高的突变率. 令人不解的是经免疫组化和Southern blot法反复检测，目前国内外尚未发现结肠癌中存在常见的纯合性缺失或杂合子丢失等失活方式. DNA甲基化为一少见的DNA失活方式，甲基化一般发生在DNA5起始区或调节CpG岛上[6]. 抑癌基因甲基化后，不能正常转录、翻译出抑癌蛋白，无法发挥抑癌作用，细胞就可能发生癌变. 在结肠癌中甲基化失活方式的发现对结肠癌的临床诊治意义重大. ①P16基因甲基化与结肠癌的诊断 P16基因甲基化失活方式与其他突变方式一样，在结肠癌的发生中起关键性的闸门作用. 与P53基因突变属晚期分子事件不同，P16基因甲基化失活属早期生化事件. P16基因甲基化的发现为结肠癌的早期诊断提供了一条新途径. 临床上可以采用灵敏、无创的方法检测患者P16基因甲基化情况，如检测患者粪便中的P16基因的甲基化率，可普查及诊断早期结肠癌，其准确性及早期性将优于以往的任何方法. ②P16基因甲基化与结肠癌的治疗 目前将P16基因转入癌细胞中已有达到逆转目的的报道. Arap et al[7]将全长P16基因转入人神经母细胞瘤中，观察到明显细胞生长受抑. 目前尚无将P16基因转入结肠癌中有阳性结果的报道. P16基因甲基化的发现，提示如果向结肠癌中转入P16基因，脱甲基剂的应用应引起重视. 由于体内存在甲基化环境，只单纯地转入P16基因，可能短期内有效，但很快会被甲基化而达不到长期逆转异质性的目的，如果联合应用脱甲基剂，就有可能达到预期目的.
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人体是复杂的平衡系统，仅这些结果尚不能解决实际问题，但它为结肠癌的基因治疗提供了新策略和新目标. 以后可以用更灵敏、更准确的方法来获得更详实的资料，如体内的甲基化环境其始动因素及还原因素都是什么结肠癌中的P16基因为什么选择此种甲基化失活方式其他抑癌基因有无这种失活方式各期结肠癌及各种结肠病中P16基因的甲基化率有无差异等，这些都需要科研工作者作进一步的深入研究.
4 参考文献
1 Kamb A, Gruis NA, Weaver FJ, Liu Q, Harshaman K, Tavtigian SV, Stochert E, Day RS. A cell regulator potentially involved in genesis
of many tumor types. Science, 1994;264:436-440
, 百拇医药
2 James G, Herman, Adrian M, LiMao, Rena G, Lapodus, Jean-Pierre JI, Nancy E, Davidson. Inactivity of the CDKN2/p16/MTSl gene
is frequently associated with aberrant methylationin all common human cancer. Cancer Res, 1995;55:4525-4530
3 Mirella GZ, Chrislina M, Bender, Allen SY, TuDuang N, Robert WB, Jan MV, Peter AJ. Methylation of the 5-CpG island of the p16
tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing. Cancer Res, 1995;55:4531-4535
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4 Sam brook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual 2nd ed. Beijing: Science press, 1992:463-468
5 Jiang B. The common experimental methods in molecular biology. Beijing: People's military medic press, 1996:70-80
6 Jones PA, Taylor SM. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell, 1980;20:85-93
7 Arap W, Nishikawa R, Furnari, Ryo NK, Frank BF, Webster KC, WuHuang HJ. Replacement of the p16/CDKN2 gene suppresses
human glioma cell growth. Cancer Res, 1995;55:1351-1354, 百拇医药(赖大年 解远峰 卞玲 要秀)