大肠癌细胞增殖活性和细胞免疫水平与淋巴结转移规律的研究
山东大学齐鲁医院普通外科山东省济南市250012
项目负责人 吕仁荣山东大学齐鲁医院普通外科山东省济南市250012
收稿日期2001-01-12接受日期2001-02-02
主题词 结肠直肠肿瘤/病理学；结肠直肠肿瘤/免疫学；淋巴转移；免疫，细胞；T细胞亚群；杀伤细胞，天然
吕仁荣, 寿楠海, 姜希宏. 大肠癌细胞增殖活性和细胞免疫水平与淋巴结转移规律的研究. 世界华人消化杂志，2001；9(4)：455-456
本文通过研究大肠癌细胞增殖活性和细胞免疫与淋巴结转移规律之间的关系，来了解大肠癌的发生发展与机体细胞免疫的关系，从而为大肠癌患者的病情估计手术方式的选择和预后提供必要的依据.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 我院1998-06/1999-06 30例大肠癌患者，男17例，女13例，年龄27岁～72岁，平均为56岁， 均经病理学证实. 其中直肠癌13例，结肠癌17例. 切除标本除做流式细胞术检查外并做系统病理学检查. 按我国改良杭州会议[1978]大肠癌TNM分期中的局部淋巴结转移状况进行分站，其中N0为无淋巴结转移，N1为肠周淋巴结转移，N2为系膜淋巴结转移，N3为系膜根部淋巴结转移. 按转移个数分为无转移组(0个)，少数转移组(1～3个)，多数转移组(3个以上). 另有30例健康献血员做免疫功能正常对照组.
1.2 方法
1.2.1 血T细胞亚群和NK细胞测定取术前患者外周静脉血3mL，加入0.3mL肝素的试管中混匀，用改良APAAP法对检测(抗CD3，CD4，CD8及NK mAb及桥联酶标试剂盒由军事医学科学院提供).
, 百拇医药
1.2.2 流式细胞术检测 癌组织取自癌中心且无坏死组织，用生理盐水冲洗干净后以备检测用. 将肿瘤组织剪至匀浆状，加入生理盐水，低速离心两次，去除细胞碎片，用200目尼龙网过滤，700mL·L-1冰乙醇固定，放入冰箱中备检，将固定剂去之，用PBS洗涤两次，取1.0mL单细胞悬液(内含100万细胞)加入PI染色液1.0mL，染色30min后即可上机分析. 以S期细胞比率(Sphase fraction, SPF)和增殖指数(Proliferative index, PI)表示细胞增殖活性.
统计学处理计量资料用x±s表示. 多样本均数比较用方差分析，细胞免疫和增殖活性间用单因素直线相关分析，用Excel 97统计软件分析. P<0.05代表显著性差异.
2 结果
, 百拇医药
本组30例患者均为大肠腺癌，按淋巴结转移个数可分为无转移组13例，少数转移组8例，多数转移组9例，按淋巴结转移距离可分为无转移组(N0)13例，N1，N2，N3站转移者7例，10例，0例. 患者术前细胞免疫水平见表1.
表1 术前大肠腺癌患者细胞免疫水平
, http://www.100md.com
aP<0.05， bP<0.01， vs 健康对照组.
2.1 淋巴结转移个数与增殖活性和术前细胞免疫水平的研究表明，SPF，PI按转移个数进行方差分析，证明多数转移组高于少数转移组、少数转移组高于无转移组，CD4/CD8. NK细胞数按转移个数进行方差分析，P>0.05，无显著性差异(表2).
表2 淋巴结转移个数与SPF，PI和CD4/CD8，NK细胞水平的关系
, 百拇医药
2.2 淋巴结转移距离与增殖活性和术前细胞免疫水平的关系 按转移距离进行方差分析，N2站较N1站. N1站较N0站SPF明显升高，而CD4/CD8，NK细胞数按转移距离进行方差分析，P>0.05，与淋巴结转移距离无关(表3).
表3 淋巴结转移距离与SPF，PI和CD4/CD8，NK细胞水平的关系
, 百拇医药
2.3 大肠癌患者肿瘤细胞增殖活性与细胞免疫水平之间的相关性 经单因素直线相关分析，两者之间无直线相关.
3 讨论
近年来研究认为癌症发生的一个重要原因是细胞周期失控，细胞增殖的本质为染色体复制，因而应用流式细胞术计算细胞周期个时相的比率，从而在核酸代谢分子水平揭示癌细胞的增殖力学规律，了解其生物学性质，越来越受到人们的重视[1]. 本组资料证明多数转移组较少数转移组、少数转移组较无转移组SPF和PI明显升高，这与文献报道一致[2]. Tubiana et al[3]报道具有高度增殖活性的肿瘤具有基因的不稳定性因而更具有转移倾向. Bauer et al[4]首次证明了增殖活性(通常以SPF和PI表示)在预后中的重要意义，他指出SPF高于20%是一个预后不良的重要指标，增殖活性比DNA倍体类型对判断预后更有意义. Schutte et al[5]认为SPF升高与生存率成反相关，SPF可以作为判断预后的独立指标. 本研究证明了淋巴结N2站转移者较N1站转移者以及N1站转移者较N0站转移者SPF和PI明显升高，这就揭示随着肿瘤增殖活性的增高，肿瘤不仅易发生转移，而且转移距离更远，转移范围更广. 由此可以提示肿瘤恶性程度较高，预后不良.
, 百拇医药
现代肿瘤研究表明宿主的抗肿瘤免疫主要表现在细胞免疫方面，其中T细胞亚群和NK细胞在肿瘤的免疫监视中起了重要的作用，故对两者进行平行测定，能有效的反映机体的免疫状态和水平[6]. 本研究用单克隆抗体技术测定T细胞亚群和NK细胞，发现CD3，CD4，CD4/CD8和NK细胞数明显下降，CD8明显上升，这与文献报道一致[7]. 业已证实，机体以T细胞为中心的细胞免疫状态直接影响肿瘤的发生发展和预后[8]. 本研究通过测定大肠癌淋巴结转移组与非转移组CD4/CD8，NK细胞数未见差异，这与文献报道相一致[9].
, 百拇医药 目前未见大肠癌细胞增殖活性与机体细胞免疫水平之间关系的报道. 虽然大量资料表明增殖活性较高的肿瘤患者预后较差[4,5]，并且细胞免疫功能较差的患者预后较差[8]，但两者之间经单因素直线相关分析，未见明显相关.
4 参考文献
1 周丁华. 肿瘤增殖力学研究的方法学. 国外医学肿瘤学分册，1995；22：136-137
2 Pinto AE, Chaves P, Fidalgo P, Oliveira AG, Leito CN, Soares J. Flow cytometric DNA ploidy and S-phase fraction correlate
, http://www.100md.com
with histopathologic indicators of tumor behavior in colorectal carcinoma. Dis Colon Rectum, 1997;40:411-419
3 Tubiana M, Courdi A. Cell proliferation kinetics in human solid tumors: relation to probability of metastatic dissemination and
long-term survival. Radiother Oncol, 1989;15:1-18
4 Bauer KD, Lincoln ST, Vera-Roman JM, Wallemark CB, Chmiel JS, Madurski ML, Murad T, Scarpelli DG. Prognostic implications
, http://www.100md.com
of proliferative activity and DNA aneuploidy in colonic adenocarcinomas. Lab Invest, 1987;57:329-333
5 Schutte B, Reynders MMJ, Wiggers T, Arends JW, Volovics L, Bosman FT, Blijham GH. Retrospective analysis of the
prognostic significance of DNA content and proliferative activity in large bowel carcinoma. Cancer Res, 1987;47:5494-5496
6 刘剑仑，秦伟新，韦长元，谢裕安. 大肠癌病人手术前后细胞免疫功能的动态研究. 中华实验外科杂志，1995；12：71-72
, 百拇医药
7 Wang YX, Ruan CP, Li L, Shi JH, Kong XT. Clinical significance of changes of perioperative T cell and expression of its activated
antigen in colorectal cancer patients. World J Gastroenterol, 1999;5:181-182
8 Lotze MT, Finn OJ. Recent advances in cellular immunology: implications for immunity to cancer. Immunol Today, 1990;11:190-193
9 Ferrara A, McMillen MM, Ballantyne GH. T cell subpopulations and colorectal cancer. Dis Colon Rectum, 1990;33:367-369, http://www.100md.com(吕仁荣 寿楠海 姜希宏)
项目负责人 吕仁荣山东大学齐鲁医院普通外科山东省济南市250012
收稿日期2001-01-12接受日期2001-02-02
主题词 结肠直肠肿瘤/病理学；结肠直肠肿瘤/免疫学；淋巴转移；免疫，细胞；T细胞亚群；杀伤细胞，天然
吕仁荣, 寿楠海, 姜希宏. 大肠癌细胞增殖活性和细胞免疫水平与淋巴结转移规律的研究. 世界华人消化杂志，2001；9(4)：455-456
本文通过研究大肠癌细胞增殖活性和细胞免疫与淋巴结转移规律之间的关系，来了解大肠癌的发生发展与机体细胞免疫的关系，从而为大肠癌患者的病情估计手术方式的选择和预后提供必要的依据.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 我院1998-06/1999-06 30例大肠癌患者，男17例，女13例，年龄27岁～72岁，平均为56岁， 均经病理学证实. 其中直肠癌13例，结肠癌17例. 切除标本除做流式细胞术检查外并做系统病理学检查. 按我国改良杭州会议[1978]大肠癌TNM分期中的局部淋巴结转移状况进行分站，其中N0为无淋巴结转移，N1为肠周淋巴结转移，N2为系膜淋巴结转移，N3为系膜根部淋巴结转移. 按转移个数分为无转移组(0个)，少数转移组(1～3个)，多数转移组(3个以上). 另有30例健康献血员做免疫功能正常对照组.
1.2 方法
1.2.1 血T细胞亚群和NK细胞测定取术前患者外周静脉血3mL，加入0.3mL肝素的试管中混匀，用改良APAAP法对检测(抗CD3，CD4，CD8及NK mAb及桥联酶标试剂盒由军事医学科学院提供).
, 百拇医药
1.2.2 流式细胞术检测 癌组织取自癌中心且无坏死组织，用生理盐水冲洗干净后以备检测用. 将肿瘤组织剪至匀浆状，加入生理盐水，低速离心两次，去除细胞碎片，用200目尼龙网过滤，700mL·L-1冰乙醇固定，放入冰箱中备检，将固定剂去之，用PBS洗涤两次，取1.0mL单细胞悬液(内含100万细胞)加入PI染色液1.0mL，染色30min后即可上机分析. 以S期细胞比率(Sphase fraction, SPF)和增殖指数(Proliferative index, PI)表示细胞增殖活性.
统计学处理计量资料用x±s表示. 多样本均数比较用方差分析，细胞免疫和增殖活性间用单因素直线相关分析，用Excel 97统计软件分析. P<0.05代表显著性差异.
2 结果
, 百拇医药
本组30例患者均为大肠腺癌，按淋巴结转移个数可分为无转移组13例，少数转移组8例，多数转移组9例，按淋巴结转移距离可分为无转移组(N0)13例，N1，N2，N3站转移者7例，10例，0例. 患者术前细胞免疫水平见表1.
表1 术前大肠腺癌患者细胞免疫水平
| 健康组 | 大肠癌患者术前免疫水平 | |
| CD3 | 0.66±0.08 | 0.61±0.07a |
| CD4 | 0.43±0.08 | 0.34±0.08b |
| CD8 | 0.25±0.06 | 0.31±0.08b |
| CD4/CD8 | 1.73±0.85 | 1.09±0.32b |
| NK | 0.09±0.06 | 0.07±0.04b |
, http://www.100md.com
aP<0.05， bP<0.01， vs 健康对照组.
2.1 淋巴结转移个数与增殖活性和术前细胞免疫水平的研究表明，SPF，PI按转移个数进行方差分析，证明多数转移组高于少数转移组、少数转移组高于无转移组，CD4/CD8. NK细胞数按转移个数进行方差分析，P>0.05，无显著性差异(表2).
表2 淋巴结转移个数与SPF，PI和CD4/CD8，NK细胞水平的关系
| 项目 | 淋巴结转移个数(个) | ||
| 0(n=13) | 1～3(n=8) | 3个以上(n=9) | |
| SPF | 0.12±0.03 | 0.20±0.03 | 0.27±0.03 |
| PI | 0.22±0.04 | 0.30±0.02 | 0.37±0.05 |
| CD4/CD8 | 1.10±0.33 | 1.09±0.23 | 1.09±0.39 |
| NK | 0.07±0.03 | 0.07±0.03 | 0.07±0.04 |
, 百拇医药
2.2 淋巴结转移距离与增殖活性和术前细胞免疫水平的关系 按转移距离进行方差分析，N2站较N1站. N1站较N0站SPF明显升高，而CD4/CD8，NK细胞数按转移距离进行方差分析，P>0.05，与淋巴结转移距离无关(表3).
表3 淋巴结转移距离与SPF，PI和CD4/CD8，NK细胞水平的关系
| 项目 | 淋巴结转移距离 | ||
| N0(n=13) | N1(n=8) | N2(n=9) | |
| SPF | 0.12±0.03 | 0.20±0.03 | 0.26±0.04 |
| PI | 0.22±0.04 | 0.31±0.02 | 0.37±0.05 |
| CD4/CD8 | 1.10±0.33 | 1.09±0.25 | 1.09±0.36 |
| NK | 0.07±0.03 | 0.07±0.03 | 0.07±0.04 |
, 百拇医药
2.3 大肠癌患者肿瘤细胞增殖活性与细胞免疫水平之间的相关性 经单因素直线相关分析，两者之间无直线相关.
3 讨论
近年来研究认为癌症发生的一个重要原因是细胞周期失控，细胞增殖的本质为染色体复制，因而应用流式细胞术计算细胞周期个时相的比率，从而在核酸代谢分子水平揭示癌细胞的增殖力学规律，了解其生物学性质，越来越受到人们的重视[1]. 本组资料证明多数转移组较少数转移组、少数转移组较无转移组SPF和PI明显升高，这与文献报道一致[2]. Tubiana et al[3]报道具有高度增殖活性的肿瘤具有基因的不稳定性因而更具有转移倾向. Bauer et al[4]首次证明了增殖活性(通常以SPF和PI表示)在预后中的重要意义，他指出SPF高于20%是一个预后不良的重要指标，增殖活性比DNA倍体类型对判断预后更有意义. Schutte et al[5]认为SPF升高与生存率成反相关，SPF可以作为判断预后的独立指标. 本研究证明了淋巴结N2站转移者较N1站转移者以及N1站转移者较N0站转移者SPF和PI明显升高，这就揭示随着肿瘤增殖活性的增高，肿瘤不仅易发生转移，而且转移距离更远，转移范围更广. 由此可以提示肿瘤恶性程度较高，预后不良.
, 百拇医药
现代肿瘤研究表明宿主的抗肿瘤免疫主要表现在细胞免疫方面，其中T细胞亚群和NK细胞在肿瘤的免疫监视中起了重要的作用，故对两者进行平行测定，能有效的反映机体的免疫状态和水平[6]. 本研究用单克隆抗体技术测定T细胞亚群和NK细胞，发现CD3，CD4，CD4/CD8和NK细胞数明显下降，CD8明显上升，这与文献报道一致[7]. 业已证实，机体以T细胞为中心的细胞免疫状态直接影响肿瘤的发生发展和预后[8]. 本研究通过测定大肠癌淋巴结转移组与非转移组CD4/CD8，NK细胞数未见差异，这与文献报道相一致[9].
, 百拇医药 目前未见大肠癌细胞增殖活性与机体细胞免疫水平之间关系的报道. 虽然大量资料表明增殖活性较高的肿瘤患者预后较差[4,5]，并且细胞免疫功能较差的患者预后较差[8]，但两者之间经单因素直线相关分析，未见明显相关.
4 参考文献
1 周丁华. 肿瘤增殖力学研究的方法学. 国外医学肿瘤学分册，1995；22：136-137
2 Pinto AE, Chaves P, Fidalgo P, Oliveira AG, Leito CN, Soares J. Flow cytometric DNA ploidy and S-phase fraction correlate
, http://www.100md.com
with histopathologic indicators of tumor behavior in colorectal carcinoma. Dis Colon Rectum, 1997;40:411-419
3 Tubiana M, Courdi A. Cell proliferation kinetics in human solid tumors: relation to probability of metastatic dissemination and
long-term survival. Radiother Oncol, 1989;15:1-18
4 Bauer KD, Lincoln ST, Vera-Roman JM, Wallemark CB, Chmiel JS, Madurski ML, Murad T, Scarpelli DG. Prognostic implications
, http://www.100md.com
of proliferative activity and DNA aneuploidy in colonic adenocarcinomas. Lab Invest, 1987;57:329-333
5 Schutte B, Reynders MMJ, Wiggers T, Arends JW, Volovics L, Bosman FT, Blijham GH. Retrospective analysis of the
prognostic significance of DNA content and proliferative activity in large bowel carcinoma. Cancer Res, 1987;47:5494-5496
6 刘剑仑，秦伟新，韦长元，谢裕安. 大肠癌病人手术前后细胞免疫功能的动态研究. 中华实验外科杂志，1995；12：71-72
, 百拇医药
7 Wang YX, Ruan CP, Li L, Shi JH, Kong XT. Clinical significance of changes of perioperative T cell and expression of its activated
antigen in colorectal cancer patients. World J Gastroenterol, 1999;5:181-182
8 Lotze MT, Finn OJ. Recent advances in cellular immunology: implications for immunity to cancer. Immunol Today, 1990;11:190-193
9 Ferrara A, McMillen MM, Ballantyne GH. T cell subpopulations and colorectal cancer. Dis Colon Rectum, 1990;33:367-369, http://www.100md.com(吕仁荣 寿楠海 姜希宏)