二乙基二硫代氨基甲酸钠对耐长春新硷胃癌细胞的逆转作用
中国人民解放军第四军医大学西京医院消化病研究所 陕西省西安市 710033
国家自然科学基金资助项目，No.39770665.
项目负责人 王少东中国人民解放军第四军医大学西京医院消化病研究所 陕西省西安市 710033
Tel. +86·29·3375229
Email. shaodongwang@263.net
收稿日期 1999-05-16 接收日期 1999-09-15
Subject headings stomach neoplasms; diethyldithiocarbamate; multiple drug resistance; signal transduction
, 百拇医药
主题词 二乙基二硫代氨基甲酸钠；多药耐药；逆转作用；信号转导
Doroshow[1]认为adriamycin(阿霉素，adr)在细胞内的代过程中产生的O2 -，H2O2及OH-可能是阿霉素产生细胞毒性的机制之一. 基于以上认识，郑荣梁et al[2]发现二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDC)可抑制癌细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性，莫简et al[3]发现DDC与血卟啉、激光同时作用于癌细胞可大增加氧自由基的抗肿瘤活性，因而提出DDC作为抗肿瘤辅助药物的可能性. 那么DDC这一SOD抑制剂对耐药细胞的作用如何可以使我们了解到SOD在肿瘤细胞耐药机制中的地位以及全面考察DDC作为抗肿瘤药物增敏剂的价值.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 DDC：上海化工厂，四氮甲唑蓝(MTT)，黄嘌呤氧化酶：Sigma产品，SOD标准品购自甘肃夏河生物制剂厂. SGC7901/WT细胞系军事医学科学院惠赠，SGC7901/VCR系本所自建耐药细胞[4].
1.2 方法 ①噻唑蓝还原法(MTT法)参照文献[5]进行；②SOD活性检测见文献[6]；③流式细胞仪检测细胞内的药物浓度；见文献[7].
, 百拇医药 2 结果
2.1 DDC加强阿霉素的抗肿瘤活性 在耐药细胞组及其对照组药敏细胞组的实验中，我们发现，在用了0.5g/L的DDC及不同浓度的adr时，耐药细胞的IC50为32mg/L，而其对照组药敏细胞组的IC50为0.79mg/L，从图1中我们可以看出DDC使阿霉素逾越了其耐药限制，使相同剂量的阿霉素在耐药组及药敏组中达到了相同甚至更高的药效(图1). 阿霉素对耐药细胞的IC50为18.4mg/L，而在其对照组药敏细胞中，该值为4mg/L，即阿霉素而言，耐药细胞的抗药性是药敏细胞的4.6倍(图2).
为了了解DDC对耐药细胞及药敏细胞的细胞毒性作用，我们用了相同比例的稀释倍数的DDC作用于上述两组细胞，实验表明在0.5g/L以下的浓度时，DDC对培养细胞是低毒的(图3). 在用0.5mg/mL 的DDC及0.5mg/L的adr的耐药细胞组及只用了0.5mg/L的adr的耐药细胞组分别培养了不同的时间段后，我们发现随着时间的延长，DDC+adr的耐药细胞组的存活率明显低于只用adr的耐药细胞组(图4).
, 百拇医药
图1 DDC+阿霉素对培养细胞的作用.
图3 DDC对培养细胞的毒性作用.
图4 DDC+adr作用培养细胞的时间依赖曲线.
2.2 细胞内药物含量的测定 在575nm接受波长下检测细胞内adr的自发荧光强度，其代表的相应的adr浓度，结果发现在用5mg/L adr作用6h后，耐药细胞中的药物几乎是药敏细胞中的1/2. 这一结果表明，本株耐药细胞的细胞内药物浓度的降低是其主要的耐药机制之一.
, http://www.100md.com
2.3 细胞内SOD活性测定 用化学发光法检测了细胞内SOD的活性，结果提示，在adr作用后，药敏细胞中SOD的活性平均为57±25，耐药细胞中的SOD活性平均为38±10，两者差别不具统计学意义(P>0.05). DDC与adr联合作用后，检测细胞内SOD的活性，表明，DDC可完全抑制两株细胞的SOD活性，活性均为0. 与未用DDC，单用adr的这两株细胞测定的值相比较，用配对t检验处理，两者具有统计学差别，P<0.05.
3 讨论
Birandra et al[8]的实验发现，在MCF-7这一细胞株中，在高浓度的adr刺激下，OH的含量在药敏细胞中几乎是耐药细胞中的6倍，而在酶学方面，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(catalase)变化不大，而谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)在耐药细胞中明显升高，这些结果似乎说明在耐药细胞中，主要是由于GSH-PX的活性升高，导致adr代谢过程中产生的氧自由基灭活，而使细胞得以耐受高浓度的adr. 本文的实验目的是要了解抑制细胞内的SOD活性对耐药细胞及药敏细胞的作用. DDC是一低毒化合物，在合用adr与DDC之后，adr对肿瘤杀伤活性明显增加，结果可以看出DDC使阿霉素逾越了其耐药限制，使相同剂量的阿霉素在耐药组及药敏组中达到了相同甚至更高的药效. SOD的活性检测结果表明，在阿霉素刺激下，药敏细胞中的SOD活性高于耐药细胞，但两者无显著差别.
, 百拇医药
Sunil et al[9]的研究表明，在人类乳腺癌细胞MCF-7细胞中高表达的Mn-SOD抑制了TNF所诱导的细胞毒性，caspase-3的激活、NF-kB，AP-1，JNK(应急激活蛋白激酶)和MEK(MAP激酶激酶)的激活. 文章表明SOD的作用并不专一针对TNF，其他的试剂(PMA、白介素-1、Okadaic酸)对NF-kB的激活或诱导的凋亡也可被抑制，这提示活性氧在各种试剂所激活的信号传导通路中起关键性的作用.本文的研究表明DDC具有显著的药理学作用，其作用机制可能是降低了细胞内的SOD的活性，从而提高了细胞内活性氧的浓度，激活了诱导细胞凋亡的信号传导通路中的关键酶，从而导致了细胞的死亡. 重要的是活性氧的这种作用并不受耐药细胞中种种保护机制的限制. 从这一意义上来说DDC作为一个细胞毒药物的增敏剂具有重要的研究价值和乐观的应用前景.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Doroshow JH. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart. Cancer Res, 1983;43:460-472
2 Zheng RL, Laiske SA, Cao AB. The relationship of diethyldithiocarbamate induced cytotoxicity and SOD.
Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao, 1984;16:675-678
3 Mo J, Sun SF, Wang DN. Use of diethyldioc-arbamate to enhance antitumor effect of hematoporphyrin derivativeslaser
, 百拇医药
by strengthening free radical reactions in tumor cells. Advance in Free Radical Biology and Medicine, 1991;p369.
Xi'an: Shaanxi Science and Technology Publishing of house
4 Fan DM, Cai XJ, Li MF. Sequent research multidrug resistance in gastric cancer cell. Jiefangjun Yixue Zazhi, 1995;20:439
5 Campling BG, Pym J, Baker HM. Chemosensitivity testing of small cell lung cancer using MTT assay. Br J Cancer, 1991;54:63-75
, http://www.100md.com
6 Li YX, Fang RZ. The new method to measure the action of SOD: chemiluminescence. Shengwu Huaxue Yu Shengwu
Wuli Jinzhan, 1983;50:59-62
7 Tanaka S, Aizawa K, Katayanagi N. Flow cytometryic analysis of early step in development of adriamycin resistance in a human
gastric cell line. Japan J Cancer Res, 1994;85:86-92
8 Birandra KS, Aspandian GK, Gerald B, Differential formation of hydroxyl radicals by adriamycin in sensitive and resistant MCF-7
, 百拇医药
human breast tumor cells: implications for the mechanism of action. Biochemistry, 1987;26:3776-3785
9 Sunil KM, Hannah JZ, Tao T. Overexpression of manganese supperoxide dismutase suppresses tumor necrosis
factorinduced apoptosis and activation of nuclear transcription factor-kB and activated protein-1.
J Biol Chem, 1998;273:13245-13254, http://www.100md.com(王少东 张杏泉 莫 简 王多宁 樊代明)
国家自然科学基金资助项目，No.39770665.
项目负责人 王少东中国人民解放军第四军医大学西京医院消化病研究所 陕西省西安市 710033
Tel. +86·29·3375229
Email. shaodongwang@263.net
收稿日期 1999-05-16 接收日期 1999-09-15
Subject headings stomach neoplasms; diethyldithiocarbamate; multiple drug resistance; signal transduction
, 百拇医药
主题词 二乙基二硫代氨基甲酸钠；多药耐药；逆转作用；信号转导
Doroshow[1]认为adriamycin(阿霉素，adr)在细胞内的代过程中产生的O2 -，H2O2及OH-可能是阿霉素产生细胞毒性的机制之一. 基于以上认识，郑荣梁et al[2]发现二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDC)可抑制癌细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性，莫简et al[3]发现DDC与血卟啉、激光同时作用于癌细胞可大增加氧自由基的抗肿瘤活性，因而提出DDC作为抗肿瘤辅助药物的可能性. 那么DDC这一SOD抑制剂对耐药细胞的作用如何可以使我们了解到SOD在肿瘤细胞耐药机制中的地位以及全面考察DDC作为抗肿瘤药物增敏剂的价值.
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1 材料和方法
1.1 材料 DDC：上海化工厂，四氮甲唑蓝(MTT)，黄嘌呤氧化酶：Sigma产品，SOD标准品购自甘肃夏河生物制剂厂. SGC7901/WT细胞系军事医学科学院惠赠，SGC7901/VCR系本所自建耐药细胞[4].
1.2 方法 ①噻唑蓝还原法(MTT法)参照文献[5]进行；②SOD活性检测见文献[6]；③流式细胞仪检测细胞内的药物浓度；见文献[7].
, 百拇医药 2 结果
2.1 DDC加强阿霉素的抗肿瘤活性 在耐药细胞组及其对照组药敏细胞组的实验中，我们发现，在用了0.5g/L的DDC及不同浓度的adr时，耐药细胞的IC50为32mg/L，而其对照组药敏细胞组的IC50为0.79mg/L，从图1中我们可以看出DDC使阿霉素逾越了其耐药限制，使相同剂量的阿霉素在耐药组及药敏组中达到了相同甚至更高的药效(图1). 阿霉素对耐药细胞的IC50为18.4mg/L，而在其对照组药敏细胞中，该值为4mg/L，即阿霉素而言，耐药细胞的抗药性是药敏细胞的4.6倍(图2).
为了了解DDC对耐药细胞及药敏细胞的细胞毒性作用，我们用了相同比例的稀释倍数的DDC作用于上述两组细胞，实验表明在0.5g/L以下的浓度时，DDC对培养细胞是低毒的(图3). 在用0.5mg/mL 的DDC及0.5mg/L的adr的耐药细胞组及只用了0.5mg/L的adr的耐药细胞组分别培养了不同的时间段后，我们发现随着时间的延长，DDC+adr的耐药细胞组的存活率明显低于只用adr的耐药细胞组(图4).
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图1 DDC+阿霉素对培养细胞的作用.
图3 DDC对培养细胞的毒性作用.
图4 DDC+adr作用培养细胞的时间依赖曲线.
2.2 细胞内药物含量的测定 在575nm接受波长下检测细胞内adr的自发荧光强度，其代表的相应的adr浓度，结果发现在用5mg/L adr作用6h后，耐药细胞中的药物几乎是药敏细胞中的1/2. 这一结果表明，本株耐药细胞的细胞内药物浓度的降低是其主要的耐药机制之一.
, http://www.100md.com
2.3 细胞内SOD活性测定 用化学发光法检测了细胞内SOD的活性，结果提示，在adr作用后，药敏细胞中SOD的活性平均为57±25，耐药细胞中的SOD活性平均为38±10，两者差别不具统计学意义(P>0.05). DDC与adr联合作用后，检测细胞内SOD的活性，表明，DDC可完全抑制两株细胞的SOD活性，活性均为0. 与未用DDC，单用adr的这两株细胞测定的值相比较，用配对t检验处理，两者具有统计学差别，P<0.05.
3 讨论
Birandra et al[8]的实验发现，在MCF-7这一细胞株中，在高浓度的adr刺激下，OH的含量在药敏细胞中几乎是耐药细胞中的6倍，而在酶学方面，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(catalase)变化不大，而谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-PX)在耐药细胞中明显升高，这些结果似乎说明在耐药细胞中，主要是由于GSH-PX的活性升高，导致adr代谢过程中产生的氧自由基灭活，而使细胞得以耐受高浓度的adr. 本文的实验目的是要了解抑制细胞内的SOD活性对耐药细胞及药敏细胞的作用. DDC是一低毒化合物，在合用adr与DDC之后，adr对肿瘤杀伤活性明显增加，结果可以看出DDC使阿霉素逾越了其耐药限制，使相同剂量的阿霉素在耐药组及药敏组中达到了相同甚至更高的药效. SOD的活性检测结果表明，在阿霉素刺激下，药敏细胞中的SOD活性高于耐药细胞，但两者无显著差别.
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Sunil et al[9]的研究表明，在人类乳腺癌细胞MCF-7细胞中高表达的Mn-SOD抑制了TNF所诱导的细胞毒性，caspase-3的激活、NF-kB，AP-1，JNK(应急激活蛋白激酶)和MEK(MAP激酶激酶)的激活. 文章表明SOD的作用并不专一针对TNF，其他的试剂(PMA、白介素-1、Okadaic酸)对NF-kB的激活或诱导的凋亡也可被抑制，这提示活性氧在各种试剂所激活的信号传导通路中起关键性的作用.本文的研究表明DDC具有显著的药理学作用，其作用机制可能是降低了细胞内的SOD的活性，从而提高了细胞内活性氧的浓度，激活了诱导细胞凋亡的信号传导通路中的关键酶，从而导致了细胞的死亡. 重要的是活性氧的这种作用并不受耐药细胞中种种保护机制的限制. 从这一意义上来说DDC作为一个细胞毒药物的增敏剂具有重要的研究价值和乐观的应用前景.
4 参考文献
, 百拇医药
1 Doroshow JH. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart. Cancer Res, 1983;43:460-472
2 Zheng RL, Laiske SA, Cao AB. The relationship of diethyldithiocarbamate induced cytotoxicity and SOD.
Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao, 1984;16:675-678
3 Mo J, Sun SF, Wang DN. Use of diethyldioc-arbamate to enhance antitumor effect of hematoporphyrin derivativeslaser
, 百拇医药
by strengthening free radical reactions in tumor cells. Advance in Free Radical Biology and Medicine, 1991;p369.
Xi'an: Shaanxi Science and Technology Publishing of house
4 Fan DM, Cai XJ, Li MF. Sequent research multidrug resistance in gastric cancer cell. Jiefangjun Yixue Zazhi, 1995;20:439
5 Campling BG, Pym J, Baker HM. Chemosensitivity testing of small cell lung cancer using MTT assay. Br J Cancer, 1991;54:63-75
, http://www.100md.com
6 Li YX, Fang RZ. The new method to measure the action of SOD: chemiluminescence. Shengwu Huaxue Yu Shengwu
Wuli Jinzhan, 1983;50:59-62
7 Tanaka S, Aizawa K, Katayanagi N. Flow cytometryic analysis of early step in development of adriamycin resistance in a human
gastric cell line. Japan J Cancer Res, 1994;85:86-92
8 Birandra KS, Aspandian GK, Gerald B, Differential formation of hydroxyl radicals by adriamycin in sensitive and resistant MCF-7
, 百拇医药
human breast tumor cells: implications for the mechanism of action. Biochemistry, 1987;26:3776-3785
9 Sunil KM, Hannah JZ, Tao T. Overexpression of manganese supperoxide dismutase suppresses tumor necrosis
factorinduced apoptosis and activation of nuclear transcription factor-kB and activated protein-1.
J Biol Chem, 1998;273:13245-13254, http://www.100md.com(王少东 张杏泉 莫 简 王多宁 樊代明)