丙型肝炎病毒核心区基因在大肠杆菌中的高效表达
西安交通大学第一医院肝胆外科 陕西省西安市 710061
项目负责人 李华 西安交通大学第一医院肝胆外科 陕西省西安市 710061Tel. 0086-29-5252981 Ext.2419
Email. Lihua100@yeah.net
收稿日期 2000-07-19 接受日期 2000-07-21
主题词 丙型肝炎病毒；病毒核心蛋白；基因表达；大肠杆菌；聚合酶链反应；抗原，病毒；酶连接免疫吸附测定
李华, 潘承恩, 陈武科, 王全颍, 杨广笑. 丙型肝炎病毒核心区基因在大肠杆菌中的高效表达. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：221-223
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后及散发性非甲非乙型肝炎的主要病原，丙型肝炎易转为慢性肝炎，与肝癌及肝硬变关系密切[1]. HCV核心区编码蛋白是研究重点之一. 在研究过程中，首先应获得大量高效表达的HCV核心蛋白抗原. HCV基因组结构与黄病毒或瘟病毒相似，为长约9.4kb的单股正链RNA，含一个开放读码框架(open reading frame, OFR) ，编码含3010～3011个氨基酸残基的多蛋白前体，经宿主和病毒蛋白酶作用加工成结构蛋白(C, E1和E2/NS1) 和非结构蛋白(NS2, NS3, NS4和NS5)[2]. 核心蛋白约含191个氨基酸，大小约19000～22000，其氨基酸序列十分保守，比较已有的HCV各分离株氨基酸序列，同源性超过95%. 其N端三个亲水区的优势抗原表位主要是线性抗原决定簇，在此免疫优势区内出现的变异对免疫识别并没有很大影响. 由于人感染HCV后，血清中HCV核心蛋白抗体出现较早，因此以完整的核心蛋白抗原作为包被抗原对HCV感染诊断具有足够的早期性和可靠性. 为了进一步研究HCV核心蛋白的特性并在病毒诊断中发挥作用，我们以非融合蛋白的方式，在大肠杆菌中高效表达了完整的HCV核心蛋白.
1 材料和方法
1.1 材料 表达质粒为pBV220，该质粒由中国预防医学科学院病毒所构建，为可以非融合蛋白形式表达外源基因的高效表达载体；含HCV1a全部结构基因和非结构基因组cDNA序列的重组质粒；受体菌为大肠杆菌DH5α，测序质粒为pUC19，以上均由西安华广生物工程公司提供. Taq DNA合成酶、T4DNA连接酶、dNTP等为Promega公司产品，限制性内切酶EcoRⅠ，BamHⅠ，辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG(IgG-HRP)等为华美公司产品. PCR引物设计及合成根据已发表的HCV1a型cDNA序列[3]，应用计算机DNA分析软件DNASIS辅助设计引物. 引物由北京赛百盛生物公司合成，高压液相纯化. 在正向引物(F)及反向引物(R)5＇端分别加入EcoRⅠ和BamHⅠ识别位点，同时在反向引物中加入终止密码TCA. 设计如下：F：5＇-GCGAATTCCATGAGCACGAATCCTA-3＇EcoRⅠ识别位点
R：5＇-GCGGATCCTCACACTTGGTAGGCCGAAG-3＇BamHⅠ识别位点
1.2 方法
1.2.1 PCR产物的扩增及序列分析 以含HCV1a全部结构和非结构基因组cDNA序列的重组质粒为模板，常规PCR法扩增核心区基因片段：94℃变性60s，40℃退火60s，72℃延伸90s，共30循环后，72℃延伸9min. 将PCR扩增产物经酶切鉴定后用琼脂糖电泳电洗脱，回收所需片段，克隆于pUC19中(pUC19-HCVcore). 采用Sanger双脱氧链末端终止法在373ADNA全自动测定仪(Applied Biosystem)上进行双向测序，测序结果应用DNASIS软件与Gene Bank中已知序列进行比较分析.
1.2.2 重组质粒构建及鉴定 从pUC19-HCVcore中切取目的基因片段，克隆于pBV220中构建重组质粒pBV-HCVcore，并酶切鉴定. 质粒提取、纯化、酶切、连接及克隆筛选均按常规方法进行. 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE电泳. 将含HCVcore基因重组质粒的细菌，在32℃振摇培养至对数期，42℃诱导表达8h. 离心收菌体，重悬后冻融数次，超声破碎，收集上清及沉淀. 沉淀经尿素变性、透析复性(初步纯化抗原). 以上样品分别加入加样缓冲液，100℃煮沸3min，用150g·L-1 SDS-PAGE进行电泳分离，考马斯亮蓝染色. 阴性对照为pBV220转化细菌的全菌裂解液. HCV核心蛋白活性初步测定. 应用间接ELISA法，分别用上述上清粗提液及初步纯化抗原检测已知HCV抗体阳性血清及阴性血清各6份，加入鼠抗人IgG-HRP，3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)使酶底物显色，450nm波长测定吸光度A值(即OD值). 再以抗体强阳性血清测定不同稀释度抗原，以确定其效价. HCV抗体阳性及阴性血清均由西安华广公司保存提供.
2 结果
2.1 PCR产物酶切鉴定 PCR扩增获得DNA片段约0.6kb，与理论预计的HCV core基因片段大小一致，经EcoRⅠ, BamHⅠ酶切后电泳也符合HCV core基因酶切谱(图1). 扩增产物序列的测序结果与Gene Bank已知HCV1a cDNA序列(No. M62321)比较：共585个碱基(起始密码ATG～终止密码TGA)，第84位碱基由C→T，氨基酸序列由 GGC→GGT，均编码Gly, 其余均一致. 碱基符合率99%，氨基酸符合率100%，从而确定该片段含HCVcore全基因组. 结果如下：
1 ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AAA AAA AAC AAA CGT AAC ACC AAC 48
49 CGT CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGT GGC GGTCAG ATC GTT GGT96
97 GGA GTT TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC CCT AGA TTG GGT GTG CGC GCG144
145 ACG AGA AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGA GGT AGA CGT CAG CCT192
193 ATC CCC AAG GCT CGT CGG CCC GAG GGC AGG ACC TGG GCT CAG CCC GGG240
241 TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC TGC GGG TGG GCG GGA TGG288
289 CTC CTG TCT CCC CGT GGC TCT CGG CCT AGC TGG GGC CCC ACA GAC CCC336
337 CGG CGT AGG TCG CGC AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACG TGC384
385 GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATA CCG CTC GTC GGC GCC CCT CTT432
433 GGA GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAA GAC480
481 GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAC CTT CCT GGT TGC TCT TTC TCT ATC528
529 TTC CTT CTG GCC CTG CTC TCT TGC TTG ACT GTG CCC GCT TCG GCC TAC576
577 CAA GTG TGA 585
2.2 表达质粒的构建 将pUC19-HCVcore经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切，回收HCVcore基因片段，与pBV220经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切的回收片段用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选出表达质粒pBV-HCVcore，酶切鉴定证实(图2). 含pBV-HCVcore的大肠杆菌DH5α在42℃条件下诱导表达，表达产物行150g·L-1 SDS-PAGE胶电泳. 可见全菌裂解液及复性后上清中，于Mr21000处有一特异表达蛋白带出现(图3)，与HCV核心蛋白理论值大小一致. 激光薄层扫描显示该蛋白表达量占细菌总蛋白量14%
左右.
2.3 HCV核心蛋白活性初步鉴定 以破菌后上清及复性后上清分别检测各6例HCV阳性(1～6号)及阴性血清(7～12号)，结果见表1. 可见表达产物具有HCV抗原活性，且主要存在于复性后上清中. 用不同稀释度复性上清包板，结果见表2，其效价可达1∶1600.
表1 表达产物中HCV核心蛋白抗原活性(A450nm)
表2 复性后上清HCV核心蛋白抗原效价(A450nm)
另：阴性对照中1∶100稀释血清A值为0.02.
图1 PCR产物的酶切鉴定.A：PCR产物经EcoRⅠ, BamHⅠ酶切; B：PCR marker
图2 pBV220-HCV core表达质粒的构建.
图3 HCVcore表达蛋白的SDS-PAGE分析.A：含pBV220的大肠杆菌全菌裂解液(阴性对照)；B：含pBV-HCVcore的大肠杆菌全菌裂解液；C：复性后上清；D：标准分子质量蛋白
3 讨论
对HCV的研究已经引起越来越多学者的重视[4-30]，目前认为HCV核心区高度保守，其编码的核心蛋白含有多个抗原表位，是HCV感染血清诊断的重要工具. 近年来的研究表明该蛋白可能具有直接致癌性[31]，进一步研究则显得尤为重要. 目前公认的HCV核心蛋白为191个氨基酸，与以往文献[32]不同，我们将下游引物选在C区和E1区交界处，以保证核心区基因的完整，引入的终止子可防止强转录启动子引起的通读现象. pBV220载体是我国科学家自己组建的原核高效表达载体，能够较好地表达外源基因[33]，以非融合蛋白形式表达的HCV核心蛋白在结构、功能及抗原性等方面更接近自然. 在SDS-PAGE电泳中显示的特异性表达产物为Mr21000左右，与理论值预计大小一致，用初步纯化的表达抗原建立ELISA，表明其具有较高的抗原活性. 核心蛋白含有能诱导机体产生体液免疫的CTL特异性抗原决定族，且核心区抗原为HCV非特异性抗原[34]，因此在诊断HCV感染中具有良好的应用前景. 实验结果同时显示此蛋白主要存在于复性后上清中，表明在本表达系统中该蛋白水溶性较差，大部分以包含体形式存在，可能与该蛋白中二硫键过多或异常折叠有关.
总之，这种以非融合蛋白形式高效表达的完整HCV核心蛋白，具有较高生物活性，为更加深入研究HCV核心蛋白的致病机制及生物学性状提供了可能.
4 参考文献
1 Bradley DW. Hepatitis viruses: their role in human cancer. Proc Assoc Am Physicians, 1999;111:588-593
2 Selby MJ, Choo QL, Berger K, Kuo G, Glazer E, Eckart M, Lee C, Chien D, Kuo C, Houghton M. Expression, identification
and subcellular localization of the proteins encoded by the hepatitis C viral genome. J Gen Virol, 1993;74(Pt 6):1103-1113
3 Choo QL, Richman KH, Han JH, Berger K, Lee C, Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby R, Barr PJ. Genetic organization and
diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88:2451-2455
4 张树林, 蔺淑梅, 李义方. 慢性丙型肝炎的诊疗现状. 新消化病学杂志, 1996;4:397-398
5 蔺淑梅, 张树林, 狄鹏超, 梁雪松. 重组免疫印迹试验在急性丙型肝炎诊断中的意义. 新消化病学杂志, 1996;4:511-512
6 于建国, 张光曙, 杨德利, 周秀梅, 陈崇兴. 慢性丙型肝炎病理学的探讨. 新消化病学杂志, 1996;4(特刊5):41-42
7 赵悦友, 杨洪业, 刘桂仙, 李子庆, 刘路, 何玲俐, 邓卫警. 原发性肝癌患者丙型肝炎病毒感染的研究. 新消化病学杂志,1996;4(特刊5):43-44
8 陈士葆. 慢性丙型肝炎诊断和治疗现状. 新消化病学杂志, 1997;5:725-726
9 姜其河, 崔斯让. 丙型肝炎病毒在献血者中的交叉感染. 华人消化杂志, 1998;6(特刊7):366
10 魏来, 陶其敏. 酒精性肝病与丙型肝炎病毒感染. 华人消化杂志,1998;6:539-541
11 颜学兵, 吴文漪, 魏来. 不同基因型丙型肝炎病毒感染临床研究. 华人消化杂志, 1998;6:653-655
12 周永兴, 冯志华, 贾战生, 连建奇, 李谨革, 李文波. 丙型肝炎病毒核心基因免疫研究. 华人消化杂志, 1998;6:966-968
13 杜竞辉, 查文章. 丙型肝炎与原发性肝癌关系研究现状. 世界华人消化杂志, 1999;7:176
14 吴海滨, 李智伟, 李颖. 外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正负链检测的临床意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:220-221
15 赵西平, 沈汉馨, 田德英, 张东绅, 彭志海, 杨东亮, 郝连杰. 丙型肝炎肝组织中HCV RNA和HCV NS5抗原表达及意义.
世界华人消化杂志, 1999;7:516-518
16 李江, 陈颜芳, 王文亮, 林曙光. 丙型肝炎病毒核心抗原转位表达抑制肝(癌)细胞凋亡. 世界华人消化杂志, 1999;7:579-582
17 王平忠, 周永兴. 西安地区丙型肝炎病毒基因分型研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:757-759
18 郭晏海, 闫小君, 侯瑜, 任峰玲, 赵锦荣, 崔大祥, 韩锋产, 段杰, 李陕区, 苏成芝. 用分级定量RT-PCR测定中国人血清中HCV RNA.
世界华人消化杂志, 1999;7:810-811
19 曹治宸, 孔丽, 甄真, 张进贵. 慢性丙型肝炎患者病毒血清抗体的分型. 世界华人消化杂志, 1999;7:825-826
20 刘欣, 王东升, 张庶民, 熊诗松, 汲振余, 祁自柏, 王佑春, 买凯. 河南省丙型肝炎病毒基因的分型. 世界华人消化杂志，2000;8:922-923
21 张王海, 朱世能, 陆世伦, 丛文铭, 苏英豪, 吴孟超. 肝细胞癌中丙型肝炎病毒的原位检测. 世界华人消化杂志，2000;8(特刊8):90
22 He YW, Liu W, Zen LL, Xiong KJ, Luo DD. Effect of interferon in combination with ribavirin on the plus and minus strands of HCV
RNA in patients with chronic hepatitis C. China Natl J New Gastroenterol, 1996;2:179-181
23 Maier KP. Iron, HCV and the liver. China Natl J New Gastroenterol,1997;3:61-63
24 Gao JE, Tao QM, Guo JP, Ji HP, Lang ZW, Ji Y, Feng BF. Preparation and application of monoclonal antibodies against hepatitis C
virus nonstructural proteins. China Natl J New Gastroenterol,1997;3:114-116
25 Zhu FL, Lu HY, Li Z, Qi ZT. Cloning and expression of NS3 cDNA fragment of HCV genome of Hebei isolate in E. coli.
World J Gastroenterol, 1998;4:165-168
26 Zhang SZ, Liang JJ, Qi ZT, Hu YP. Cloning of the non-structural gene 3 of hepatitis C virus and its inducible expression in
cultured cells. World J Gastroenterol, 1999;5:125-127
27 Huang F, Zhao GZ, Li Y. HCV genotypes in hepatitis C patients and their clinical significances. World J Gastroenterol,1999;5:547-549
28 Dai YM, Shou ZP, Ni CR, Wang NJ, Zhang SP. Localization of HCV RNA and capsid protein in human hepatocellular carcinoma.
World J Gastroenterol, 2000;6:136-137
29 Jiang RL, Lu QS, Luo KX. Cloning and expression of core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus in cosmid pTM3.
World J Gastroenterol, 2000;6:220-222
30 Caselmann WH, Serwe M, Lehmann T, Ludwig J, Sproat BS, Engels JW. Design, delivery and efficacy testing of therapeutic
nucleic acids used to inhibit hepatitis C virus gene expression in vitro and in vivo. World J Gastroenterol,2000;6:626-629
31 Di Bisceglie AM. Hepatitis C and hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1997;26(3 Suppl 1):34s-38s
32 吴在川，张习坦，赵秋敏. 在大肠杆菌中以非融合蛋白形式高效表达丙型肝炎核心蛋白. 军事医学科学院院刊，1994;18:7-10
33 李伍举，吴加金. pBV220载体中外源基因表达水平定量分析. 病毒学报，1997;13:126-133
34 Tsukiyama-Kohara K, Yamaguchi K, Maki N, Ohta Y, Miki K, Mizokami M, Ohba K, Tanaka S, Hattori N, Nomoto A. Antigenicities
of group Ⅰ and Ⅱ hepatitis C virus polypeptides—molecular basis of diagnosis. Virology, 1993; 192:430-437, http://www.100md.com(李 华 潘承恩 陈武科 王全颍 杨广笑)
项目负责人 李华 西安交通大学第一医院肝胆外科 陕西省西安市 710061Tel. 0086-29-5252981 Ext.2419
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收稿日期 2000-07-19 接受日期 2000-07-21
主题词 丙型肝炎病毒；病毒核心蛋白；基因表达；大肠杆菌；聚合酶链反应；抗原，病毒；酶连接免疫吸附测定
李华, 潘承恩, 陈武科, 王全颍, 杨广笑. 丙型肝炎病毒核心区基因在大肠杆菌中的高效表达. 世界华人消化杂志，2001；9(2)：221-223
丙型肝炎病毒(HCV)是输血后及散发性非甲非乙型肝炎的主要病原，丙型肝炎易转为慢性肝炎，与肝癌及肝硬变关系密切[1]. HCV核心区编码蛋白是研究重点之一. 在研究过程中，首先应获得大量高效表达的HCV核心蛋白抗原. HCV基因组结构与黄病毒或瘟病毒相似，为长约9.4kb的单股正链RNA，含一个开放读码框架(open reading frame, OFR) ，编码含3010～3011个氨基酸残基的多蛋白前体，经宿主和病毒蛋白酶作用加工成结构蛋白(C, E1和E2/NS1) 和非结构蛋白(NS2, NS3, NS4和NS5)[2]. 核心蛋白约含191个氨基酸，大小约19000～22000，其氨基酸序列十分保守，比较已有的HCV各分离株氨基酸序列，同源性超过95%. 其N端三个亲水区的优势抗原表位主要是线性抗原决定簇，在此免疫优势区内出现的变异对免疫识别并没有很大影响. 由于人感染HCV后，血清中HCV核心蛋白抗体出现较早，因此以完整的核心蛋白抗原作为包被抗原对HCV感染诊断具有足够的早期性和可靠性. 为了进一步研究HCV核心蛋白的特性并在病毒诊断中发挥作用，我们以非融合蛋白的方式，在大肠杆菌中高效表达了完整的HCV核心蛋白.
1 材料和方法
1.1 材料 表达质粒为pBV220，该质粒由中国预防医学科学院病毒所构建，为可以非融合蛋白形式表达外源基因的高效表达载体；含HCV1a全部结构基因和非结构基因组cDNA序列的重组质粒；受体菌为大肠杆菌DH5α，测序质粒为pUC19，以上均由西安华广生物工程公司提供. Taq DNA合成酶、T4DNA连接酶、dNTP等为Promega公司产品，限制性内切酶EcoRⅠ，BamHⅠ，辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG(IgG-HRP)等为华美公司产品. PCR引物设计及合成根据已发表的HCV1a型cDNA序列[3]，应用计算机DNA分析软件DNASIS辅助设计引物. 引物由北京赛百盛生物公司合成，高压液相纯化. 在正向引物(F)及反向引物(R)5＇端分别加入EcoRⅠ和BamHⅠ识别位点，同时在反向引物中加入终止密码TCA. 设计如下：F：5＇-GCGAATTCCATGAGCACGAATCCTA-3＇EcoRⅠ识别位点
R：5＇-GCGGATCCTCACACTTGGTAGGCCGAAG-3＇BamHⅠ识别位点
1.2 方法
1.2.1 PCR产物的扩增及序列分析 以含HCV1a全部结构和非结构基因组cDNA序列的重组质粒为模板，常规PCR法扩增核心区基因片段：94℃变性60s，40℃退火60s，72℃延伸90s，共30循环后，72℃延伸9min. 将PCR扩增产物经酶切鉴定后用琼脂糖电泳电洗脱，回收所需片段，克隆于pUC19中(pUC19-HCVcore). 采用Sanger双脱氧链末端终止法在373ADNA全自动测定仪(Applied Biosystem)上进行双向测序，测序结果应用DNASIS软件与Gene Bank中已知序列进行比较分析.
1.2.2 重组质粒构建及鉴定 从pUC19-HCVcore中切取目的基因片段，克隆于pBV220中构建重组质粒pBV-HCVcore，并酶切鉴定. 质粒提取、纯化、酶切、连接及克隆筛选均按常规方法进行. 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE电泳. 将含HCVcore基因重组质粒的细菌，在32℃振摇培养至对数期，42℃诱导表达8h. 离心收菌体，重悬后冻融数次，超声破碎，收集上清及沉淀. 沉淀经尿素变性、透析复性(初步纯化抗原). 以上样品分别加入加样缓冲液，100℃煮沸3min，用150g·L-1 SDS-PAGE进行电泳分离，考马斯亮蓝染色. 阴性对照为pBV220转化细菌的全菌裂解液. HCV核心蛋白活性初步测定. 应用间接ELISA法，分别用上述上清粗提液及初步纯化抗原检测已知HCV抗体阳性血清及阴性血清各6份，加入鼠抗人IgG-HRP，3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)使酶底物显色，450nm波长测定吸光度A值(即OD值). 再以抗体强阳性血清测定不同稀释度抗原，以确定其效价. HCV抗体阳性及阴性血清均由西安华广公司保存提供.
2 结果
2.1 PCR产物酶切鉴定 PCR扩增获得DNA片段约0.6kb，与理论预计的HCV core基因片段大小一致，经EcoRⅠ, BamHⅠ酶切后电泳也符合HCV core基因酶切谱(图1). 扩增产物序列的测序结果与Gene Bank已知HCV1a cDNA序列(No. M62321)比较：共585个碱基(起始密码ATG～终止密码TGA)，第84位碱基由C→T，氨基酸序列由 GGC→GGT，均编码Gly, 其余均一致. 碱基符合率99%，氨基酸符合率100%，从而确定该片段含HCVcore全基因组. 结果如下：
1 ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AAA AAA AAC AAA CGT AAC ACC AAC 48
49 CGT CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGT GGC GGTCAG ATC GTT GGT96
97 GGA GTT TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC CCT AGA TTG GGT GTG CGC GCG144
145 ACG AGA AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGA GGT AGA CGT CAG CCT192
193 ATC CCC AAG GCT CGT CGG CCC GAG GGC AGG ACC TGG GCT CAG CCC GGG240
241 TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC TGC GGG TGG GCG GGA TGG288
289 CTC CTG TCT CCC CGT GGC TCT CGG CCT AGC TGG GGC CCC ACA GAC CCC336
337 CGG CGT AGG TCG CGC AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACG TGC384
385 GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATA CCG CTC GTC GGC GCC CCT CTT432
433 GGA GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAA GAC480
481 GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAC CTT CCT GGT TGC TCT TTC TCT ATC528
529 TTC CTT CTG GCC CTG CTC TCT TGC TTG ACT GTG CCC GCT TCG GCC TAC576
577 CAA GTG TGA 585
2.2 表达质粒的构建 将pUC19-HCVcore经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切，回收HCVcore基因片段，与pBV220经EcoRⅠ，BamHⅠ酶切的回收片段用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选出表达质粒pBV-HCVcore，酶切鉴定证实(图2). 含pBV-HCVcore的大肠杆菌DH5α在42℃条件下诱导表达，表达产物行150g·L-1 SDS-PAGE胶电泳. 可见全菌裂解液及复性后上清中，于Mr21000处有一特异表达蛋白带出现(图3)，与HCV核心蛋白理论值大小一致. 激光薄层扫描显示该蛋白表达量占细菌总蛋白量14%
左右.
2.3 HCV核心蛋白活性初步鉴定 以破菌后上清及复性后上清分别检测各6例HCV阳性(1～6号)及阴性血清(7～12号)，结果见表1. 可见表达产物具有HCV抗原活性，且主要存在于复性后上清中. 用不同稀释度复性上清包板，结果见表2，其效价可达1∶1600.
表1 表达产物中HCV核心蛋白抗原活性(A450nm)
| 血清号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 破菌后上清 | 0.01 | 0.05 | 0.01 | 0.02 | 0.05 | 0.01 | 0.01 | 0.02 | 0.04 | 0.05 | 0.01 | 0.02 |
| 复性后上清 | 1.20 | 1.09 | 1.12 | 0.98 | 0.80 | 1.10 | 0.02 | 0.04 | 0.05 | 0.10 | 0.01 | 0.03 |
表2 复性后上清HCV核心蛋白抗原效价(A450nm)
| 稀释度 | 1∶100 | 1∶200 | 1∶400 | 1∶800 | 1∶1600 |
| A值 | 1.50 | 1.45 | 0.94 | 0.51 | 0.25 |
另：阴性对照中1∶100稀释血清A值为0.02.
图1 PCR产物的酶切鉴定.A：PCR产物经EcoRⅠ, BamHⅠ酶切; B：PCR marker
图2 pBV220-HCV core表达质粒的构建.
图3 HCVcore表达蛋白的SDS-PAGE分析.A：含pBV220的大肠杆菌全菌裂解液(阴性对照)；B：含pBV-HCVcore的大肠杆菌全菌裂解液；C：复性后上清；D：标准分子质量蛋白
3 讨论
对HCV的研究已经引起越来越多学者的重视[4-30]，目前认为HCV核心区高度保守，其编码的核心蛋白含有多个抗原表位，是HCV感染血清诊断的重要工具. 近年来的研究表明该蛋白可能具有直接致癌性[31]，进一步研究则显得尤为重要. 目前公认的HCV核心蛋白为191个氨基酸，与以往文献[32]不同，我们将下游引物选在C区和E1区交界处，以保证核心区基因的完整，引入的终止子可防止强转录启动子引起的通读现象. pBV220载体是我国科学家自己组建的原核高效表达载体，能够较好地表达外源基因[33]，以非融合蛋白形式表达的HCV核心蛋白在结构、功能及抗原性等方面更接近自然. 在SDS-PAGE电泳中显示的特异性表达产物为Mr21000左右，与理论值预计大小一致，用初步纯化的表达抗原建立ELISA，表明其具有较高的抗原活性. 核心蛋白含有能诱导机体产生体液免疫的CTL特异性抗原决定族，且核心区抗原为HCV非特异性抗原[34]，因此在诊断HCV感染中具有良好的应用前景. 实验结果同时显示此蛋白主要存在于复性后上清中，表明在本表达系统中该蛋白水溶性较差，大部分以包含体形式存在，可能与该蛋白中二硫键过多或异常折叠有关.
总之，这种以非融合蛋白形式高效表达的完整HCV核心蛋白，具有较高生物活性，为更加深入研究HCV核心蛋白的致病机制及生物学性状提供了可能.
4 参考文献
1 Bradley DW. Hepatitis viruses: their role in human cancer. Proc Assoc Am Physicians, 1999;111:588-593
2 Selby MJ, Choo QL, Berger K, Kuo G, Glazer E, Eckart M, Lee C, Chien D, Kuo C, Houghton M. Expression, identification
and subcellular localization of the proteins encoded by the hepatitis C viral genome. J Gen Virol, 1993;74(Pt 6):1103-1113
3 Choo QL, Richman KH, Han JH, Berger K, Lee C, Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby R, Barr PJ. Genetic organization and
diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88:2451-2455
4 张树林, 蔺淑梅, 李义方. 慢性丙型肝炎的诊疗现状. 新消化病学杂志, 1996;4:397-398
5 蔺淑梅, 张树林, 狄鹏超, 梁雪松. 重组免疫印迹试验在急性丙型肝炎诊断中的意义. 新消化病学杂志, 1996;4:511-512
6 于建国, 张光曙, 杨德利, 周秀梅, 陈崇兴. 慢性丙型肝炎病理学的探讨. 新消化病学杂志, 1996;4(特刊5):41-42
7 赵悦友, 杨洪业, 刘桂仙, 李子庆, 刘路, 何玲俐, 邓卫警. 原发性肝癌患者丙型肝炎病毒感染的研究. 新消化病学杂志,1996;4(特刊5):43-44
8 陈士葆. 慢性丙型肝炎诊断和治疗现状. 新消化病学杂志, 1997;5:725-726
9 姜其河, 崔斯让. 丙型肝炎病毒在献血者中的交叉感染. 华人消化杂志, 1998;6(特刊7):366
10 魏来, 陶其敏. 酒精性肝病与丙型肝炎病毒感染. 华人消化杂志,1998;6:539-541
11 颜学兵, 吴文漪, 魏来. 不同基因型丙型肝炎病毒感染临床研究. 华人消化杂志, 1998;6:653-655
12 周永兴, 冯志华, 贾战生, 连建奇, 李谨革, 李文波. 丙型肝炎病毒核心基因免疫研究. 华人消化杂志, 1998;6:966-968
13 杜竞辉, 查文章. 丙型肝炎与原发性肝癌关系研究现状. 世界华人消化杂志, 1999;7:176
14 吴海滨, 李智伟, 李颖. 外周血单核细胞中丙型肝炎病毒RNA正负链检测的临床意义. 世界华人消化杂志, 1999;7:220-221
15 赵西平, 沈汉馨, 田德英, 张东绅, 彭志海, 杨东亮, 郝连杰. 丙型肝炎肝组织中HCV RNA和HCV NS5抗原表达及意义.
世界华人消化杂志, 1999;7:516-518
16 李江, 陈颜芳, 王文亮, 林曙光. 丙型肝炎病毒核心抗原转位表达抑制肝(癌)细胞凋亡. 世界华人消化杂志, 1999;7:579-582
17 王平忠, 周永兴. 西安地区丙型肝炎病毒基因分型研究. 世界华人消化杂志, 1999;7:757-759
18 郭晏海, 闫小君, 侯瑜, 任峰玲, 赵锦荣, 崔大祥, 韩锋产, 段杰, 李陕区, 苏成芝. 用分级定量RT-PCR测定中国人血清中HCV RNA.
世界华人消化杂志, 1999;7:810-811
19 曹治宸, 孔丽, 甄真, 张进贵. 慢性丙型肝炎患者病毒血清抗体的分型. 世界华人消化杂志, 1999;7:825-826
20 刘欣, 王东升, 张庶民, 熊诗松, 汲振余, 祁自柏, 王佑春, 买凯. 河南省丙型肝炎病毒基因的分型. 世界华人消化杂志，2000;8:922-923
21 张王海, 朱世能, 陆世伦, 丛文铭, 苏英豪, 吴孟超. 肝细胞癌中丙型肝炎病毒的原位检测. 世界华人消化杂志，2000;8(特刊8):90
22 He YW, Liu W, Zen LL, Xiong KJ, Luo DD. Effect of interferon in combination with ribavirin on the plus and minus strands of HCV
RNA in patients with chronic hepatitis C. China Natl J New Gastroenterol, 1996;2:179-181
23 Maier KP. Iron, HCV and the liver. China Natl J New Gastroenterol,1997;3:61-63
24 Gao JE, Tao QM, Guo JP, Ji HP, Lang ZW, Ji Y, Feng BF. Preparation and application of monoclonal antibodies against hepatitis C
virus nonstructural proteins. China Natl J New Gastroenterol,1997;3:114-116
25 Zhu FL, Lu HY, Li Z, Qi ZT. Cloning and expression of NS3 cDNA fragment of HCV genome of Hebei isolate in E. coli.
World J Gastroenterol, 1998;4:165-168
26 Zhang SZ, Liang JJ, Qi ZT, Hu YP. Cloning of the non-structural gene 3 of hepatitis C virus and its inducible expression in
cultured cells. World J Gastroenterol, 1999;5:125-127
27 Huang F, Zhao GZ, Li Y. HCV genotypes in hepatitis C patients and their clinical significances. World J Gastroenterol,1999;5:547-549
28 Dai YM, Shou ZP, Ni CR, Wang NJ, Zhang SP. Localization of HCV RNA and capsid protein in human hepatocellular carcinoma.
World J Gastroenterol, 2000;6:136-137
29 Jiang RL, Lu QS, Luo KX. Cloning and expression of core gene cDNA of Chinese hepatitis C virus in cosmid pTM3.
World J Gastroenterol, 2000;6:220-222
30 Caselmann WH, Serwe M, Lehmann T, Ludwig J, Sproat BS, Engels JW. Design, delivery and efficacy testing of therapeutic
nucleic acids used to inhibit hepatitis C virus gene expression in vitro and in vivo. World J Gastroenterol,2000;6:626-629
31 Di Bisceglie AM. Hepatitis C and hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1997;26(3 Suppl 1):34s-38s
32 吴在川，张习坦，赵秋敏. 在大肠杆菌中以非融合蛋白形式高效表达丙型肝炎核心蛋白. 军事医学科学院院刊，1994;18:7-10
33 李伍举，吴加金. pBV220载体中外源基因表达水平定量分析. 病毒学报，1997;13:126-133
34 Tsukiyama-Kohara K, Yamaguchi K, Maki N, Ohta Y, Miki K, Mizokami M, Ohba K, Tanaka S, Hattori N, Nomoto A. Antigenicities
of group Ⅰ and Ⅱ hepatitis C virus polypeptides—molecular basis of diagnosis. Virology, 1993; 192:430-437, http://www.100md.com(李 华 潘承恩 陈武科 王全颍 杨广笑)