链脲酶素诱导的糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡
中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科 广东省广州市 510080
国家自然基金资助，No.39700145；中山医科大学重点学科建设211工程资助.
项目负责人 兰平中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科 广东省广州市 510080
收稿日期 1999-09-19 接收日期 1999-12-02
Subject headings lslet; diabetes mellitus; cell apoptosis; Fas ligand; steptozotozin
, http://www.100md.com
主题词 胰岛；糖尿病；细胞凋亡；Fas配体；链脲酶素
胰岛素依赖性糖尿病是由于自身免疫反应导致β细胞毁损. 此病进展缓慢，机体很快清除死亡细胞，以致β细胞在体内的死亡很难检测到[1]，体内原位重复性观察β细胞死亡非常困难. 目前，大量的研究集中于体外观察β细胞的死亡，如应用IL-β，INF-α等可抑制高糖诱导β细胞分泌胰岛素，但不能证实这些因子如何发挥作用，以及在体内β细胞是否产生类似的死亡方式. 我们采用TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的X-dUTP缺口末端标记)法原位标记链脲酶素诱导大鼠糖尿病后胰岛细胞病理变化，以期为糖尿病的病因研究及防治提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 ♂ SD大鼠12只，体质量200g～250g；由华西医科大学实验动物中心提供. 链脲酶素(Boehringer Mannheim公司)，血糖试剂盒(慈溪康华生化制品厂)，脱氧核糖核酸酶(DNase酶，华美公司)，FasL(Fas配体)检测试剂盒(武汉博士德公司)，TUNEL试剂盒(Boehringer Mannheim公司)包括TUNEL液Ⅰ(末端脱氧核苷酸转移酶)，TUNEL液Ⅱ(x-dUTP：带荧光素的dUTP抗荧光素抗体)，成色反应液(碱性磷酸酶/坚固红)-FasL red(Sigma公司)，20g/L的蛋白酶K(Sigma公司).
, 百拇医药
1.2 方法 选择健康SD大鼠，于阴茎背静脉注入20g/L链脲酶素(溶于0.12mol/L的枸橼酸中pH 4.5)50mg/kg，注药后1，2，4，10d测血糖(酶酚试剂法)连续2次超过16.8mmol/L，尿糖持续++++(班氏试剂法)，选为糖尿病模型. 同时可出现饮水多，体质量下降(注药1wk下降超过15g)，尿量增多且呈酸臭味，失水、消瘦、反应迟钝.
1.2.1 组织学检测 注射链脲酶素后1，3，5，7d各取3只大鼠处死后取胰腺、胸腺、脾脏，经40mL/L的多聚甲醛固定，石蜡包埋行HE染色，及FasL测定、原位胰岛凋亡测定及β细胞特殊染色.
1.2.2 FasL+的表达 SABC法测定FasL的表达情况，方法简述如下：切片脱蜡至水，以30mL/L H2O2室温下处理5min～10min，微波炉加热至96℃～100℃，持续10min～20min，滴加兔抗FasL抗体及生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 20min，滴加SABC，37℃ 20min后DAB显色，苏木素轻度复染，阳性细胞呈棕黄色.
, 百拇医药
1.2.3 TUNEL法测定胰岛细胞凋亡 按Gavrieli et al[2]所述方法略有改进. 组织切片脱蜡水化，2g/L的蛋白酶K消化30min，37℃. TUNEL液(TUNELⅠ液10μL，Ⅱ液90μL充分混和)孵育60min，37℃. 直接在荧光显微镜下观察或抗荧光素抗体，孵育30min，37℃. 坚固红成色，普通显微镜下观察，可见到散在的被标记的凋亡细胞核呈红色. 在此基础上进行胰岛β细胞特殊染色，采用Mallory三色染色法(MCT)[3]，β细胞被染成橘黄色. 封片4℃保存.
2 结果
糖尿病鼠胰岛病理变化及凋亡的存在 糖尿病大鼠胰腺HE染色可见胰岛明显变小、萎缩；FasL测定胸腺及脾脏内有大量的FasL+细胞，而胰腺内无FasL+细胞存在. TUNEL法标记凋亡细胞发现链脲酶素诱导糖尿病后胰岛内大量凋亡细胞存在，主要位于胰岛的边缘区，而外分泌腺区无明显的凋亡细胞存在. 在注射链脲酶素后1d即可见胰岛细胞凋亡，3d～5d达高峰，处死的3只SD大鼠胰岛细胞均可见明显的胰岛细胞凋亡，经胰岛特殊染色证实凋亡的细胞大多数是胰岛B细胞，7d后凋亡逐渐减少.
, 百拇医药
3 讨论
Fas系统的研究是当前免疫学的热点之一. FasL除存在于活性淋巴细胞外，机体组织中主要存在于免疫豁免组织中，Griffith et al[4]使病毒感染正常鼠前房后，未发现炎症浸润，而病毒感染缺乏FasL的GID(general lympholiferation disease)鼠出现明显的炎性浸润，检测发现眼睛内存在FasL(Fas Ligand)，其通过凋亡减少进入其内的Fas+T淋巴细胞，睾丸组织也有类似现象[5，6]. 说明FasL在防止炎症反应中的作用. 本实验中胸腺及脾脏均存在大量FasL+细胞，可以杀伤任何走近这些组织器官的活性淋巴细胞(表达Fas)，从而使这些组织免于炎性反应，而胰腺中无FasL+细胞存在，易于被炎性细胞毁损，这是否与胰腺易受炎性反应侵害而产生自身免疫性糖尿病或容易发生各种类型的胰腺炎有关. 另外，尚有一种观点认为[7]：胰岛β细胞可被诱导产生Fas，反而成为FasL+ CD4细胞裂解的靶细胞.
, 百拇医药
同时，我们通过对链脲酶素诱导的糖尿病大鼠胰腺进行病理分析及TUNEL标记凋亡细胞，发现胰岛内存在明显的凋亡细胞，通过凋亡使大量的β细胞凋亡，从而使胰岛的体积明显变小，最终使胰岛功能丧失，产生糖尿病症状，最近国外也有报道认为自身免疫性糖尿病也是通过凋亡途径毁损胰岛功能[1]，链脲酶素所至的糖尿病可能是通过诱导胰岛细胞凋亡途径形成的，人体自身免疫性糖尿病可能也是经此途径，是否可通过抑制胰腺局部凋亡而防止或减慢糖尿病的发生，为糖尿病的预防和治疗提供了一条途径.
4 参考文献
1 Kurrer MO, Pakala SV, Hanson HL, Katz JD. β cell apoptosis in cell-mediated autoimmune diabetes.
Proc Natl Acad Sci USA, 1997;94:213-218
, 百拇医药
2 Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear
DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992;119:492-501
3 龚志锦，詹熔洲. Mallory三色染色法(MCT). 见：龚志锦，詹熔洲主编. 病理组织切片和染色技术. 第1版. 上海：
上海科学技术出版社，1994：60-61
4 Griffith TS, Brunner J, Fletcher SM. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege. Science,
, 百拇医药
1995;270:1189-1192
5 Suda T, Takahashi T, Golstein P. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis
factor family. Cell, 1993;75:1169-1178
6 Bellgrau D, Gild D, Selawry H. A role for CD95 ligand in preventing graft rejection. Nature, 1995;377:630-632
7 Stassi G, Todaro M, Richiusa P, Giordano M, Mattina A, Sbriglia MS, Lo Monte A, Buscemi G, Galluzzo A, Giordano C. Expression
of apoptosis-inducing CD95(Fas/Apo-1)on human betal cells sorted by flow-cytometry and cultured in vitro.
Transplant Proc, 1995;27:3271-3275, 百拇医药(兰 平 张 梅 王东平 汪建平 詹文华)
国家自然基金资助，No.39700145；中山医科大学重点学科建设211工程资助.
项目负责人 兰平中山医科大学附属第一医院胃肠胰外科 广东省广州市 510080
收稿日期 1999-09-19 接收日期 1999-12-02
Subject headings lslet; diabetes mellitus; cell apoptosis; Fas ligand; steptozotozin
, http://www.100md.com
主题词 胰岛；糖尿病；细胞凋亡；Fas配体；链脲酶素
胰岛素依赖性糖尿病是由于自身免疫反应导致β细胞毁损. 此病进展缓慢，机体很快清除死亡细胞，以致β细胞在体内的死亡很难检测到[1]，体内原位重复性观察β细胞死亡非常困难. 目前，大量的研究集中于体外观察β细胞的死亡，如应用IL-β，INF-α等可抑制高糖诱导β细胞分泌胰岛素，但不能证实这些因子如何发挥作用，以及在体内β细胞是否产生类似的死亡方式. 我们采用TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的X-dUTP缺口末端标记)法原位标记链脲酶素诱导大鼠糖尿病后胰岛细胞病理变化，以期为糖尿病的病因研究及防治提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 ♂ SD大鼠12只，体质量200g～250g；由华西医科大学实验动物中心提供. 链脲酶素(Boehringer Mannheim公司)，血糖试剂盒(慈溪康华生化制品厂)，脱氧核糖核酸酶(DNase酶，华美公司)，FasL(Fas配体)检测试剂盒(武汉博士德公司)，TUNEL试剂盒(Boehringer Mannheim公司)包括TUNEL液Ⅰ(末端脱氧核苷酸转移酶)，TUNEL液Ⅱ(x-dUTP：带荧光素的dUTP抗荧光素抗体)，成色反应液(碱性磷酸酶/坚固红)-FasL red(Sigma公司)，20g/L的蛋白酶K(Sigma公司).
, 百拇医药
1.2 方法 选择健康SD大鼠，于阴茎背静脉注入20g/L链脲酶素(溶于0.12mol/L的枸橼酸中pH 4.5)50mg/kg，注药后1，2，4，10d测血糖(酶酚试剂法)连续2次超过16.8mmol/L，尿糖持续++++(班氏试剂法)，选为糖尿病模型. 同时可出现饮水多，体质量下降(注药1wk下降超过15g)，尿量增多且呈酸臭味，失水、消瘦、反应迟钝.
1.2.1 组织学检测 注射链脲酶素后1，3，5，7d各取3只大鼠处死后取胰腺、胸腺、脾脏，经40mL/L的多聚甲醛固定，石蜡包埋行HE染色，及FasL测定、原位胰岛凋亡测定及β细胞特殊染色.
1.2.2 FasL+的表达 SABC法测定FasL的表达情况，方法简述如下：切片脱蜡至水，以30mL/L H2O2室温下处理5min～10min，微波炉加热至96℃～100℃，持续10min～20min，滴加兔抗FasL抗体及生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 20min，滴加SABC，37℃ 20min后DAB显色，苏木素轻度复染，阳性细胞呈棕黄色.
, 百拇医药
1.2.3 TUNEL法测定胰岛细胞凋亡 按Gavrieli et al[2]所述方法略有改进. 组织切片脱蜡水化，2g/L的蛋白酶K消化30min，37℃. TUNEL液(TUNELⅠ液10μL，Ⅱ液90μL充分混和)孵育60min，37℃. 直接在荧光显微镜下观察或抗荧光素抗体，孵育30min，37℃. 坚固红成色，普通显微镜下观察，可见到散在的被标记的凋亡细胞核呈红色. 在此基础上进行胰岛β细胞特殊染色，采用Mallory三色染色法(MCT)[3]，β细胞被染成橘黄色. 封片4℃保存.
2 结果
糖尿病鼠胰岛病理变化及凋亡的存在 糖尿病大鼠胰腺HE染色可见胰岛明显变小、萎缩；FasL测定胸腺及脾脏内有大量的FasL+细胞，而胰腺内无FasL+细胞存在. TUNEL法标记凋亡细胞发现链脲酶素诱导糖尿病后胰岛内大量凋亡细胞存在，主要位于胰岛的边缘区，而外分泌腺区无明显的凋亡细胞存在. 在注射链脲酶素后1d即可见胰岛细胞凋亡，3d～5d达高峰，处死的3只SD大鼠胰岛细胞均可见明显的胰岛细胞凋亡，经胰岛特殊染色证实凋亡的细胞大多数是胰岛B细胞，7d后凋亡逐渐减少.
, 百拇医药
3 讨论
Fas系统的研究是当前免疫学的热点之一. FasL除存在于活性淋巴细胞外，机体组织中主要存在于免疫豁免组织中，Griffith et al[4]使病毒感染正常鼠前房后，未发现炎症浸润，而病毒感染缺乏FasL的GID(general lympholiferation disease)鼠出现明显的炎性浸润，检测发现眼睛内存在FasL(Fas Ligand)，其通过凋亡减少进入其内的Fas+T淋巴细胞，睾丸组织也有类似现象[5，6]. 说明FasL在防止炎症反应中的作用. 本实验中胸腺及脾脏均存在大量FasL+细胞，可以杀伤任何走近这些组织器官的活性淋巴细胞(表达Fas)，从而使这些组织免于炎性反应，而胰腺中无FasL+细胞存在，易于被炎性细胞毁损，这是否与胰腺易受炎性反应侵害而产生自身免疫性糖尿病或容易发生各种类型的胰腺炎有关. 另外，尚有一种观点认为[7]：胰岛β细胞可被诱导产生Fas，反而成为FasL+ CD4细胞裂解的靶细胞.
, 百拇医药
同时，我们通过对链脲酶素诱导的糖尿病大鼠胰腺进行病理分析及TUNEL标记凋亡细胞，发现胰岛内存在明显的凋亡细胞，通过凋亡使大量的β细胞凋亡，从而使胰岛的体积明显变小，最终使胰岛功能丧失，产生糖尿病症状，最近国外也有报道认为自身免疫性糖尿病也是通过凋亡途径毁损胰岛功能[1]，链脲酶素所至的糖尿病可能是通过诱导胰岛细胞凋亡途径形成的，人体自身免疫性糖尿病可能也是经此途径，是否可通过抑制胰腺局部凋亡而防止或减慢糖尿病的发生，为糖尿病的预防和治疗提供了一条途径.
4 参考文献
1 Kurrer MO, Pakala SV, Hanson HL, Katz JD. β cell apoptosis in cell-mediated autoimmune diabetes.
Proc Natl Acad Sci USA, 1997;94:213-218
, 百拇医药
2 Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear
DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992;119:492-501
3 龚志锦，詹熔洲. Mallory三色染色法(MCT). 见：龚志锦，詹熔洲主编. 病理组织切片和染色技术. 第1版. 上海：
上海科学技术出版社，1994：60-61
4 Griffith TS, Brunner J, Fletcher SM. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege. Science,
, 百拇医药
1995;270:1189-1192
5 Suda T, Takahashi T, Golstein P. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis
factor family. Cell, 1993;75:1169-1178
6 Bellgrau D, Gild D, Selawry H. A role for CD95 ligand in preventing graft rejection. Nature, 1995;377:630-632
7 Stassi G, Todaro M, Richiusa P, Giordano M, Mattina A, Sbriglia MS, Lo Monte A, Buscemi G, Galluzzo A, Giordano C. Expression
of apoptosis-inducing CD95(Fas/Apo-1)on human betal cells sorted by flow-cytometry and cultured in vitro.
Transplant Proc, 1995;27:3271-3275, 百拇医药(兰 平 张 梅 王东平 汪建平 詹文华)