大鼠急性胰腺炎病理学特征与氧自由基变化的关系
南通医学院附属医院普外科 江苏省南通市 226001
项目负责人 周新泽南通医学院附属医院普外科 江苏省南通市 226001
收稿日期 1999-07-21 接收日期 1999-11-24
Subject headings pancreatitis/pathology; oxygen free radicals; disease modles; animal
主题词 胰腺炎/病理学；氧自由基；疾病模型；动物
急性胰腺炎(AP)是临床常见的急腹症之一，其病因及发病机制至今尚未完全明确，近年来研究提示细胞因子及炎症递质在AP病程演变过程中起着一定的作用，而氧自由基在AP发病中的作用尤为重要，甚至认为起着始动作用[1]. 我们应用“十二指肠闭袢法”制备AP大鼠模型，在光、电镜水平研究其病理变化的特征，并检测各时期血浆过氧化脂质的含量，探讨与AP大鼠病理学特征之间的关系.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 健康♂ Wistar大白鼠体质量210g～290g，随机分为四组，AP 6h，16h，24h及对照组，每组均为11只. AP模型的制备[2]：用“十二指肠闭袢法”，实验动物术前禁食12h，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，进腹后经胃窦切口将一段4cm粗塑料管置入十二指肠，然后在管外两端，即幽门下及胰管开口以下分别用丝线扎闭十二指肠，形成十二指肠闭袢，通过闭袢内胆肠液聚集形成高压反流入胰管而诱发AP，关闭胃窦切口，缝合腹壁，对照组仅作胃窦切开术.
1.2 方法 各组大鼠经心脏抽取2mL全血，置3.13%枸橼酸钠抗凝管中，按1∶9比例抗凝，离心后取血浆冻存，采用硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化反应的终末产物丙二醛(MDA)含量，各时期剖腹作大体观察，取相同部位分别固定于10%甲醛及2%戊二醛溶液，作光镜及电镜观察，并按Rao et al[3]胰腺组织半定量法区分胰腺出血坏死程度.
, 百拇医药
统计学处理 血浆MDA以X±s表示，显著性检验采用t检验，秩和检验.
2 结果
2.1 血浆MDA含量变化 术后各时期AP组较对照组明显升高(P<0.01)，AP各组间比较均有显著差异，表1.
表1 血浆MDA值(nmol/mL，X±s)
, http://www.100md.com
2.2 病理形态学观察
2.2.1 肉眼观察 胰腺组织早期为水肿改变，16h后鼠腹腔内常有血性腹水，胰周及网膜点状皂化斑，胰腺肿胀明显及胰腺外脏器受累.
2.2.2 光镜观察 主要观察腺泡细胞、血管及胰导管改变，间质水肿及炎症细胞浸润程度. ①AP 16h胰腺间质轻度水肿，少量炎细胞浸润，血管灶性纤维素样坏死，大导管扩张为典型水肿性胰腺炎. ②AP 16h胰腺腺泡灶性凝固性坏死，血管壁纤维素样坏死较术后6h加重，红细胞漏出，部分腺导管扩张，其周围急性炎症主要为局限性、出血性胰腺炎. ③AP 24h胰腺组织中出血明显，腺泡坏死累及整个小叶呈片状坏死区，大小导管亦有明显坏死，间质内可见大量嗜中性粒细胞浸润. ④整个AP病程中表现为小动脉痉挛与小静脉瘀血，腺泡细胞点状坏死早于中性粒细胞浸润，故AP的病理变化有别于其他炎症，一开始血管改变就较明显，局部血流量急剧减少，类似梗塞的病理形态学变化.
, 百拇医药
2.2.3 胰腺组织光镜半定量评分显示 术后16h，24h重于6h(P<0.01)，24h重于16h(P<0.01)，表2.
表2 AP各组胰腺组织光镜半定量评分结果
, http://www.100md.com
2.2.4 电镜观察 ①AP 6h毛细血管内皮细胞肿胀，吞饮小泡明显增多，内皮细胞间连接结构松弛，此时腺泡细胞损伤较轻. ②AP 16h腺泡细胞中细胞器病变明显，变性形成“髓鞘样结构”(myelinfigure)，线粒体肿胀，粗面内质网扩张，脱颗粒，溶酶体肿胀，部分与酶原颗粒溶合形成次级溶酶体，酶原颗粒膜形状改变并可见溶合现象. ③AP 24h腺泡细胞线粒体肿胀至破裂，粗面内质网扩张成池，次级溶酶体增多，细胞内空化明显，并较易见到细胞坏死迹象，细胞核固缩、碎裂与溶解，但AP各组腺泡细胞膜的损伤较轻.
3 讨论
AP的发病机制至今尚不十分清楚，近年来国内外许多学者均通过实验证实氧自由基在AP发病过程中起着重要的作用. 但从病理学角度探讨氧自由基在AP病程演变过程中作用的研究，尚少见报道. 我们应用“十二指肠闭袢法”诱发AP大鼠三个不同阶段(AP6,16,24h)，胰腺组织病理学变化证实分别为水肿性、出血性及出血坏死性胰腺炎，与陈跃钢et al[4]报道的结果一致. 结果发现AP各期血浆MDA含量较对照组均明显升高，随着胰组织损伤的加重，血浆MDA亦呈明显上升趋势，提示血浆MDA含量与胰腺病变程度呈平行关系，可见氧自由基的变化在一定程度上反应了胰腺组织脂质过氧化损伤的严重程度和胰腺组织病理学改变.
, http://www.100md.com
生物膜发生脂质过氧化反应的结果是膜的结构改变，完整性破坏、通透性增加，亚细胞如线粒体、粗面内质网、溶酶体等比细胞膜含有更多的多价不饱和脂肪酸，对脂质过氧化反应更为敏感. 本实验结果也发现，在诱发AP 16h和24h，腺泡细胞超微结构主要表现为亚细胞器的损伤，而细胞膜的变化较轻，电镜观察到腺泡细胞线粒体肿胀至破裂，粗面内质网扩张成池，溶酶体肿胀，部分与酶原颗粒融合. 此外，AP进一步发展，氧自由基可激活胰腺组织PLA2，使花生四烯酸代谢物释放[5]，故氧自由基除通过膜脂质过氧化反应对腺泡细胞直接损伤外，尚可通过促进PLA2活化及花生四烯酸代谢系统紊乱而加剧胰腺血循环障碍及腺泡细胞溶酶体膜的破裂至胰酶释放[6]，引起细胞器坏死. 以上现象与Steer et al[7]提出的胰酶的活化主要在胰泡细胞内进行，而不仅仅局限于腺泡细胞外的理论相一致，因此氧自由基对腺泡细胞器的损伤与腺泡“自身消化”直接有关，可见氧自由基对胰腺组织内皮细胞及腺泡细胞生物膜的损伤作用与AP的病理学特征密切相关，因此我们认为氧自由基是AP的重要病理因素，设法抑制氧自由基的生成与聚积，可减轻AP时胰腺组织病理学改变，无疑对改善AP的治疗将是颇有裨益的.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Wisner J, Green D, Ferrell L. Evidence for a role of oxygen derived free radicals in the pathogenesis of caerulein induced
acute pancreatitis in rats. Gut, 1988;29:1516-1520
2 Nevalainen TJ, Seppa A. Acute pancreatitis caused by closed duodenal loop in the rat. Scand J Gastroenterol,1975;10:521-524
3 Rao SS. A serial histologic study of the development and progression of acute pancreatitis in the rat. Am J Pathol,
, http://www.100md.com
1981;103:39-44
4 陈跃钢，王加文，段恒春. 大鼠不同程度急性胰腺炎的胰腺微循环系列变化. 第二军医大学学报，1990；12：81-85
5 Gustafson C, Lindahl M, Tagesson C. Hydrogen peroxide stimulates phospholipase A2-mediated arachidonic acid release in
cultured intestinal epithelial cell. Scand J Gastroenterol, 1991;26:237-241
6 Kiviniemi H, Ramo OJ. The behaviour of prostanoids during the course of aute pancreatitis in rat.
Res Exp Med Berl, 1986;186:449-453
7 Steer ML, Meldolesi J, Figarella C. Pancreatitis: the role of lysosomes. Dig Dis Sci, 1984;29:934-938, 百拇医药(周新泽 毛勤生 陈玉泉 沈洪熏)
项目负责人 周新泽南通医学院附属医院普外科 江苏省南通市 226001
收稿日期 1999-07-21 接收日期 1999-11-24
Subject headings pancreatitis/pathology; oxygen free radicals; disease modles; animal
主题词 胰腺炎/病理学；氧自由基；疾病模型；动物
急性胰腺炎(AP)是临床常见的急腹症之一，其病因及发病机制至今尚未完全明确，近年来研究提示细胞因子及炎症递质在AP病程演变过程中起着一定的作用，而氧自由基在AP发病中的作用尤为重要，甚至认为起着始动作用[1]. 我们应用“十二指肠闭袢法”制备AP大鼠模型，在光、电镜水平研究其病理变化的特征，并检测各时期血浆过氧化脂质的含量，探讨与AP大鼠病理学特征之间的关系.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 健康♂ Wistar大白鼠体质量210g～290g，随机分为四组，AP 6h，16h，24h及对照组，每组均为11只. AP模型的制备[2]：用“十二指肠闭袢法”，实验动物术前禁食12h，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，进腹后经胃窦切口将一段4cm粗塑料管置入十二指肠，然后在管外两端，即幽门下及胰管开口以下分别用丝线扎闭十二指肠，形成十二指肠闭袢，通过闭袢内胆肠液聚集形成高压反流入胰管而诱发AP，关闭胃窦切口，缝合腹壁，对照组仅作胃窦切开术.
1.2 方法 各组大鼠经心脏抽取2mL全血，置3.13%枸橼酸钠抗凝管中，按1∶9比例抗凝，离心后取血浆冻存，采用硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化反应的终末产物丙二醛(MDA)含量，各时期剖腹作大体观察，取相同部位分别固定于10%甲醛及2%戊二醛溶液，作光镜及电镜观察，并按Rao et al[3]胰腺组织半定量法区分胰腺出血坏死程度.
, 百拇医药
统计学处理 血浆MDA以X±s表示，显著性检验采用t检验，秩和检验.
2 结果
2.1 血浆MDA含量变化 术后各时期AP组较对照组明显升高(P<0.01)，AP各组间比较均有显著差异，表1.
表1 血浆MDA值(nmol/mL，X±s)
| 组别 | n | MDA |
| 对照组 | 11 | 0.78±0.17 |
| AP | ||
| 6h | 11 | 1.05±0.12 |
| 16h | 11 | 16h |
| 24h | 11 | 1.98±0.17 |
, http://www.100md.com
2.2 病理形态学观察
2.2.1 肉眼观察 胰腺组织早期为水肿改变，16h后鼠腹腔内常有血性腹水，胰周及网膜点状皂化斑，胰腺肿胀明显及胰腺外脏器受累.
2.2.2 光镜观察 主要观察腺泡细胞、血管及胰导管改变，间质水肿及炎症细胞浸润程度. ①AP 16h胰腺间质轻度水肿，少量炎细胞浸润，血管灶性纤维素样坏死，大导管扩张为典型水肿性胰腺炎. ②AP 16h胰腺腺泡灶性凝固性坏死，血管壁纤维素样坏死较术后6h加重，红细胞漏出，部分腺导管扩张，其周围急性炎症主要为局限性、出血性胰腺炎. ③AP 24h胰腺组织中出血明显，腺泡坏死累及整个小叶呈片状坏死区，大小导管亦有明显坏死，间质内可见大量嗜中性粒细胞浸润. ④整个AP病程中表现为小动脉痉挛与小静脉瘀血，腺泡细胞点状坏死早于中性粒细胞浸润，故AP的病理变化有别于其他炎症，一开始血管改变就较明显，局部血流量急剧减少，类似梗塞的病理形态学变化.
, 百拇医药
2.2.3 胰腺组织光镜半定量评分显示 术后16h，24h重于6h(P<0.01)，24h重于16h(P<0.01)，表2.
表2 AP各组胰腺组织光镜半定量评分结果
| 组别 | n | 病理分级 | ||
| 单纯水肿(Ⅰ) | 局限坏死(Ⅱ) | 出血坏死(Ⅲ) | ||
| AP | ||||
| 6h | 11 | 7 | 3 | 1 |
| 16h | 11 | 3 | 6 | 2 |
| 24h | 11 | 1 | 2 | 8 |
, http://www.100md.com
2.2.4 电镜观察 ①AP 6h毛细血管内皮细胞肿胀，吞饮小泡明显增多，内皮细胞间连接结构松弛，此时腺泡细胞损伤较轻. ②AP 16h腺泡细胞中细胞器病变明显，变性形成“髓鞘样结构”(myelinfigure)，线粒体肿胀，粗面内质网扩张，脱颗粒，溶酶体肿胀，部分与酶原颗粒溶合形成次级溶酶体，酶原颗粒膜形状改变并可见溶合现象. ③AP 24h腺泡细胞线粒体肿胀至破裂，粗面内质网扩张成池，次级溶酶体增多，细胞内空化明显，并较易见到细胞坏死迹象，细胞核固缩、碎裂与溶解，但AP各组腺泡细胞膜的损伤较轻.
3 讨论
AP的发病机制至今尚不十分清楚，近年来国内外许多学者均通过实验证实氧自由基在AP发病过程中起着重要的作用. 但从病理学角度探讨氧自由基在AP病程演变过程中作用的研究，尚少见报道. 我们应用“十二指肠闭袢法”诱发AP大鼠三个不同阶段(AP6,16,24h)，胰腺组织病理学变化证实分别为水肿性、出血性及出血坏死性胰腺炎，与陈跃钢et al[4]报道的结果一致. 结果发现AP各期血浆MDA含量较对照组均明显升高，随着胰组织损伤的加重，血浆MDA亦呈明显上升趋势，提示血浆MDA含量与胰腺病变程度呈平行关系，可见氧自由基的变化在一定程度上反应了胰腺组织脂质过氧化损伤的严重程度和胰腺组织病理学改变.
, http://www.100md.com
生物膜发生脂质过氧化反应的结果是膜的结构改变，完整性破坏、通透性增加，亚细胞如线粒体、粗面内质网、溶酶体等比细胞膜含有更多的多价不饱和脂肪酸，对脂质过氧化反应更为敏感. 本实验结果也发现，在诱发AP 16h和24h，腺泡细胞超微结构主要表现为亚细胞器的损伤，而细胞膜的变化较轻，电镜观察到腺泡细胞线粒体肿胀至破裂，粗面内质网扩张成池，溶酶体肿胀，部分与酶原颗粒融合. 此外，AP进一步发展，氧自由基可激活胰腺组织PLA2，使花生四烯酸代谢物释放[5]，故氧自由基除通过膜脂质过氧化反应对腺泡细胞直接损伤外，尚可通过促进PLA2活化及花生四烯酸代谢系统紊乱而加剧胰腺血循环障碍及腺泡细胞溶酶体膜的破裂至胰酶释放[6]，引起细胞器坏死. 以上现象与Steer et al[7]提出的胰酶的活化主要在胰泡细胞内进行，而不仅仅局限于腺泡细胞外的理论相一致，因此氧自由基对腺泡细胞器的损伤与腺泡“自身消化”直接有关，可见氧自由基对胰腺组织内皮细胞及腺泡细胞生物膜的损伤作用与AP的病理学特征密切相关，因此我们认为氧自由基是AP的重要病理因素，设法抑制氧自由基的生成与聚积，可减轻AP时胰腺组织病理学改变，无疑对改善AP的治疗将是颇有裨益的.
, http://www.100md.com
4 参考文献
1 Wisner J, Green D, Ferrell L. Evidence for a role of oxygen derived free radicals in the pathogenesis of caerulein induced
acute pancreatitis in rats. Gut, 1988;29:1516-1520
2 Nevalainen TJ, Seppa A. Acute pancreatitis caused by closed duodenal loop in the rat. Scand J Gastroenterol,1975;10:521-524
3 Rao SS. A serial histologic study of the development and progression of acute pancreatitis in the rat. Am J Pathol,
, http://www.100md.com
1981;103:39-44
4 陈跃钢，王加文，段恒春. 大鼠不同程度急性胰腺炎的胰腺微循环系列变化. 第二军医大学学报，1990；12：81-85
5 Gustafson C, Lindahl M, Tagesson C. Hydrogen peroxide stimulates phospholipase A2-mediated arachidonic acid release in
cultured intestinal epithelial cell. Scand J Gastroenterol, 1991;26:237-241
6 Kiviniemi H, Ramo OJ. The behaviour of prostanoids during the course of aute pancreatitis in rat.
Res Exp Med Berl, 1986;186:449-453
7 Steer ML, Meldolesi J, Figarella C. Pancreatitis: the role of lysosomes. Dig Dis Sci, 1984;29:934-938, 百拇医药(周新泽 毛勤生 陈玉泉 沈洪熏)