胰腺癌组织P16蛋白表达的意义
中国人民解放军第一军医大学珠江医院肝胆外科 广东省广州市 510282
项目负责人 陈建锋 中国人民解放军第一军医大学珠江医院肝胆外科 广东省广州市 510282Tel. 0086-20-85143556
Email. jfchen99@163.net
收稿日期 2000-07-05 接受日期 2000-07-12
主题词 胰腺肿瘤/诊断；蛋白质P16；免疫组织化学；转染
陈建锋, 俞金龙, 汪爽, 高毅. 胰腺癌组织P16蛋白表达的意义. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：237
, 百拇医药
原发性胰腺癌是临床上比较常见的消化系统肿瘤之一[1,2]，发现晚、诊断难、易侵袭转移是阻碍胰腺癌诊治的主要原因[3-7]. 胰腺癌也是一种基因性疾病[8-10]，大约95%的胰腺癌与P16基因转录错误相关[11]. P16蛋白是该基因的表达产物，我们用免疫组织化学技术检测了32例胰腺癌组织中P16蛋白的表达情况，并探讨P16蛋白与原发性胰腺癌生物学行为的关系，现将结果报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 珠江医院肝胆外科经手术及病理证实的胰腺癌标本32例，其中男27例，女5例. 年龄45岁～73岁，平均55岁. 术前均未放疗或化疗. 按组织学分级，高分化腺癌6例，中分化腺癌12例，低分化腺癌14例. 15例伴有腹腔淋巴结转移. 所有标本均经100mL·L-1福尔马林固定，石蜡包埋. 另取经病理证实的正常胰腺组织7例作为阴性对照. 兔抗人P16蛋白多克隆抗体购自深圳晶美生物工程有限公司，LSAB试剂盒购自
, 百拇医药
Sigma公司.
1.2 方法 按产品说明书的方法和要求进行. 以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，所取肿瘤标本作阳性对照. 标本常规脱蜡补水，加30mL·L-1 H2O2甲醇液，水洗后加入一抗4℃过夜，PBS洗后，加入二抗37℃ 30min，加入新配制的ABC复合物，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明封片. P16蛋白染色以着色深度为标准：深红色为++，浅红色为+，不着色或着色不清为阴性.
统计学处理 实验数据采用χ2检验.
2 结果
低分化组胰腺癌组织中P16蛋白的缺失率较高，与高分化组和正常对照组之间差异显著(P<0.05);中分化胰腺癌组织中P16蛋白的缺失率与正常对照组也有明显差距(P<0.05，表1). 转移组胰腺癌组织中P16蛋白的表达缺失率与无转移组之间也有显著差异
, 百拇医药
(P<0.05，表2).
表1 P16蛋白在不同组织学分型胰腺癌组织中的表达
, 百拇医药
aP<0.05 vs 低分化;bP<0.05 vs 对照组.
表2 P16蛋白在有无转移胰腺癌组织中的表达
aP<0.05 vs 无转移组.
, 百拇医药
3 讨论
P16基因,又称MTS1(multiple tumor suppresor 1)或CDK4I(cyclin dependent kinase 4 inhibitor),为肿瘤抑制基因,位于第9号染色体短臂(9p21)区域，全长8.5kb，编码Mr 16000蛋白即P16蛋白. 氨基酸序列分析表明,成熟的P16分子为单链多肽,含有一个由148个氨基酸组成的开放阅读框架,具有呈四个回钩状重叠空间构型的蛋白结构,该结构为维持其生物学活性所必须. 真核细胞分裂必须经过两个关键环节：G1至S期和G2至M期. 是细胞周期调节中心，其成员的激活和磷酸化促进细胞周期从G1至S期和G2至M期的转变. P16基因通过其表达产物P16蛋白与CDK4结合抑制CDK4的功能. CDK4与cyclindl结合，能使细胞周期进入G1期，而P16蛋白与CDK4结合后，使PRB(视网膜母细胞瘤基因蛋白)磷酸化作用减小，导致转录因子E2F释放减少，细胞从G1期至S期受抑制，从而使细胞生长停滞[12,13]. 实验证实，P16基因在多种肿瘤标本及细胞系中有改变，包括缺失、重排、点突变、甲基化. Jin et al[14]采用转染实验证实，P16蛋白的高表达使肿瘤生长受抑制. 因此，检测P16蛋白的改变可作为肿瘤诊断、治疗和预后判断的辅助手段.
, http://www.100md.com
我们应用免疫组织化学技术检测了32例胰腺癌组织中P16蛋白的表达情况，结果表明在不同分化等级的胰腺癌组织中P16蛋白的表达缺失率存在差异性，其中低分化组胰腺癌中P16蛋白缺失率高达57.1%，与正常对照组以及高分化组有显著差异. 肿瘤的分化等级越低，P16蛋白缺失率就越高，说明P16蛋白的表达缺失率可以反映肿瘤的恶性程度，P16蛋白低表达的胰腺癌恶性程度较高，手术切除率低，而P16蛋白高表达的胰腺癌恶性程度低，手术切除率相对较高；同时，在胰腺癌转移组中，P16蛋白的缺失率明显高于无转移组，表明P16蛋白的低表达是胰腺癌的晚期表现，易发生浸润和转移，预后差. 综合P16蛋白在不同分化等级以及有无转移的胰腺癌组织中的表达情况，可以看出P16蛋白对临床胰腺癌的诊断、治疗及预后判断具有一定的参考价值.
4 参考文献
1 周振华, 宋明志. 胰腺癌的当代治疗. 世界华人消化杂志， 2000;8:214-215
, 百拇医药
2 吴中远, 宋大捷, 唐令超, 旷天立. 胰腺癌118例误诊分析. 新消化病学杂志, 1996;4(特刊5):231
3 Li RH, Zhang L, Wu MY. Tissue isoantigens A, B and H in primary carcinoma of the pancreas.
China Natl J New Gastroenterol,1996;2:241-242
4 Zhao XY, Yu SY, Da SP, Bai L, Guo XZ, Dai XJ, Wang YM. A clinical evaluation of serological diagnosis for pancreatic cancer.
World J Gastroenterol, 1998;4:147-149
, 百拇医药
5 贾林, 袁世珍. 氟胞苷治疗进展期胰腺癌的进展. 世界华人消化杂志, 1999;7:985-986
6 侯振江, 张宗英, 郭金英. 胰腺癌酶学诊断价值. 华人消化杂志, 1998;6:130
7 杨波, 张弘, 朱善德, 杜晓炬, 李顺明, 于众, 冯新莉, 蒲菲菲, 康健. 胰腺癌患者血清及组织中β-葡萄糖醛酸酶的活性.
世界华人消化杂志, 1999;7:1067
8 张世能, 袁世珍. 胰腺癌基因治疗研究进展. 世界华人消化杂志, 1999;7:269-270
9 厉周, 黄宗海, 杨继震. 胰腺癌的基因治疗. 新消化病学杂志, 1997;5:599-600
, http://www.100md.com
10 孙诚谊, 张延龄, 施达仁, 陆洪珍. 胰腺癌ras癌基因及p53抑癌基因表达的临床意义. 华人消化杂志,1998;6(特刊7):237-239
11 Wilentz RE, Geradts J, Maynard R, Offerhaus GJ, Kang M, Goggin M, Yeo CJ, Kern SE, Hruban RH. Inactivation of the
P16(INK4A) tumor-suppressor gene in pancreatic duct lesions: Loss of intranuclear expression. Cancer Res,1998;58:4740-4744
12 Serranom M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.
, 百拇医药
Nature, 1993;366:704-707
13 Imai Y, Tsurutani N, Oda H, Nakatsuru Y, Inoue T, Iahikawa T. p16INK4 gene mutations are relatively frequent in
ampullary carcinomas. Jpn J Cancer Res, 1997;88:941-946
14 Jin X, Ngugend D, Zhang WW, Kyritsis AP, Roth JA. Cell cycle arrest and inhibition of tumor cell proliferation by the p16INK4
gene mediated by an adenovirus vector. Cancer Res, 1995;55:3250-3253, http://www.100md.com(陈建锋 俞金龙 汪 爽 高 毅)
项目负责人 陈建锋 中国人民解放军第一军医大学珠江医院肝胆外科 广东省广州市 510282Tel. 0086-20-85143556
Email. jfchen99@163.net
收稿日期 2000-07-05 接受日期 2000-07-12
主题词 胰腺肿瘤/诊断；蛋白质P16；免疫组织化学；转染
陈建锋, 俞金龙, 汪爽, 高毅. 胰腺癌组织P16蛋白表达的意义. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：237
, 百拇医药
原发性胰腺癌是临床上比较常见的消化系统肿瘤之一[1,2]，发现晚、诊断难、易侵袭转移是阻碍胰腺癌诊治的主要原因[3-7]. 胰腺癌也是一种基因性疾病[8-10]，大约95%的胰腺癌与P16基因转录错误相关[11]. P16蛋白是该基因的表达产物，我们用免疫组织化学技术检测了32例胰腺癌组织中P16蛋白的表达情况，并探讨P16蛋白与原发性胰腺癌生物学行为的关系，现将结果报告如下.
1 材料和方法
1.1 材料 珠江医院肝胆外科经手术及病理证实的胰腺癌标本32例，其中男27例，女5例. 年龄45岁～73岁，平均55岁. 术前均未放疗或化疗. 按组织学分级，高分化腺癌6例，中分化腺癌12例，低分化腺癌14例. 15例伴有腹腔淋巴结转移. 所有标本均经100mL·L-1福尔马林固定，石蜡包埋. 另取经病理证实的正常胰腺组织7例作为阴性对照. 兔抗人P16蛋白多克隆抗体购自深圳晶美生物工程有限公司，LSAB试剂盒购自
, 百拇医药
Sigma公司.
1.2 方法 按产品说明书的方法和要求进行. 以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，所取肿瘤标本作阳性对照. 标本常规脱蜡补水，加30mL·L-1 H2O2甲醇液，水洗后加入一抗4℃过夜，PBS洗后，加入二抗37℃ 30min，加入新配制的ABC复合物，DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明封片. P16蛋白染色以着色深度为标准：深红色为++，浅红色为+，不着色或着色不清为阴性.
统计学处理 实验数据采用χ2检验.
2 结果
低分化组胰腺癌组织中P16蛋白的缺失率较高，与高分化组和正常对照组之间差异显著(P<0.05);中分化胰腺癌组织中P16蛋白的缺失率与正常对照组也有明显差距(P<0.05，表1). 转移组胰腺癌组织中P16蛋白的表达缺失率与无转移组之间也有显著差异
, 百拇医药
(P<0.05，表2).
表1 P16蛋白在不同组织学分型胰腺癌组织中的表达
| 胰腺癌 | P16蛋白的表达 | 合计 | 缺失率(%) | ||
| ++ | + | - | |||
| 高分化a | 4 | 2 | 0 | 6 | 0 |
| 中分化b | 2 | 6 | 4 | 12 | 33.3 |
| 低分化 | 2 | 4 | 8 | 14 | 57.1 |
| 正常对照a | 6 | 1 | 0 | 7 | 0 |
, 百拇医药
aP<0.05 vs 低分化;bP<0.05 vs 对照组.
表2 P16蛋白在有无转移胰腺癌组织中的表达
| 胰腺癌 | P16蛋白的表达 | 合计 | 缺失率(%) | ||
| ++ | + | - | |||
| 高分化a | 2 | 4 | 9 | 15 | 60.0 |
| 中分化b | 9 | 5 | 3 | 17 | 17.7 |
aP<0.05 vs 无转移组.
, 百拇医药
3 讨论
P16基因,又称MTS1(multiple tumor suppresor 1)或CDK4I(cyclin dependent kinase 4 inhibitor),为肿瘤抑制基因,位于第9号染色体短臂(9p21)区域，全长8.5kb，编码Mr 16000蛋白即P16蛋白. 氨基酸序列分析表明,成熟的P16分子为单链多肽,含有一个由148个氨基酸组成的开放阅读框架,具有呈四个回钩状重叠空间构型的蛋白结构,该结构为维持其生物学活性所必须. 真核细胞分裂必须经过两个关键环节：G1至S期和G2至M期. 是细胞周期调节中心，其成员的激活和磷酸化促进细胞周期从G1至S期和G2至M期的转变. P16基因通过其表达产物P16蛋白与CDK4结合抑制CDK4的功能. CDK4与cyclindl结合，能使细胞周期进入G1期，而P16蛋白与CDK4结合后，使PRB(视网膜母细胞瘤基因蛋白)磷酸化作用减小，导致转录因子E2F释放减少，细胞从G1期至S期受抑制，从而使细胞生长停滞[12,13]. 实验证实，P16基因在多种肿瘤标本及细胞系中有改变，包括缺失、重排、点突变、甲基化. Jin et al[14]采用转染实验证实，P16蛋白的高表达使肿瘤生长受抑制. 因此，检测P16蛋白的改变可作为肿瘤诊断、治疗和预后判断的辅助手段.
, http://www.100md.com
我们应用免疫组织化学技术检测了32例胰腺癌组织中P16蛋白的表达情况，结果表明在不同分化等级的胰腺癌组织中P16蛋白的表达缺失率存在差异性，其中低分化组胰腺癌中P16蛋白缺失率高达57.1%，与正常对照组以及高分化组有显著差异. 肿瘤的分化等级越低，P16蛋白缺失率就越高，说明P16蛋白的表达缺失率可以反映肿瘤的恶性程度，P16蛋白低表达的胰腺癌恶性程度较高，手术切除率低，而P16蛋白高表达的胰腺癌恶性程度低，手术切除率相对较高；同时，在胰腺癌转移组中，P16蛋白的缺失率明显高于无转移组，表明P16蛋白的低表达是胰腺癌的晚期表现，易发生浸润和转移，预后差. 综合P16蛋白在不同分化等级以及有无转移的胰腺癌组织中的表达情况，可以看出P16蛋白对临床胰腺癌的诊断、治疗及预后判断具有一定的参考价值.
4 参考文献
1 周振华, 宋明志. 胰腺癌的当代治疗. 世界华人消化杂志， 2000;8:214-215
, 百拇医药
2 吴中远, 宋大捷, 唐令超, 旷天立. 胰腺癌118例误诊分析. 新消化病学杂志, 1996;4(特刊5):231
3 Li RH, Zhang L, Wu MY. Tissue isoantigens A, B and H in primary carcinoma of the pancreas.
China Natl J New Gastroenterol,1996;2:241-242
4 Zhao XY, Yu SY, Da SP, Bai L, Guo XZ, Dai XJ, Wang YM. A clinical evaluation of serological diagnosis for pancreatic cancer.
World J Gastroenterol, 1998;4:147-149
, 百拇医药
5 贾林, 袁世珍. 氟胞苷治疗进展期胰腺癌的进展. 世界华人消化杂志, 1999;7:985-986
6 侯振江, 张宗英, 郭金英. 胰腺癌酶学诊断价值. 华人消化杂志, 1998;6:130
7 杨波, 张弘, 朱善德, 杜晓炬, 李顺明, 于众, 冯新莉, 蒲菲菲, 康健. 胰腺癌患者血清及组织中β-葡萄糖醛酸酶的活性.
世界华人消化杂志, 1999;7:1067
8 张世能, 袁世珍. 胰腺癌基因治疗研究进展. 世界华人消化杂志, 1999;7:269-270
9 厉周, 黄宗海, 杨继震. 胰腺癌的基因治疗. 新消化病学杂志, 1997;5:599-600
, http://www.100md.com
10 孙诚谊, 张延龄, 施达仁, 陆洪珍. 胰腺癌ras癌基因及p53抑癌基因表达的临床意义. 华人消化杂志,1998;6(特刊7):237-239
11 Wilentz RE, Geradts J, Maynard R, Offerhaus GJ, Kang M, Goggin M, Yeo CJ, Kern SE, Hruban RH. Inactivation of the
P16(INK4A) tumor-suppressor gene in pancreatic duct lesions: Loss of intranuclear expression. Cancer Res,1998;58:4740-4744
12 Serranom M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.
, 百拇医药
Nature, 1993;366:704-707
13 Imai Y, Tsurutani N, Oda H, Nakatsuru Y, Inoue T, Iahikawa T. p16INK4 gene mutations are relatively frequent in
ampullary carcinomas. Jpn J Cancer Res, 1997;88:941-946
14 Jin X, Ngugend D, Zhang WW, Kyritsis AP, Roth JA. Cell cycle arrest and inhibition of tumor cell proliferation by the p16INK4
gene mediated by an adenovirus vector. Cancer Res, 1995;55:3250-3253, http://www.100md.com(陈建锋 俞金龙 汪 爽 高 毅)