中毒剂量锌对大鼠小肠粘膜抗体产生的影响
中国人民解放军第三军医大学附属第一医院消化科 重庆市 400038
项目负责人 罗治彬中国人民解放军第三军医大学附属第一医院消化科 重庆市 400038
收稿日期 1999-11-25 接收日期 2000-01-08
Subject headings zinc; immunohistochemistry; sIgA; intestinal mucosa
主题词 锌；免疫组织化学；免疫球蛋白A；肠粘膜
锌是机体必需微量元素之一，研究表明锌过量可引起机体生物合成、中枢免疫系统的结构和功能严重受损，导致机体生长发育不良和免疫力下降，甚至发生反复感染. 本文通过建立正常锌(ZN)、中毒剂量锌(ZE)大鼠模型，对大鼠肠道粘膜IgA的表达作定位和定量研究.
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1 材料和方法
1.1 材料 硫酸锌(上海生化试剂二厂),小鼠抗大鼠IgA单克隆抗体(α-链特异, Sigma),抗大鼠IgA血清(Sigma),原子吸收分光光度计(IL-AA951型，美国),电热恒温消化器(核工业北京冶金化学研究院),酶标测试仪(Model 3551型，美国),图象分析仪(MD-20型，德国徕卡). 采用第三军医大学实验动物中心提供的新生1d的纯系同批健康Wistar大鼠8窝共60只(动物合格证: 医动字第24301050号),♀ ♂各半,平均质量为7.20g±0.54g(经统计学处理各组无显著差异)，按随机排列表法分为ZE组和ZN组二组,各组30只. 常锌饲料在Flanagan缺锌饲料配方[1]中加入硫酸锌,使饲料含锌量50mg/kg. 中毒剂量锌饲料在Flanagan缺锌饲料配方中加入硫酸锌,使饲料含锌量1500mg/kg.
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1.2 方法 动物房洁净无尘，室温控制在24℃左右，湿度50%，光照及黑夜人工控制，各12h,在不锈钢笼具内饲养，食具为玻璃器皿，使用前用酸及双蒸水清洗，并定期用双蒸水冲洗. 各组大鼠饲以相应的含锌饲料，自由饮用去离子水. 分别记录各组每天进食量，观察其生长发育、活动情况、精神状态及大便性状，每周测一次体重. 仔鼠由母鼠授乳至d28时，处死第一批动物，进行第一时相各项指标检测；余下仔鼠断奶分笼，每笼2只(性别相同)，仍饲以相应含锌饲料，至d50时全部处死，进行第二时相各项指标检测. ①微量元素锌的检测：采用原子吸收分光光度计测定,均采用质量控制. 饲料锌含量测定用灰化法;血浆锌含量测定用稀释法,结果以μmol/L表示;肠组织锌含量测定用湿化法,结果以mg/g表示;红细胞膜锌含量测定参照文献[2]进行,结果以μmol/L表示. ②小肠的组织学观察：大鼠处死后迅速打开腹腔，取空肠近端(以蔡氏韧带为起点)2cm处肠段，用于常规HE染色及免疫组织化学染色. ③小肠IgA浆细胞的分析测定：采用免疫组织化学染色(ABC法),结果用图象分析测定积分光密度(IOD)、计数(个/μm2 )、平均面积(μm2)和平均周长(μm). ④小肠粘液提取: 参照文转[3]进行,4℃贮存备用. ⑤粘液IgA的测定：BA-ELISA法,参照文献[4]进行.
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统计学处理 采用第三军医大学数学教研室编制的数理统计程序包分析,结果以均数及标准差(x±s)表示.P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极为显著.
2 结果
2.1 中毒剂量锌对血浆锌、红细胞膜锌和肠组织锌的影响 ZE组wk4 (ZE4)、wk7 (ZE7) 时血浆锌、红细胞膜锌和肠组织锌显著高于ZN组(P<0.05,表1).
表1 wk4，wk7时各组大鼠血浆、红细胞膜及肠组织锌含量(x±s)
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aP<0.05 vs ZN组.
2.2 中毒剂量锌对肠粘膜固有层IgA浆细胞的影响 ZE组平均周长显著高于正常组(P<0.05),而IgA浆细胞计数(0.66个/μm2±0.23个/μm2)、平均光密度和平均面积均显著低于ZN组(P<0.01,表2).
表2 wk7末大鼠IgA浆细胞面积周长和光密度的变化(x±s)
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aP<0.05，bP<0.01 vs ZN组.(1)平均面积=总面积÷IgA浆细胞数；(2)平均周长=总周长÷IgA浆细胞数；(3)平均光密度=IOD÷IgA浆细胞数
2.3 中毒剂量慷哉骋篒gA的影响 ZE组wk4和wk7时分别为0.20±0.06和0.26±0.03,均显著低于ZN组(P<0.01).
3 讨论
本课题采用中毒剂量锌饲料饲养动物7wk，发现中毒剂量锌大鼠从wk4开始出现进行性食欲减退，活动减少,嗜睡、呆滞或狂躁不安,毛发紊乱，体重增长缓慢，腹泻等；wk7时，动物嗜睡，咬尾，发育停滞，饲料效价明显降低，血浆、红细胞膜和肠组织锌含量明显高于正常组，死亡率高达22.86%，与文献报道相符[5]. 表明我们所复制的常锌、中毒剂量锌大鼠模型是成功的.
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IgA包括两种亚型：IgA1和IgA2，前者主要存在于血液中，含量甚微;后者主要存在于外分泌液中，它常与分泌片段SC结合形成sIgA. 肠粘膜的主要抗体是sIgA，存在于粘液中，对阻止病原菌的入侵有关键性的作用，因此有人称粘膜免疫为sIgA免疫. 我们结果表明锌中毒时粘膜固有层IgA浆细胞数量减少，其合成和分泌IgA的能力削弱，粘液IgA含量显著低下，粘膜免疫能力下降. 同时可能还与下述因素有关：锌中毒剂量时血清高密度脂蛋白(HDL)降低，低密度脂蛋白(LDL)升高，二者比例失调，改变了膜正常结构，使IgA分泌细胞的成熟、发育、结构和功能发生相应的病理性变化[6]；中毒剂量锌使机体微量营养素之间的吸收转运和利用的动态平衡失调，影响了其他营养素的吸收利用，抗体形成受到影响.
锌营养紊乱尤其是锌中毒状态时，IgA浆细胞发育受阻，sIgA抗体形成减少，粘膜抗体sIgA减少,sIgA免疫功能削弱，这常常是肠道感染或肠源性感染的根源之一，但有关这方面研究较少，值得进一步研究.
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4 参考文献
1 Flanagan PR. A model to produce zinc deficiency in rats and its use to demonstrate that dietary phytate increase the excretion
of endogenous zinc. J Nutr, 1984;114:493-502
2 张裕曾, 陈琢, 刘芸. 大白鼠红细胞膜和红细胞中钙锌测定方法探讨. 中国卫生检验杂志, 1995;5:216-218
3 Mantle M, Allen A. Isolation and characterization of the native glycoprotein from pig small-intestinal mucus.
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Biochem J, 1981;195:267-275
4 陈志华，徐晓平，苏新，高杰英. BA-ELISA法测定人粪便特异抗体.军事医学科学院院刊, 1991;15:301-304
5 Fosmire GJ. Zinc toxicity. Am J Clin Nutr, 1990;51:225-227
6 Yadrick MK. Iron, copper and zinc states: response to supplementation with zinc or zinc and iron in adult females.
Am J Clin Nutr, 1989;49:145-150, 百拇医药(罗治彬 吴嘉惠 徐采朴)
项目负责人 罗治彬中国人民解放军第三军医大学附属第一医院消化科 重庆市 400038
收稿日期 1999-11-25 接收日期 2000-01-08
Subject headings zinc; immunohistochemistry; sIgA; intestinal mucosa
主题词 锌；免疫组织化学；免疫球蛋白A；肠粘膜
锌是机体必需微量元素之一，研究表明锌过量可引起机体生物合成、中枢免疫系统的结构和功能严重受损，导致机体生长发育不良和免疫力下降，甚至发生反复感染. 本文通过建立正常锌(ZN)、中毒剂量锌(ZE)大鼠模型，对大鼠肠道粘膜IgA的表达作定位和定量研究.
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1 材料和方法
1.1 材料 硫酸锌(上海生化试剂二厂),小鼠抗大鼠IgA单克隆抗体(α-链特异, Sigma),抗大鼠IgA血清(Sigma),原子吸收分光光度计(IL-AA951型，美国),电热恒温消化器(核工业北京冶金化学研究院),酶标测试仪(Model 3551型，美国),图象分析仪(MD-20型，德国徕卡). 采用第三军医大学实验动物中心提供的新生1d的纯系同批健康Wistar大鼠8窝共60只(动物合格证: 医动字第24301050号),♀ ♂各半,平均质量为7.20g±0.54g(经统计学处理各组无显著差异)，按随机排列表法分为ZE组和ZN组二组,各组30只. 常锌饲料在Flanagan缺锌饲料配方[1]中加入硫酸锌,使饲料含锌量50mg/kg. 中毒剂量锌饲料在Flanagan缺锌饲料配方中加入硫酸锌,使饲料含锌量1500mg/kg.
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1.2 方法 动物房洁净无尘，室温控制在24℃左右，湿度50%，光照及黑夜人工控制，各12h,在不锈钢笼具内饲养，食具为玻璃器皿，使用前用酸及双蒸水清洗，并定期用双蒸水冲洗. 各组大鼠饲以相应的含锌饲料，自由饮用去离子水. 分别记录各组每天进食量，观察其生长发育、活动情况、精神状态及大便性状，每周测一次体重. 仔鼠由母鼠授乳至d28时，处死第一批动物，进行第一时相各项指标检测；余下仔鼠断奶分笼，每笼2只(性别相同)，仍饲以相应含锌饲料，至d50时全部处死，进行第二时相各项指标检测. ①微量元素锌的检测：采用原子吸收分光光度计测定,均采用质量控制. 饲料锌含量测定用灰化法;血浆锌含量测定用稀释法,结果以μmol/L表示;肠组织锌含量测定用湿化法,结果以mg/g表示;红细胞膜锌含量测定参照文献[2]进行,结果以μmol/L表示. ②小肠的组织学观察：大鼠处死后迅速打开腹腔，取空肠近端(以蔡氏韧带为起点)2cm处肠段，用于常规HE染色及免疫组织化学染色. ③小肠IgA浆细胞的分析测定：采用免疫组织化学染色(ABC法),结果用图象分析测定积分光密度(IOD)、计数(个/μm2 )、平均面积(μm2)和平均周长(μm). ④小肠粘液提取: 参照文转[3]进行,4℃贮存备用. ⑤粘液IgA的测定：BA-ELISA法,参照文献[4]进行.
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统计学处理 采用第三军医大学数学教研室编制的数理统计程序包分析,结果以均数及标准差(x±s)表示.P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极为显著.
2 结果
2.1 中毒剂量锌对血浆锌、红细胞膜锌和肠组织锌的影响 ZE组wk4 (ZE4)、wk7 (ZE7) 时血浆锌、红细胞膜锌和肠组织锌显著高于ZN组(P<0.05,表1).
表1 wk4，wk7时各组大鼠血浆、红细胞膜及肠组织锌含量(x±s)
| 组别 | n | 血浆(μmol/L) | 红细胞膜(μmol/L) | 肠组织(mg/g) |
| ZN4 | 10 | 35±5 | 4.17±0.64 | 2.13±0.26 |
| ZE4 | 10 | 53±7a | 6.25±1.12a | 5.19±0.63a |
| ZN7 | 10 | 37±3 | 4.26±1.06 | 2.30±0.49 |
| ZE7 | 10 | 74±11a | 7.78±0.94a | 5.87±1.19a |
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aP<0.05 vs ZN组.
2.2 中毒剂量锌对肠粘膜固有层IgA浆细胞的影响 ZE组平均周长显著高于正常组(P<0.05),而IgA浆细胞计数(0.66个/μm2±0.23个/μm2)、平均光密度和平均面积均显著低于ZN组(P<0.01,表2).
表2 wk7末大鼠IgA浆细胞面积周长和光密度的变化(x±s)
| 项目 | n | ZN组 | ZE组 |
| IgA浆细胞数(个/μm2) | 10 | 1.35±0.44 | 0.66±0.23b |
| 平均面积(μm2)(1) | 10 | 11.05±2.73 | 9.58±3.75b |
| 平均周长(μm)(2) | 10 | 26.08±5.14 | 31.21±9.62a |
| 平均光密度(3) | 10 | 114.35±40.72 | 44.44±35.12b |
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aP<0.05，bP<0.01 vs ZN组.(1)平均面积=总面积÷IgA浆细胞数；(2)平均周长=总周长÷IgA浆细胞数；(3)平均光密度=IOD÷IgA浆细胞数
2.3 中毒剂量慷哉骋篒gA的影响 ZE组wk4和wk7时分别为0.20±0.06和0.26±0.03,均显著低于ZN组(P<0.01).
3 讨论
本课题采用中毒剂量锌饲料饲养动物7wk，发现中毒剂量锌大鼠从wk4开始出现进行性食欲减退，活动减少,嗜睡、呆滞或狂躁不安,毛发紊乱，体重增长缓慢，腹泻等；wk7时，动物嗜睡，咬尾，发育停滞，饲料效价明显降低，血浆、红细胞膜和肠组织锌含量明显高于正常组，死亡率高达22.86%，与文献报道相符[5]. 表明我们所复制的常锌、中毒剂量锌大鼠模型是成功的.
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IgA包括两种亚型：IgA1和IgA2，前者主要存在于血液中，含量甚微;后者主要存在于外分泌液中，它常与分泌片段SC结合形成sIgA. 肠粘膜的主要抗体是sIgA，存在于粘液中，对阻止病原菌的入侵有关键性的作用，因此有人称粘膜免疫为sIgA免疫. 我们结果表明锌中毒时粘膜固有层IgA浆细胞数量减少，其合成和分泌IgA的能力削弱，粘液IgA含量显著低下，粘膜免疫能力下降. 同时可能还与下述因素有关：锌中毒剂量时血清高密度脂蛋白(HDL)降低，低密度脂蛋白(LDL)升高，二者比例失调，改变了膜正常结构，使IgA分泌细胞的成熟、发育、结构和功能发生相应的病理性变化[6]；中毒剂量锌使机体微量营养素之间的吸收转运和利用的动态平衡失调，影响了其他营养素的吸收利用，抗体形成受到影响.
锌营养紊乱尤其是锌中毒状态时，IgA浆细胞发育受阻，sIgA抗体形成减少，粘膜抗体sIgA减少,sIgA免疫功能削弱，这常常是肠道感染或肠源性感染的根源之一，但有关这方面研究较少，值得进一步研究.
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4 参考文献
1 Flanagan PR. A model to produce zinc deficiency in rats and its use to demonstrate that dietary phytate increase the excretion
of endogenous zinc. J Nutr, 1984;114:493-502
2 张裕曾, 陈琢, 刘芸. 大白鼠红细胞膜和红细胞中钙锌测定方法探讨. 中国卫生检验杂志, 1995;5:216-218
3 Mantle M, Allen A. Isolation and characterization of the native glycoprotein from pig small-intestinal mucus.
, http://www.100md.com
Biochem J, 1981;195:267-275
4 陈志华，徐晓平，苏新，高杰英. BA-ELISA法测定人粪便特异抗体.军事医学科学院院刊, 1991;15:301-304
5 Fosmire GJ. Zinc toxicity. Am J Clin Nutr, 1990;51:225-227
6 Yadrick MK. Iron, copper and zinc states: response to supplementation with zinc or zinc and iron in adult females.
Am J Clin Nutr, 1989;49:145-150, 百拇医药(罗治彬 吴嘉惠 徐采朴)