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编号:10696476
幽门螺杆菌尿素酶研究现状
http://www.100md.com 1999年10月15日 《世界华人消化杂志》 1999年第10期
     中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所腹泻病研究室 北京市 102206

    项目负责人
张建中中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所腹泻病研究室 北京市 102206

    Tel. +86·10·61739456, Fax. +86·10·61739456

    Email. Helico@public.bta.net.cn

    收稿日期 1999-05-08

    

    Subject headings
Helicobacter pylori; urease; Helicobacter infections

    主题词
螺杆菌,幽门;尿素酶;螺杆菌感染

    幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是人类最常见的一种致病菌[1],它是胃炎,消化道溃疡的致病因素,并且与胃癌的发生密切相关[2]. 世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)已将该菌纳入第一类致癌原[3],因此Hp日益受到各国学者的高度重视. 在Hp的致病过程中有多种致病因子参与,其中尿素酶被证实是少数几种与Hp感染密切相关的蛋白[4]. 具有极高的尿素酶活性是Hp重要的生物学特性之一[5],此酶可以将尿素迅速分解成氨和二氧化碳,在Hp的感染过程中有其独特的作用. 目前国际上有关尿素酶的文献大多都集中在Hp的尿素酶上

    [
6,7],对其分子生物学特性,在临床诊断及疫苗等方面进行了大量研究,现就Hp尿素酶的研究现状加以综述.

    1 尿素酶的理化性状

    尿素酶是一种人和动物胃肠道及泌尿道细菌感染中常见的酶,它既是人和动物中某些致病菌的致病因子之一,又是某些氮源性腐败物转化所必须具备的酶之一. 它是人类首次获得晶体并发现含有Ni离子的金属酶[7]. Hp尿素酶除有尿素酶的一般理化性状外,还有其独特性. Hp尿素酶分子量为550KDa左右,直径13nm,等电点5.99±0.03,最适温度45℃,最适pH 8.2. Km值0.3mmol/L±0.1mmol/L,在饱和条件下纯化的尿素酶活性为每毫克蛋白质每分钟水解1100μmol±200μmol尿素,较低Km值有助于Hp的尿素酶在尿素浓度较低的人胃环境中始终处于饱和状态而发挥最大的功能[8,9]. Hp尿素酶单体由A,B两个亚单位组成,呈六聚体,A,B两个亚单体的Mr分别为30000和64000左右,其比例为1∶1,而其他菌属所含尿素酶则有三个亚单位组成[7,8,10]. Hp的尿素酶量很大,占全菌蛋白的5%~10%[11]. 尿素酶一般为胞质蛋白,而Hp具有大量高活性的胞外尿素酶[12],Hp产生的尿素酶活性相当于奇异变形杆菌的2倍,尿素酶阳性肠道菌的7倍[13],故尿素酶活性的测定可以作为Hp的快速诊断方法[8].

    2 尿素酶的分子生物学性状

    2.1 尿素酶的基因 1997年Hp的全基因序列测定完成[14],但尿素酶基因1989年就被克隆出[15]. Agnes et al利用shatte克隆技术对尿素酶进行分析,证实编码尿素酶一组基因位于4.2kb DNA片段中,并确定这组基因中有4个开放性阅读框架(ORF),分别称为ureC,ureD,ureA,ureB[15]. 进一步研究发现在ureA,ureB下段还存在另外5个开放性阅读框架,分别为ureI,ureE,ureF,ureG,ureH,整个尿素酶基因长度约为8kb[16]. Hp尿素酶基因结构及相对应的编码产物如图1[17].

    这9个开放性阅读框架中,ureC和ureD位于结构基因之前,但其功能目前不十分清楚,根据对其他菌的尿素酶基因的研究推测这二个基因可能为调节基因. ureA,ureB为结构基因,研究发现非螺杆菌属的尿素酶是有A,B,C三个结构基因,由于命名的不统一,实质上Hp的ureA与其他菌属尿素酶ureA,ureB对应,而前者ureB与后者ureC对应. ureI,ureE,ureF,ureG,ureH为辅助基因,他们与结构基因一起为表达尿素酶活性所必须的,其中ureI为Hp尿素酶基因特有[7]. Claton在大肠杆菌中通过建库的方法筛选克隆表达Hp尿素酶基因A,B两个亚单位,但无尿素酶活性. Courcoux et al利用穿梭粘粒表达载体将含有完整尿素酶基因的DNA克隆,并在Campylobacter jejuni表达了有活性的尿素酶[8]. 研究认为辅助基因编码的蛋白在金属镍离子聚合到酶的活性位点上起重要作用. UreH是尿素酶的伴侣蛋白,与尿素酶蛋白组成复合物,维持尿素酶蛋白构象或者阻止无效镍离子的结合. UreE的功能是通过它的多聚组氨酸尾巴结合细胞中的镍离子,从而在尿素酶激活过程中作为镍离子的供体. UreF和UreG形成一个复合物,使酶对镍离子处于感受状态而使镍离子有效的结合在活性位点,或者UreF,UreG使尿素酶蛋白与Ni离子的供体UreE顺利的发生作用. 研究发现ureH,ureF,ureG基因被破坏以后由于不能结合镍离子而尿素酶蛋白活性完全丧失. 而ureE的破坏只会降低尿素酶活性而不会完全丧失[7]. Hp尿素酶为单拷贝基因,在ureD和ureA,ureB和ureI之间分别有420bp和200bp的中间基因,从而使3组基因有可能以同方向转录并单独受到调节[18]. 吿素酶结构基因转录为一个mRNA而辅助基因转录为另一mRNA[9]. 在大约ureA和ureD基因的上游310bp处存在一个σ54启动子,控制ureA,ureB及ureD基因表达,此调节可能受氮调控,而ureC基因上游则为启动子σ70. Mobley et al在克隆化Hp尿素酶基因的基础上,通过优化E.Coli培养基组成,获得了尿素酶基因的高效表达[18]. 目前有关基因的调节、启动子确定、转录的调节、mRNA长度等方面还不清楚,有待进一步研究[7].

    2.2 尿素酶基因的变异 Hp本身即属于基因变异极大的一种细菌,基因多样性是Hp的一个基本特点,而其他细菌如大肠杆菌、淋球菌和沙门菌不同菌株间的基因具有更多的相似性. Hp通过点突变、等位基因交换、基因重排及序列插入等使基因呈现出多样性[10],Hp的尿素酶基因也呈现出同样的特点[19]. Foxall et al应用PCR方法扩增Hp 2.4kb的ureA和ureB片段,其产物用HaeⅢ酶切,22株出现了10种酶切图. 进一步与发表的ureA,ureB基因序列推定的酶切图谱比较,只有BamHⅠ酶切位点是恒定的[20]. Owen et al同样以ureAB为靶基因对来自10个国家383株Hp进行PCR-RFLP(HaeⅢ)分析出现82种图谱,可能更具有代表性[21]. 除了结构基因外附属基因也得到同样的结果: Cour用PCR扩增、测序的方法证实Hp尿素酶C基因的核苷酸序列,在38株分离株中没有任何两株完全相同[22]. 因此Hp的基因变异较大,已发表的Hp尿素酶序列并不适合所有的菌株[20]. 但是应注意到80%的菌株基因水平的多态性没有改变基因表达蛋白的序列和结构[23]. 我们通过克隆、测序得到国内菌株CAPMN62株的尿素酶B亚单位核苷酸序列虽然同国际标准株26695株不同,但两菌推定氨基酸序列的同源性达到98.3%. 因此,Hp尿素酶基因序列的改变多为氨基酸三联密码子简并性取代,或者可能为编码不影响酶活性的非保守性氨基酸的碱基取代[7]. 鉴于Hp尿素酶基因存在差异,对尿素酶基因进行PCR-RFLP分析可以区分不同来源的Hp,将在流行病学调查中具有广泛的应用[20].

    2.3 尿素酶氨基酸的同源性 尿素酶除Hp以外还可以被许多细菌如奇异变形杆菌、产气克雷伯菌以及植物刀豆等所产生,尽管编码尿素酶的基因存在差异,但尿素酶的氨基酸序列相当保守[21,24],这与尿素酶在生物体中的功能相一致[7]. Shen et al研究报道Hp与螺杆菌属肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus)的尿素酶A,B亚单位氨基酸序列的同源性分别为60%和75%[25]. Turrett et al比较Hp、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、猫螺杆菌(Helicobacter felis,Hf)、平顶猴螺杆菌(H.nemestrinae)四种螺杆菌属的尿素酶N端氨基酸序列,UreB的同源性为95%~100%,UreA的同源性为75%~95%[9]. 全面综合评价Hp和Hf之间最为一致,这为动物模型的建立提供了依据[9]. Dunn et al对不同属间尿素酶的同源性进行了研究:有意思得是Hp同植物尿素酶间的同源性更大. Hp尿素酶A,B亚单位的氨基酸序列与刀豆尿素酶A,B亚单位有的65%和76%的氨基酸完全相同,而与奇异变形杆菌和产气克雷伯菌的A,B亚单位只有60%和65%相同[8]. 人们根据氨基酸序列的同源性及亚基的分子量推断:植物刀豆尿素酶只有一个大亚基,其C端氨基酸序列与Hp的B亚单位及奇异变形杆菌(Proteus mirabilis, Pm)的C亚单位序列相近,N端氨基酸序列与Hp的A亚单位相近,而Hp的A亚单位与Pm的A,B亚单位对应,因此Hp的A亚单位是Pm的A,B亚单位的前体,这表明它们很可能具有共同的祖先基因,并在生物体起重要作用[7]. 由上可以发现不论是同属还是不同属的尿素酶,其B亚单位的同源性都高于A亚单位,这可能与B亚单位含有尿素酶活性位点有关[7]. 实质上各种尿素酶的大亚基的314~322位氨基酸残基最为保守,其中Cys-319,His-320和His-321直接参与尿素的水解,Cys-319起催化作用,而His-320和His-321是Ni2+的结合位点,当His-320改变为Leu-320后,酶 的活性丧失[26]. 由于尿素酶序列的高度保守性,Pallen et al曾经提出摄取植物尿素酶蛋白就可以起到免疫保护作用并被Chen et al动物模型证实[27,28]. 人们有理由认为以全尿素酶作特异抗原用于血清学诊断可以出现假阳性,在进行诊断时应注意到尿素酶抗体的背景滴度以避免假阳性.

    其他细菌的尿素酶包括泌尿道常见病原菌如奇异变形杆菌、摩根变形杆菌所产生的尿素酶均主要存在于这些细菌的胞质中. 而大量证据表明Hp尿素酶与细胞外膜有关,认为Hp 尿素酶可能是通过Hp的自溶而释放并被完整Hp菌通过其特殊功能的膜蛋白吸附到菌 的表面[29]. 但Vanetd et al研究认为此现象是有Hp的特殊蛋白分泌机制而不是Hp自溶所产生的[30]. 可以明确的是细菌表面的尿素酶与细菌胞质中的尿素酶是相同的,同为染色体上的尿素酶基因所编码. Hp尿素酶能作为抗原成分为免疫系统所处理提呈,尿素酶是理想的疫苗候选抗原[31].

    2.4 尿素酶活性调节 尿素酶是一种镍金属酶,其活性有其活性部位的镍含量所决定. 该酶的活性需要在全酶的六个活性位点上插入两个Ni2+,这个插入过程由尿素酶基因簇中辅助基因编码的蛋白来完成. 目前已发现多种蛋白能够通过影响镍离子来调节尿素酶活性包括:NixA,一种P型ATP酶,一种ABC传递因子、HspA和Hpn等. ①NixA:是一种位于Hp胞膜结构上的高亲和力镍转运蛋白,35KDa大小、未发现复合体存在,能够独立地将镍离子输入细胞,在转染有Hp尿素酶基因和nixA基因的大肠杆菌内,尿素酶活性明显增强. 在一株该蛋白突变Hp株中发现尿素酶活性下降了42%,之所以未完全丧失说明还有除此之外的其他同功蛋白存在. ②P型ATP酶:一段长648个氨基酸的多肽是完整细胞膜蛋白的一个组份,已确定了其ATP结合位点和N端金属离子结合位点. 虽然还未直接确定ATP酶的镍离子转运活性,但发现ATP酶突变Hp株尿素酶活性可以下降99%. ③ABC (ATP Binding Cassette, ATP结合盒)该系统包括四种组合,也需要ATP能量. AbcC是其中的一个组份,是一种类似于大肠杆菌镍转运蛋白的蛋白质,拥有ATP结合局域,另一种组份显然是一种胞质膜蛋白. 该系统突变可使Hp尿素酶活性下降72%,而不影响其他如触酶或氧化酶活性. ④HspA:是一种热休克蛋白,与其他GroeS高度相似,但在C端含有一个组胺丰富区,能够特异结合Ni2+,其作用类似于一个镍离子库. 该基因突变可致细菌死亡,故无法直接评价比较其母株的尿素酶活性下降. ⑤Hpn:是另一种富含组胺蛋白,可以结合Ni2+和其他阳离子,可能与Ni2+的处理有关,但突变不会引起尿素酶活性下降.

    除了蛋白调节外,不同的离子浓度对尿素酶的活性也有重要的调节作用. 阳离子对Hp尿素酶活性的释放和稳定性作用如下[32,18]:在分别含1.5或10mmol/L Ca2+,Mg2+,K+,Na+, EDTA和EGTA的水溶液中加温部分纯化的Hp尿素酶,结果对其活性几乎没有影响;反之,在1mmol/L的Fe3+,Cu2+,Co2+或Zn2+中抑制了大部分活性(>80%),10mmol/L Fe2+,Mn2+和 Ni2+约抑制30%的活性,加入Ca2+或Mg2+显著地降低了用水从完整的Hp对尿素酶的抽提率,1mmol/L Na+,K+,EDTA或EGTA各对Hp尿素酶的释放只有极少的作用,这提示二价阳离子对尿素酶与Hp菌体间的连接有作用. 在4℃,酶活性的稳定性因加入甘油或2-Mercaptaethanot而加强;但是,即使是活性丧失后,对人血清的抗原性仍然保留. 现在除了上述某些二价阳离子对Hp的尿素酶有抑制作用外,尚有3类物质:氧酸(hydroxamic acid)磷酸氨基化合物(phosphoroamide compounds)及硫赶化合物(thiol compounds)可能对其有抑制作用.

    3 尿素酶在Hp致病中的作用

    Hp的尿素酶不仅能分解尿素,而且能激活单核吞噬细胞和刺激炎性细胞因子的产生,实验证实有活性的尿素酶在体外仍然对人胃上皮细胞有毒力作用,因此Hp尿素酶即是定植因子又是毒力因子[10].

    3.1 定植作用 尿素酶是Hp定植胃粘膜必需的,能够定植于悉生乳猪、裸鼠胃粘膜的野生株Hp通过化学或等位基因诱导突变产生的尿素酶缺失株却不能定植于其上[33,34]. 一般认为分解尿素产生的氨可以中和盐酸,这种一过性的低酸和高pH使细菌能够顺利穿过胃粘液层,到达近中性的粘膜表面. 但Eaton et al报道ureG突变而丧失尿素酶活性的Hp突变株不能定植于低胃酸和胃酸正常的悉生乳猪,说明尿素酶在Hp的定植过程中不只是中和胃酸作用[35]. 胞质尿素酶使Hp在定植中对尿素等有趋化作用[36],但单纯胞质尿素酶不能有效地保护Hp在酸性pH中的生存,而只有在尿素酶与Hp表面发生关系时才能有效的保护酸的作用[37].

    3.2 对宿主的损害[31,38,39] ①尿素的水解产物氢氧化铵可以明显地造成组织损害,同时细菌过度生长促使硝酸盐降解为亚硝酸盐及亚硝胺而致癌. ②尿素酶还通过与机体免疫系统的相互作用间接损害胃上皮. Hp尿素酶蛋白通过非LPS依赖途径激活单核细胞,导致免疫炎症递质(细胞因子)和氧自由基的分泌,这些物质可以介导对胃上皮的炎症反应. ③另有证据表明,尿素酶有反细胞化学趋化因子作用,加重局部的炎性反应. ④ 尿素酶是空泡形成的介导物. Eaton et al研究尿素酶在Hp诱导的小猪胃炎的作用时发现全部感染了Hp的小猪组织学上出现淋巴滤泡性胃炎,尿素酶阴性的Hp菌株不产生细胞内空泡.

    4 尿素酶的检测及应用

    Hp的重要生物学特征之一是含有丰富及高活性的尿素酶,因此可以利用Hp的这一特性,通过检测尿素酶基因及其编码的蛋白活性和抗原性来确定Hp的感染、进行菌株的鉴别及流行病学调查[10].

    4.1 尿素酶活性检测 目前临床对Hp感染的诊断主要是利用尿素酶活性的检测:如快速尿素酶试验、尿素酶阳性菌落的鉴定、13C/14C尿素酶呼气试验、15N-尿氨排出试验等[10]. 前2种方法需要内窥镜获得胃组织进行尿素酶活性检测,虽然灵敏、可靠、结果易于解释,但有创伤. 而后2种方法是一种同位素示踪试验,其原理是用同位素标记的尿素13C/14C或15N标记尿素摄入胃内时,如果胃内存在Hp,则同位素标记的尿素在Hp所含的尿素酶作用下分解为氨和CO2,通过收集呼气中13CO2/14CO2量或者收集一定时间内的尿样,检测其15N-尿氨的排出率判断胃内Hp存在. 很显然,这两种方法无创伤,并且随着应用率的提高费用也在下降,因此受到患者的欢迎[13].

    4.2 血清学检测 尿素酶是Hp主要抗原之一,它可以引起Hp感染患者的血清中抗Hp-IgG和IgA的滴度显著升高. 通过志愿者研究显示在感染后22d~33d出现,抗体的滴度同炎症程度相关. 可以拿它做抗原借血清学反应诊断Hp感染[40],如:免疫荧光技术、ELISA等方法,其中ELISA方法快速、简便、重复性好,其特异性和敏感性主要取决于所用抗原的纯度及代表性[13]. 血清学也可监测抗Hp疗效[41],IgG和IgA的滴度在抗Hp治疗后2wk开始下降,也可作流行病学调查[13].

    4.3 PCR方法的应用 聚合酶链式反应(PCR)于1985年问世以后,该技术被迅速地引入到Hp的研究中. 由于Hp普遍存在尿素酶基因,故常用尿素酶基因作为PCR检测的靶基因用于检测Hp的存在[42]. 目前文献报道最多的是以胃粘膜活检组织为标本[43]. 但所得到特异度和灵敏度不一致,可能是由于所选用的引物、标本的制备、细菌的密度及PCR程序不同所致,因此目前该技术尚不能取代组织学方法而成为常规方法[ 10,13]. PCR的一个优点是可以检测人胃粘膜以外的用常规方法不能检测的Hp,包括胃液、唾液、牙菌斑及粪便中的Hp[0,13,44],这样可以避免由于内镜取活检组织而产生的创伤,易为患者接受. 目前,PCR技术检测Hp在遗传学和流行病学研究也有重要的作用. 通过应用Hp的尿素酶基因PCR-RFLP方法来确定菌株间的差异,临床上可以判断Hp根治情况. 流行病学可作为确定Hp感染的来源和途径的工具[10,13].

    5 尿素酶在疫苗中应用

    Hp是人类感染率最高的慢性致病菌,流行病学调查显示全世界成年人中有50%携带有该菌[45]. 因此要克服该致病菌的危害仅仅被动治疗是难以实现的,与其他传染病一样免疫接种将是预防该菌感染的最有效方法. 1991年Czinn et al[46]获得了免疫接种的第一证据. 他们把Hp的粗制抗原加上佐剂霍乱毒素(CT)经口服途径免疫小鼠,实验组比对照组产生高得多的局部粘膜IgA反应. 随着研究的深入,人们所利用的Hp抗原包括超声粉碎抗原,纯化尿素酶全酶,尿素酶亚单位,纯化的VacA,热休克蛋白等[10],其中尿素酶已证实为一种有效的保护性抗原而成为疫苗的首选抗原[47]. Hp尿素酶是Hp的最主要的抗原成份,它能够刺激机体产生强烈的免疫反应. 免疫佐剂CT或大肠杆菌毒素能够引起局部粘膜免疫反应以提高免疫保护效果[48]. 目前尿素酶疫苗预防Hp感染已在许多动物模型上获得成功. Michett et al[49]利用纯化的Hp尿素酶作为抗原免疫小鼠,显示对Hf感染有较好的保护作用. 作者进一步把Hp尿素酶基因整合到大肠杆菌基因中,把基因重组后产生的尿素酶作为抗原免疫动物同样取得了理想的效果,Pappo et al[50] 和Lee et al[51]应用重组尿素酶免疫小鼠也获得了对Hf感染的免疫性. Ferrero et al[52]应用重组Hp和Hf的UreA和UreB同CT毒素一起免疫小鼠,评价对Hf感染的保护性,结果Hp,Hf的ureB免疫保护性分别为25%和60%,而不论是同源还是异源ureA未产生保护性. 从而证实主要是尿素酶B亚单位起免疫保护作用. Ermak et al[53]应用尿素酶与粘膜佐剂共同免疫小鼠,观察其产生的免疫对Hf感染小鼠保护时间,结果1年后仍有保护作用. 1994年Doidge et al[54]发现Hp疫苗不单具有预防作用,同时具有治疗作用. 疫苗具有治疗作用的发现及被Hp感染而不是Hf感染的动物模型[55,56]的建立有力地促进了Hp疫苗的研究. 目前已完成了检验重组尿素酶蛋白在感染者体内安全性的一期临床实验,结果表明这一蛋白十分安全. 旨在检验重组尿素酶与佐剂共同免疫的安全性及免疫源性二期临床试验正在进行中[57]. 最近尿素酶DNA疫苗也正在研究之中,Theulaz et al应用Hp的ureB DNA免疫小鼠,不管特异性抗体滴度大小都降低了Hf的感染水平,对Hf感染产生明显的免疫效果[58]. 总之,尿素酶是目前Hp疫苗研究的热点,虽然疫苗从研究到广泛的推广应用可能还要经过很长一段时间,但尿素酶疫苗具有光明的前景.

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