维生素E乳剂对肝脏星状细胞Ⅲ型前胶原和MMP1 mRNA表达的影响
中国人民解放军第三军医大学西南医院传染科 重庆市 400038
项目负责人 向德栋中国人民解放军第三军医大学西南医院传染科 重庆市 400038
收稿日期 1999-09-22
Subject headings vitamin E; liver cirrhosis; collagen; metalloproteianses
主题词 维生素E；肝硬化；胶原；金属蛋白酶
肝纤维化的病理特征是细胞外基质(ECM)在窦周间隙的大量沉积，特别是Ⅰ，Ⅲ型胶原更明显. 肝纤维化动物模型研究表明，维生素E有抗肝纤维化作用[1]. 我们观察维生素E对肝脏星状细胞的影响，以期从分子水平阐述维生素E抗纤维化作用机制，为临床用于慢性肝病的治疗提供更多的依据.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 肝脏星状细胞系(CFSC)由美国Greenwel教授建立；10g/L维生素E乳剂由重庆制药厂制备；RPMI 1640培养基为Gibco公司产品；Ⅲ型前胶原放免测定试剂盒为重庆肿瘤研究所产品；Ⅲ型前胶原探针、基质金属蛋白酶(MMP1)探针由军事医学科学院张开泰博士惠赠；杂交液、蛋白酶K、封阻剂及NBT显色剂购于第三军医大学分子生物学教研室.
1.2 方法 将10g/L维生素E乳剂用蒸馏水稀释成1，0.1，0.01g/L三种工作浓度. 取对数生长期的CFSC细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化分离，用含100mL/L小牛血清1640液调整细胞浓度为1.4×108/L，每孔1mL加入12孔培养板内，置37℃，50mL/L CO2培养箱内培养24h后换不含血清的RPMI 1640培养液. 实验组每孔分别加入不同浓度的维生素E 10μL(终质量浓度10，1，0.1mg/L)，每剂量组设4复孔，对照组加入10μL蒸馏水，72h后，收集细胞培养上清，用放免法检测Ⅲ型前胶原，操作程序按试剂盒说明进行. 原位杂交检测Ⅲ型前胶原、MMP1 mRNA表达；取对数生长期的CFSC细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化分离，用含100mL/L小牛血清的1640液调整细胞浓度为1×107/L，以每孔0.5mL加入24孔培养板内，置37℃，50mL/L CO2 培养箱内培养，24h后，实验组每孔加入0.1g/L维生素 E 5μL(终质量浓度1mg/L)，设3复孔. 对照组加入5μL蒸馏水，48h后去掉上清，同时用40g/L多聚甲醛固定20min，原位杂交操作程序参照《实用免疫细胞化学与核酶分子杂交技术》一书进行[2].
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2 结果
2.1 维生素E对CFSC细胞Ⅲ型前胶原分泌的影响 维生素E对CFSC细胞分泌Ⅲ型前胶原与其浓度有关，当终质量浓度为10mg/L时，对Ⅲ型前胶原分泌影响不明显；当终质量浓度为1mg/L时，抑制作用明显；当终质量浓度为0.1mg/L时，对Ⅲ型前胶原分泌的抑制作用开始减弱(表1).
表1 维生素E对CFSC细胞分泌Ⅲ型前胶原的影响(n=4)
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bP<0.01，vs 对照组， E(1)，E(3)；dP<0.01，vs 对照组， E(1).
2.2 维生素E乳剂对CFSC细胞Ⅲ型前胶原、MMP1 mRNA表达的影响 维生素E终质量浓度为1mg/L对Ⅲ型前胶原mRNA表达的原位杂交结果显示，CFSC细胞能表达一定水平的Ⅲ型前胶原mRNA；加入维生素E组细胞，阳性细胞数量及阳性度普遍下降，提示细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达被抑制. 维生素E终质量浓度为1mg/L对MMP1 mRNA表达的原位杂交结果显示，加入维生素E CFSC细胞阳性细胞数量及阳性度普遍提高，而无维生素E组细胞，CFSC细胞阳性数量及阳性度普遍下降，提示维生素E促进MMP1 mRNA表达.
3 讨论
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目前普遍认为，激活的肝脏星状细胞是ECM的主要细胞学来源[3]，肝脏星状细胞已成为肝纤维化研究的焦点. 胶原的沉积一方面源于前胶原合成的增加，另一方面源于胶原酶催化分解过程的减慢，是胶原合成与降解平衡破坏的结果. 本研究表明，合适质量浓度的维生素E(1mg/L)能明显抑制Ⅲ型前胶原的分泌，减少胶原沉积，防止肝纤维化发展，与Parola et al[4]研究结果一致. 原位杂交检测CFSC细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达，结果表明维生素E能抑制Ⅲ型前胶原mRNA表达，说明维生素E能抑制Ⅲ型胶原合成，与培养上清检测结果一致. 维生素E防治肝纤维化动物模型研究中，在光镜下我们发现维生素E能使肝内形成的胶原纤维及网状纤维由粗变细，并有缩短和断裂，提示维生素E具有催化合成胶原酶作用. 在本实验中，我们检测了维生素E作用于CFSC细胞后，MMP1 mRNA表达情况，研究表明，维生素E具有使CFSC细胞MMP1 mRNA表达增强，说明维生素E促进MMP1合成. MMPs是机体中参与细胞外基质降解的重要蛋白酶，在机体正常情况下，发挥着重要的生理作用[5].
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由于肝纤维化的发生与肝脏炎症，肝细胞坏死密切相关[6]，炎症时， 枯否细胞释放多种细胞因子，促使肝纤维化形成，而维生素E具有减轻肝脏炎症及保护肝细胞作用. 总之，维生素E可能通过不同环节来发挥其抗肝纤维化作用. 而本结果提示其中一个重要环节通过对CFSC细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达直接抑制，对MMP1 mRNA的表达直接增强.
4 参考文献
1 王雅凡，李奇芬，王洪，毛青，吴纯清. 维生素E抗大鼠CCl4所致肝纤维化研究. 中华消化杂志，1998；18：101-104
2 蔡文琴，汪伯氵云，主编. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 成都：四川科学技术出版社，1994：426-427
3 Firedman SL. Molecular mechanisms of fibrosis and principle of therapy. J Gastroenterol, 1997;32:424-430
, 百拇医药
4 Parola M, Leonarduzzi G, Biasi F, Albano E, Biocca ME, Poli G, Dianzani MV. Vitamin E dietary supplementation protects against
carbon tetrachloride-induced chronic liver damage and cirrhosis. Hepatology, 1992;16:1014-1021
5 Polette M, Birembaut P. Membrane type metalloproteinases in tumor invasion. Int J Biochem Cell Biol, 1998;30:1195-1202
6 赵敏崎，韩德五，马学惠，赵元昌，尹全雷，李春梅. 甘草次酸与柴胡皂甙对防治大白鼠实验性肝硬化的作用.
药学学报，1983；18：325-331, 百拇医药(向德栋 李奇芬 王宇明 王雅凡)
项目负责人 向德栋中国人民解放军第三军医大学西南医院传染科 重庆市 400038
收稿日期 1999-09-22
Subject headings vitamin E; liver cirrhosis; collagen; metalloproteianses
主题词 维生素E；肝硬化；胶原；金属蛋白酶
肝纤维化的病理特征是细胞外基质(ECM)在窦周间隙的大量沉积，特别是Ⅰ，Ⅲ型胶原更明显. 肝纤维化动物模型研究表明，维生素E有抗肝纤维化作用[1]. 我们观察维生素E对肝脏星状细胞的影响，以期从分子水平阐述维生素E抗纤维化作用机制，为临床用于慢性肝病的治疗提供更多的依据.
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1 材料和方法
1.1 材料 肝脏星状细胞系(CFSC)由美国Greenwel教授建立；10g/L维生素E乳剂由重庆制药厂制备；RPMI 1640培养基为Gibco公司产品；Ⅲ型前胶原放免测定试剂盒为重庆肿瘤研究所产品；Ⅲ型前胶原探针、基质金属蛋白酶(MMP1)探针由军事医学科学院张开泰博士惠赠；杂交液、蛋白酶K、封阻剂及NBT显色剂购于第三军医大学分子生物学教研室.
1.2 方法 将10g/L维生素E乳剂用蒸馏水稀释成1，0.1，0.01g/L三种工作浓度. 取对数生长期的CFSC细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化分离，用含100mL/L小牛血清1640液调整细胞浓度为1.4×108/L，每孔1mL加入12孔培养板内，置37℃，50mL/L CO2培养箱内培养24h后换不含血清的RPMI 1640培养液. 实验组每孔分别加入不同浓度的维生素E 10μL(终质量浓度10，1，0.1mg/L)，每剂量组设4复孔，对照组加入10μL蒸馏水，72h后，收集细胞培养上清，用放免法检测Ⅲ型前胶原，操作程序按试剂盒说明进行. 原位杂交检测Ⅲ型前胶原、MMP1 mRNA表达；取对数生长期的CFSC细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化分离，用含100mL/L小牛血清的1640液调整细胞浓度为1×107/L，以每孔0.5mL加入24孔培养板内，置37℃，50mL/L CO2 培养箱内培养，24h后，实验组每孔加入0.1g/L维生素 E 5μL(终质量浓度1mg/L)，设3复孔. 对照组加入5μL蒸馏水，48h后去掉上清，同时用40g/L多聚甲醛固定20min，原位杂交操作程序参照《实用免疫细胞化学与核酶分子杂交技术》一书进行[2].
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2 结果
2.1 维生素E对CFSC细胞Ⅲ型前胶原分泌的影响 维生素E对CFSC细胞分泌Ⅲ型前胶原与其浓度有关，当终质量浓度为10mg/L时，对Ⅲ型前胶原分泌影响不明显；当终质量浓度为1mg/L时，抑制作用明显；当终质量浓度为0.1mg/L时，对Ⅲ型前胶原分泌的抑制作用开始减弱(表1).
表1 维生素E对CFSC细胞分泌Ⅲ型前胶原的影响(n=4)
| 组别 | ρ(维生素E)/(mg·L-1) | ρ(PCⅢ型)/(μg·L-1) |
| 对照 | 0 | 161.8±2.2 |
| 维生素E(1)组 | 10 | 160.6±2.3 |
| 维生素E(2)组 | 1.0 | 137.5±3.9b |
| 维生素E(3)组 | 0.1 | 146.4±2.1d |
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bP<0.01，vs 对照组， E(1)，E(3)；dP<0.01，vs 对照组， E(1).
2.2 维生素E乳剂对CFSC细胞Ⅲ型前胶原、MMP1 mRNA表达的影响 维生素E终质量浓度为1mg/L对Ⅲ型前胶原mRNA表达的原位杂交结果显示，CFSC细胞能表达一定水平的Ⅲ型前胶原mRNA；加入维生素E组细胞，阳性细胞数量及阳性度普遍下降，提示细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达被抑制. 维生素E终质量浓度为1mg/L对MMP1 mRNA表达的原位杂交结果显示，加入维生素E CFSC细胞阳性细胞数量及阳性度普遍提高，而无维生素E组细胞，CFSC细胞阳性数量及阳性度普遍下降，提示维生素E促进MMP1 mRNA表达.
3 讨论
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目前普遍认为，激活的肝脏星状细胞是ECM的主要细胞学来源[3]，肝脏星状细胞已成为肝纤维化研究的焦点. 胶原的沉积一方面源于前胶原合成的增加，另一方面源于胶原酶催化分解过程的减慢，是胶原合成与降解平衡破坏的结果. 本研究表明，合适质量浓度的维生素E(1mg/L)能明显抑制Ⅲ型前胶原的分泌，减少胶原沉积，防止肝纤维化发展，与Parola et al[4]研究结果一致. 原位杂交检测CFSC细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达，结果表明维生素E能抑制Ⅲ型前胶原mRNA表达，说明维生素E能抑制Ⅲ型胶原合成，与培养上清检测结果一致. 维生素E防治肝纤维化动物模型研究中，在光镜下我们发现维生素E能使肝内形成的胶原纤维及网状纤维由粗变细，并有缩短和断裂，提示维生素E具有催化合成胶原酶作用. 在本实验中，我们检测了维生素E作用于CFSC细胞后，MMP1 mRNA表达情况，研究表明，维生素E具有使CFSC细胞MMP1 mRNA表达增强，说明维生素E促进MMP1合成. MMPs是机体中参与细胞外基质降解的重要蛋白酶，在机体正常情况下，发挥着重要的生理作用[5].
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由于肝纤维化的发生与肝脏炎症，肝细胞坏死密切相关[6]，炎症时， 枯否细胞释放多种细胞因子，促使肝纤维化形成，而维生素E具有减轻肝脏炎症及保护肝细胞作用. 总之，维生素E可能通过不同环节来发挥其抗肝纤维化作用. 而本结果提示其中一个重要环节通过对CFSC细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达直接抑制，对MMP1 mRNA的表达直接增强.
4 参考文献
1 王雅凡，李奇芬，王洪，毛青，吴纯清. 维生素E抗大鼠CCl4所致肝纤维化研究. 中华消化杂志，1998；18：101-104
2 蔡文琴，汪伯氵云，主编. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 成都：四川科学技术出版社，1994：426-427
3 Firedman SL. Molecular mechanisms of fibrosis and principle of therapy. J Gastroenterol, 1997;32:424-430
, 百拇医药
4 Parola M, Leonarduzzi G, Biasi F, Albano E, Biocca ME, Poli G, Dianzani MV. Vitamin E dietary supplementation protects against
carbon tetrachloride-induced chronic liver damage and cirrhosis. Hepatology, 1992;16:1014-1021
5 Polette M, Birembaut P. Membrane type metalloproteinases in tumor invasion. Int J Biochem Cell Biol, 1998;30:1195-1202
6 赵敏崎，韩德五，马学惠，赵元昌，尹全雷，李春梅. 甘草次酸与柴胡皂甙对防治大白鼠实验性肝硬化的作用.
药学学报，1983；18：325-331, 百拇医药(向德栋 李奇芬 王宇明 王雅凡)