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编号:10696360
鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基诱导SGC-7901胃癌细胞的凋亡
http://www.100md.com 1999年9月15日 《世界华人消化杂志》 1999年第9期
     1中国人民解放军北京军区总医院消化内科 北京市 100700

    2兰州医学院第二附属医院消化内科 甘肃省兰州市 730030

    (作者现系第三军医大学消化内科专业在读博士生)

    项目负责人
范如英中国人民解放军北京军区总医院消化内科 北京市 100700

    收稿日期 1999-04-08 收回日期 1999-06-03

    

    Subject headings
podophyllic acid piperidyl hydrazone hitroxide radical; Stomach neoplasms; Apoptosis
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    主题词
鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基;胃肿瘤;凋亡

    鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP1)是从中草药桃儿七(采自青海民和)中提取的有效抗癌成分鬼臼脂毒素的衍生物. 它比鬼臼脂毒素抗癌活性强且毒性低[1]. GP1对小鼠移植肿瘤有抑制作用[2]. 它对小鼠白血病细胞DNA RNA及蛋白质均有抑制作用,其ID50小于VP16[3]. GP1对人类胃癌细胞的增长影响如何,它是否具有诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用尚未见报道,现对GP1作初步探讨.

    1 材料和方法
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    1.1 材料 GP1由兰州大学化学系合成提供,用100mL/L丙二醇配制成1g/L过滤除菌-20℃保存. RPMI1640为美国Gibco公司产品.小牛血清由兰州医学院血液病研究所提供. MTT试剂为Sigma公司产品,用0.01mol/L,pH=7.20 PBS液配成5g/L的储存液-20℃保存. 人胃癌细胞SGC-7901引自第四军医大学西京医院. 细胞用含100mL/L的小牛血清的RPMI1640完全培养基培养,培养液里另加谷氨酰胺300mg/L青霉素100kU/L,链霉素100mg/L pH 7.20细胞置于37℃,50mL/L CO2培养箱中培养.

    1.2 方法

    1.2.1 MTT法实验参考Mosmann[4]方法 取对数生长期细胞,每孔5×103细胞接种于96孔培养板中,培养24h. 实验孔分别加入不同浓度的GP1. 每孔设3个复孔,培养48h,每孔加入5g/L的MTT液10μL,继续培养4h,再加入100μL SDS溶液终止反应,37℃培养箱中过夜以使甲簪彻底溶解. 在酶联免疫检测仪570nm波长处测吸光度A. 每个GP1浓度计算出A均值,按以下公式计算相对抑制率(IR).
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    实验组A

    细胞相对抑制率(IR)=(1- )×100%

    空白对照组A

    1.2.2 细胞形态学观察 普通光镜HE及荧光染片:将已消毒的盖玻片分别放入24孔板中,每孔加入对数生长期的细胞培养24h,各孔分别加入不同浓度的GP1,每个药物浓度设立3个复孔. 按设定时间取出盖玻片并迅速投入950mL/L(4℃)乙醇中,固定20min取出凉干,常规HE及荧光染色. 分别采用普通光镜及荧光显微镜观察. 再将6×105经GP1作用后的SGC-7901细胞用40mL/L戊二醛固定;10g/L四氧化锇后固定;梯度酒精脱水;环氧树脂Epon-812包埋;超薄切片观察;醋酸铀和柠檬酸铅双染;JEM100CX透射电镜观察.
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    2 结果

    2.1 GP1对SGC-7901细胞生长的抑制作用(图1) 各种药物浓度GP1作用于SGC-7901细胞48h用MTT法测试结果表明,GP1对SGC-7901细胞有明显的抑制作用,且其相对抑制率与药物浓度之间呈显著直线相关(图1),(相关系数γ=0.992,P<0.01).

    1 GP1对SGC-7901细胞生长的抑制作用.

    2.2 细胞形态学观察 加GP1后,倒置显微镜下可见到细胞膜皱缩,体积变小,变圆,细胞间失去联系,原来贴壁生长的细胞脱离生长面,呈悬浮状态. 有的细胞有伪足样突起,核仁消失,苔盼兰染色呈拒染性. HE染色后光镜下可见凋亡细胞形态特征性变化,凋亡细胞体积变小,变圆,胞质浓染,胞膜皱缩,染色质致密,有的细胞致密核分布在核膜下,呈月牙状或腰带状,核仁消失. 有的细胞核膜消失,核碎片分布在胞质中,胞膜伸出伪足样突起(芽生). 有的视野可见体积小,胞质成分少,含有或不含致密染色质碎片的小体样结构,即凋亡小体. 高倍镜下随机计数1000个细胞,计算出凋亡指数AI(%)与GP1浓度呈显著正相关(γ=0.988,P<0.05). 凋亡指数在作用24h内随时间的延长而增长,经统计学处理,凋亡指数与作用时间呈显著正相关(γ=0.987,P<0.05). 口丫啶噔染色荧光显微镜下凋亡细胞呈致密浓染颗粒或块状荧光,可见芽生现象. 透射显微镜下可见凋亡细胞胞膜表面微绒毛减少或消失,胞体体积缩小,胞质致密度增高,线粒体结构基本清晰,有些内质网空泡变形. 胞核染色质固缩沿核膜分布,有的核膜清晰可见,有的核膜部分消失. 形成凋亡小体(图2).
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    2 电镜下SGC-7901细胞凋亡小体形成.

    3 讨论

    GP1是从我国中草药桃儿七中提取的鬼臼脂毒素的衍生物,它能抑制小鼠移植瘤的生长,但它具有诱导人类胃癌细胞凋亡作用尚未见报道. 本实验表明,GP1能够诱导人类胃癌细胞SGC-7901出现凋亡的特征性形态学变化证实诱导细胞凋亡是GP1抗肿瘤作用的重要机制. 传统认为肿瘤是由于细胞过度增长导致,对于肿瘤的基础研究主要是肿瘤细胞过度增生的生物学行为,相应临床上也主要围绕如何抑制肿瘤细胞增长来进行治疗. 近年来随着凋亡研究的深入,认识到肿瘤是由于局部组织增生与凋亡失衡而形成,如何诱导肿瘤细胞凋亡为抗癌治疗提供了新途径[5],能否诱导细胞凋亡也已成为筛选有效抗癌药物的重要指标. 本实验表明,GP1能够诱导胃癌细胞凋亡,为GP1治疗胃癌提供了直接实验依据,为中药桃儿七的开发利用提供了一定的线索.
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    4 参考文献


    1 陈耀祖,张长久,田喧. 具抗癌活性的鬼臼毒自旋标记物衍生物. 中国科学(B),1986:1205-1211

    2 王达纬,张培琰,梁重栋. 鬼臼酰乙基肼和鬼臼酰肼哌啶腙氮氧自由基(GP1)对小鼠移植性肿瘤作用的实验观察.

    兰州医学院学报,1984:19-20

    3 王志军,毛小娟,张培琰,梁重栋,田喧. GP1与VP16对体外白血病L7712细胞DNA与蛋白质代谢的影响.

    中国药理学报,1989;10:377-380

    4 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survial: application to proliferation and cytotoxity assays. 

    J Immunal Methods, 1983;65:55-63

    5 朱海青,尹兆红. 与凋亡相关的基因及其在血液系统恶性病中的作用. 国外医学输血与血液学分册, 1995;18:196-198, 百拇医药(范如英1 马 力2)