人工肝生物反应器研究进展
向德栋,王英杰,王宇明,中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所 重庆市 400038
国家自然科学基金资助课题,No.39970214
项目负责人:王英杰,400038,重庆市高滩岩正街30号,中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所. wangyj103@263.net
电话:023-68754475-8062 传真:023-68754142
收稿日期:2002-11-20 接受日期:2002-12-02
摘要肝功能衰竭有很高的死亡率，肝脏移植是治疗终末期肝病的较好方法，由于供体器官缺乏，费用高昂，需长期使用免疫抑制剂等原因，仍有较多患者不能进行肝脏移植，探索肝功能衰竭非肝脏移植治疗显得非常必要.生物人工肝是近年来肝功能衰竭治疗的热门课题，而生物人工肝装置及对肝功能衰竭治疗效果最有影响的关键部分是生物反应器，因此，生物反应器已成为人工肝研究的重要课题.
, 百拇医药
向德栋,王英杰,王宇明.人工肝生物反应器研究进展.世界华人消化杂志 2003;11(5):598-600
0 引言目前，肝功能衰竭有很高的死亡率，肝脏移植是治疗终末期肝病的较好方法，由于肝脏移植费用高昂，且供体器官缺乏，需长期使用免疫抑制剂等原因，仍有较多的患者不能进行肝脏移植，探索肝功能衰竭非肝脏移植治疗显得非常必要.肝脏是一个能够再生的器官，且有复杂的生物合成、解毒、代谢功能，人们不断探索生物人工肝治疗肝功能衰竭的研究，为肝功能衰竭的治疗开辟新途径.现将近年来有关研究进行综述.
1 用于生物人工肝装置的细胞来源各种非生物人工肝治疗终末期肝病，均能暂时改善患者的临床症状，但对患者死亡率无明显降低，其主要原因是缺乏肝细胞的生物合成及代谢功能，治疗效果明显下降，鉴于这个原因，人们试图在体外培养肝脏细胞，利用肝脏细胞的生理功能，开始支持治疗肝功能衰竭的实验及临床研究，并取得较好效果.目前常用的细胞主要有以下几类：(1)原代肝细胞.1987年，Matsumuraet al [1]报道分离兔肝细胞，原代培养后用于杂合型生物人工肝装置，治疗1例晚期胆管癌患者获得成功.之后，Mundtet al [2] 分离猪肝细胞用于生物人工肝装置，经支持治疗后，为患者进行肝脏移植创造了条件.目前在实验及临床研究中，应用最广泛的是猪肝细胞，其优点是来源广泛，细胞数量多，又具有合成、代谢及排泌功能.理论上讲，人肝细胞是最为理想的细胞.但伦理道德及人肝细胞来源缺乏，储存运输困难，使其应用受到限制.(2)永生化细胞.1990年代中期，人们将人肝细胞系NH25、HHY41用于人工肝装置治疗肝衰竭，取得了一定治疗效果，但是细胞系不能发挥正常人肝细胞的全部功能，之后，人们又相继应用C8-B、HepZ、OUMS-29、NKNT-3等永生化细胞用于人工肝治疗肝衰竭的研究，同样取得了一定效果，因安全性原因，故应用受限.起源于肿瘤细胞的细胞系如HepG2、C3A、HuH6、JHH2-2等也试图用于肝功能衰竭的实验及临床研究，但该细胞系来源于肿瘤细胞，存在危害人体的因素，故临床应用仍有顾虑.(3)潜能干细胞.干细胞的研究是近年来生命科学的热点.1998年Shamblottet al [3]报道人多潜能细胞是体外研究的无价之宝，经培养后，他保持了细胞的生物学特性，并不断增生.Tosh et al [4]发现胰腺细胞能转化为肝细胞，并建立胰腺细胞系AR42J-B13转化为肝细胞的模型，研究发现转化后的肝细胞具有合成、解毒的功能.Miyazakiet al [5]研究发现骨髓细胞在一定的培养条件下，诱导分化为肝细胞，能表达肝细胞的标志，随着干细胞的不断深入研究，干细胞应用于人工肝的治疗将为时不远.
, 百拇医药
2 原代培养肝细胞表型的稳定性肝脏由多种细胞构成，细胞间及细胞外基质的相互作用是保持肝实质细胞表型稳定的基础.研究表明，将肝实质细胞分离后体外培养，其表型及功能迅速发生改变，肝细胞生物合成及解毒能力下降.因此，人们试图模仿肝脏体内的微环境培养肝细胞，最大限度的发挥其生理功能.Bhatia et al [6]将肝实质细胞与非实质细胞混合培养，保持了肝细胞的表型稳定.其分子机制目前仍不清楚，可能是细胞之间相互作用的信号传导参与其表型的稳定.
3 生物反应器的设计生物人工肝装置及对肝功能衰竭治疗效果最有影响的关键部分是生物反应器.随着工程科学及材料科学的发展，对生物反应器的研究步伐加快，反应器中所用细胞种类的增多及对细胞培养表型稳定性的增加，临床应用生物反应器治疗患者已成为现实.设计合理的生物反应器应具备适当的双向物质转运，以便对生物反应器中的肝脏细胞提供足够的营养，保持细胞活力，排除治疗细胞的产物，根据生物分子量大小，选择半透膜，在患者及生物反应器中进行物质交换；保持细胞活力及功能.目前，肝细胞在生物反应器中培养不能长期保持肝细胞的功能是一大难题，其原因是不能在体外为肝细胞生长提供一个合适的微环境.因此，在设计生物反应器时不但要考虑有效的物质转运，还要考虑细胞生长的微环境及相关的化学促进因子；具有潜在的提高治疗水平.研究指出，要保持人的生命，细胞数量至少是正常人的10-30%，成人至少要150-450g肝细胞，因此，要求生物反应器有一定的培养空间.目前研究及应用的生物反应器主要有以下几种：(1)中空纤维生物反应器：中空纤维反应器有内腔及外腔，常将肝脏细胞黏附于中空纤维的外腔，根据不同来源的细胞选择合适截留分子量的生物膜，避免发生异种细胞产物所引起的免疫反应，但肝脏细胞在生物反应器中分布不均，易造成细胞活力下降.Jasmund et al [7]指出，生物反应器的肝脏细胞有高的氧消耗，他们设计了一种新的可供氧的中空纤维生物反应器，将肝脏细胞种植在中空纤维的外腔，并控制氧及温度，培养递质在中空纤维外腔灌注.发现供氧的中空纤维生物反应器有多种优点，不仅可获得高密度的细胞，而且易掌握.为了验证该生物反应器的效果，在超过3wk的培养中，他们检测了尿素合成、白蛋白合成、糖的消耗、氧的水平及pH值等，结论提示该生物反应器生物化学作用稳定，能保持细胞活力.Mazariegos et al [8]用中空纤维反应器培养70-100g猪肝细胞，用于一位暴发性肝功能衰竭的患者的治疗.结果表明生物反应器安全.目前，该生物反应器在美国进行I、II期的安全评估.Custer et al [9]研究中空纤维生物反应器对培养细胞的影响，指出在50ml/L二氧化碳及氮平衡条件下，氧合器的氧在20-70%的范围内变动，氧消耗率及细胞功能稳定，没有观察到氧中毒的征象.在另外的实验研究中，观察到随细胞数量增加，氧消耗量也随之增加.但Flendrig etal [10]在鼠动物实验中，造成鼠肝缺血致肝功能衰竭，肝细胞培养在无生物膜的中空纤维生物反应器中直接用血或血浆灌注，结果与对照组比较，鼠的生存状态明显改善，生命全部延长.目前，中空纤维生物反应器应用广泛，其最大优势是表面积与体积之比大，便于代谢物的转运，且能保持有最小的死腔.(2)平板单层生物反应器：平板单层生物反应器是将细胞种植在平板上培养，其优点是细胞分布均匀，微环境一致，但表面积与体积之比下降.Shito et al [11]设计了一种带有内膜氧合器的微管道平板单层生物反应器，将猪肝细胞培养在反应器中，观察肝细胞在体外灌注及动物实验中的生物合成功能.结果表明，体外灌注4d，肝细胞的蛋白合成稳定.体内实验用鼠作动物模型，24h在鼠血浆中检测猪白蛋白，发现这种生物反应器作为肝支持系统很有潜力，可望更进一步研究.Tilles et al [12]比较带有内膜氧合器及不带内膜氧合器的平板单层生物反应器，结果是带有氧合器的生物反应器能使肝细胞稳定，生物合成功能加强，而不带内膜氧合器者与之相反.他指出在临床应用的生物反应器的设计应考虑到相关的问题，以便提高治疗效果.(3)灌注床或支架生物反应器：该生物反应器是将肝细胞种植在灌注床或支架上，其优点是与细胞直接接触，增加了物质的转运，也促进三维结构的形成，同时也容易扩大细胞容量，其缺点是灌注不均一，易堵塞.Kawada et al [13]根据灌注床或支架生物反应器的设计原理，将肝细胞装入多孔的玻璃球微载体内，利用培养液从外周向中心产生一个营养及氧气的梯度，形成高密度的细胞且具有高度活力，三维结构的细胞呈球形，类似于体内肝细胞分布的过程，球形细胞间保持紧密的接触，培养液在细胞空间自由的流动.结果提示这种反应器能提供一个较好的三维细胞培养环境，细胞能产生其本来的功能.Nakazawa et al [14] 将猪肝细胞种植在多管道的聚氨基甲酸乙酯泡沫床内，形成许多细胞球形聚集物，当猪肝功能衰竭后，用这种装置支持治疗，与对照组比较，治疗组血氨的产生被抑制，肝性脑病发生率低，血糖稳定，血肌酐及乳酸盐得到改善，生命体征平稳，并有尿的排泄，生存时间明显延长.Glicklis et al [15]将刚分离的鼠肝细胞培养在多孔结构的藻酸盐支架内，该支架中各孔之间互相连接.在培养的时间内，细胞数量未发生变化，细胞活力无下降，提示在该系统内，藻酸盐海绵能为肝细胞的生长提供一个有益的环境，通过肝细胞的集簇性促进培养肝细胞性能的表达.(4)包被悬浮生物反应器：该生物反应器是将肝细胞用材料包裹，制成多孔微胶囊，然后进行灌注培养.其优点是所有细胞有相同的微环境，有大量细胞培养的空间，减少免疫反应的发生.缺点是细胞稳定性差，物质交换能力受限.Khan et al [16]将山羊肝细胞包被于藻酸盐多聚赖氨酸微胶囊内，评估该装置对氨、葡萄糖及抗体介导下的细胞毒作用.在灌注量为30mL/min，给氧处理的条件下，结果是最适合的细胞数量是120-180亿，去除氯化铵2.5-5.0mmol/L，包被的肝细胞未见溶解.结论提出包被的细胞能去除氨，并能保持细胞活力，包被也能保护肝细胞在抗体介导下的细胞溶解.Chia et al [17]用双层聚合膜包被鼠肝细胞，外层用25% 2-羟乙基甲基丙烯酸酯、25% 2-甲基丙烯酸、50%甲基丙二酸盐合成聚合体，内层用修饰的胶原为增加肝细胞的功能作为合适的衬底，且只允许白蛋白以下的分子渗透，但不能阻止营养、氧气、生长因子及代谢产物的交换，结果指出包被肝细胞可用于生物反应器治疗患者.
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总之，肝病发生率不断上升及供体肝脏的缺乏，以细胞为基础对肝功能衰竭的治疗引起广大医学工作者的关注.目前，体外生物人工肝支持系统仍存在一些问题，需继续加以研究解决.细胞方面主要存在细胞来源的选择、细胞培养的稳定性、异种细胞引起的免疫反应及感染、肿瘤细胞系对人体的影响等；生物反应器装置还不能完全提供细胞黏附、细胞与细胞间作用、细胞与基质作用的结构，造成物质转运与细胞功能的不完善；临床治疗存在对不同病因所致的肝功能衰竭，没有一致的疗效标准及一致的临床试验设计.但部分临床治疗病例及动物实验证明，体外生物人工肝支持系统对肝功能衰竭的治疗是有效的，随着细胞生物学、材料科学及工程学的不断发展，经过广大科技工作者的共同努力，进一步对人工肝装置的不断完善，相信对肝功能衰竭的治疗将带来新的飞跃.
4 参考文献1 Matsumura KN, Guevara GR, Huston H, Hamilton WL, Rikimaru M,Yamasaki G, Matsumura MS. Hybrid bioartificial liver in
, 百拇医药
hepatic failure: Preliminary clinicalreport. Surgery 1987;101:99-103
2 Mundt A, Puhl G, Muller A, Sauer I, Muller C, Richard R, FotopoulouC, Doll R, Gabelein G, Hohn W, Hofbauer R, Neuhau
Gerlach J. A method to assess biochemicalactivity of liver cells during clinical application of extracorporealhybrid liver
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2 原代培养肝细胞表型的稳定性肝脏由多种细胞构成，细胞间及细胞外基质的相互作用是保持肝实质细胞表型稳定的基础.研究表明，将肝实质细胞分离后体外培养，其表型及功能迅速发生改变，肝细胞生物合成及解毒能力下降.因此，人们试图模仿肝脏体内的微环境培养肝细胞，最大限度的发挥其生理功能.Bhatia et al [6]将肝实质细胞与非实质细胞混合培养，保持了肝细胞的表型稳定.其分子机制目前仍不清楚，可能是细胞之间相互作用的信号传导参与其表型的稳定.
3 生物反应器的设计生物人工肝装置及对肝功能衰竭治疗效果最有影响的关键部分是生物反应器.随着工程科学及材料科学的发展，对生物反应器的研究步伐加快，反应器中所用细胞种类的增多及对细胞培养表型稳定性的增加，临床应用生物反应器治疗患者已成为现实.设计合理的生物反应器应具备适当的双向物质转运，以便对生物反应器中的肝脏细胞提供足够的营养，保持细胞活力，排除治疗细胞的产物，根据生物分子量大小，选择半透膜，在患者及生物反应器中进行物质交换；保持细胞活力及功能.目前，肝细胞在生物反应器中培养不能长期保持肝细胞的功能是一大难题，其原因是不能在体外为肝细胞生长提供一个合适的微环境.因此，在设计生物反应器时不但要考虑有效的物质转运，还要考虑细胞生长的微环境及相关的化学促进因子；具有潜在的提高治疗水平.研究指出，要保持人的生命，细胞数量至少是正常人的10-30%，成人至少要150-450g肝细胞，因此，要求生物反应器有一定的培养空间.目前研究及应用的生物反应器主要有以下几种：(1)中空纤维生物反应器：中空纤维反应器有内腔及外腔，常将肝脏细胞黏附于中空纤维的外腔，根据不同来源的细胞选择合适截留分子量的生物膜，避免发生异种细胞产物所引起的免疫反应，但肝脏细胞在生物反应器中分布不均，易造成细胞活力下降.Jasmund et al [7]指出，生物反应器的肝脏细胞有高的氧消耗，他们设计了一种新的可供氧的中空纤维生物反应器，将肝脏细胞种植在中空纤维的外腔，并控制氧及温度，培养递质在中空纤维外腔灌注.发现供氧的中空纤维生物反应器有多种优点，不仅可获得高密度的细胞，而且易掌握.为了验证该生物反应器的效果，在超过3wk的培养中，他们检测了尿素合成、白蛋白合成、糖的消耗、氧的水平及pH值等，结论提示该生物反应器生物化学作用稳定，能保持细胞活力.Mazariegos et al [8]用中空纤维反应器培养70-100g猪肝细胞，用于一位暴发性肝功能衰竭的患者的治疗.结果表明生物反应器安全.目前，该生物反应器在美国进行I、II期的安全评估.Custer et al [9]研究中空纤维生物反应器对培养细胞的影响，指出在50ml/L二氧化碳及氮平衡条件下，氧合器的氧在20-70%的范围内变动，氧消耗率及细胞功能稳定，没有观察到氧中毒的征象.在另外的实验研究中，观察到随细胞数量增加，氧消耗量也随之增加.但Flendrig etal [10]在鼠动物实验中，造成鼠肝缺血致肝功能衰竭，肝细胞培养在无生物膜的中空纤维生物反应器中直接用血或血浆灌注，结果与对照组比较，鼠的生存状态明显改善，生命全部延长.目前，中空纤维生物反应器应用广泛，其最大优势是表面积与体积之比大，便于代谢物的转运，且能保持有最小的死腔.(2)平板单层生物反应器：平板单层生物反应器是将细胞种植在平板上培养，其优点是细胞分布均匀，微环境一致，但表面积与体积之比下降.Shito et al [11]设计了一种带有内膜氧合器的微管道平板单层生物反应器，将猪肝细胞培养在反应器中，观察肝细胞在体外灌注及动物实验中的生物合成功能.结果表明，体外灌注4d，肝细胞的蛋白合成稳定.体内实验用鼠作动物模型，24h在鼠血浆中检测猪白蛋白，发现这种生物反应器作为肝支持系统很有潜力，可望更进一步研究.Tilles et al [12]比较带有内膜氧合器及不带内膜氧合器的平板单层生物反应器，结果是带有氧合器的生物反应器能使肝细胞稳定，生物合成功能加强，而不带内膜氧合器者与之相反.他指出在临床应用的生物反应器的设计应考虑到相关的问题，以便提高治疗效果.(3)灌注床或支架生物反应器：该生物反应器是将肝细胞种植在灌注床或支架上，其优点是与细胞直接接触，增加了物质的转运，也促进三维结构的形成，同时也容易扩大细胞容量，其缺点是灌注不均一，易堵塞.Kawada et al [13]根据灌注床或支架生物反应器的设计原理，将肝细胞装入多孔的玻璃球微载体内，利用培养液从外周向中心产生一个营养及氧气的梯度，形成高密度的细胞且具有高度活力，三维结构的细胞呈球形，类似于体内肝细胞分布的过程，球形细胞间保持紧密的接触，培养液在细胞空间自由的流动.结果提示这种反应器能提供一个较好的三维细胞培养环境，细胞能产生其本来的功能.Nakazawa et al [14] 将猪肝细胞种植在多管道的聚氨基甲酸乙酯泡沫床内，形成许多细胞球形聚集物，当猪肝功能衰竭后，用这种装置支持治疗，与对照组比较，治疗组血氨的产生被抑制，肝性脑病发生率低，血糖稳定，血肌酐及乳酸盐得到改善，生命体征平稳，并有尿的排泄，生存时间明显延长.Glicklis et al [15]将刚分离的鼠肝细胞培养在多孔结构的藻酸盐支架内，该支架中各孔之间互相连接.在培养的时间内，细胞数量未发生变化，细胞活力无下降，提示在该系统内，藻酸盐海绵能为肝细胞的生长提供一个有益的环境，通过肝细胞的集簇性促进培养肝细胞性能的表达.(4)包被悬浮生物反应器：该生物反应器是将肝细胞用材料包裹，制成多孔微胶囊，然后进行灌注培养.其优点是所有细胞有相同的微环境，有大量细胞培养的空间，减少免疫反应的发生.缺点是细胞稳定性差，物质交换能力受限.Khan et al [16]将山羊肝细胞包被于藻酸盐多聚赖氨酸微胶囊内，评估该装置对氨、葡萄糖及抗体介导下的细胞毒作用.在灌注量为30mL/min，给氧处理的条件下，结果是最适合的细胞数量是120-180亿，去除氯化铵2.5-5.0mmol/L，包被的肝细胞未见溶解.结论提出包被的细胞能去除氨，并能保持细胞活力，包被也能保护肝细胞在抗体介导下的细胞溶解.Chia et al [17]用双层聚合膜包被鼠肝细胞，外层用25% 2-羟乙基甲基丙烯酸酯、25% 2-甲基丙烯酸、50%甲基丙二酸盐合成聚合体，内层用修饰的胶原为增加肝细胞的功能作为合适的衬底，且只允许白蛋白以下的分子渗透，但不能阻止营养、氧气、生长因子及代谢产物的交换，结果指出包被肝细胞可用于生物反应器治疗患者.
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总之，肝病发生率不断上升及供体肝脏的缺乏，以细胞为基础对肝功能衰竭的治疗引起广大医学工作者的关注.目前，体外生物人工肝支持系统仍存在一些问题，需继续加以研究解决.细胞方面主要存在细胞来源的选择、细胞培养的稳定性、异种细胞引起的免疫反应及感染、肿瘤细胞系对人体的影响等；生物反应器装置还不能完全提供细胞黏附、细胞与细胞间作用、细胞与基质作用的结构，造成物质转运与细胞功能的不完善；临床治疗存在对不同病因所致的肝功能衰竭，没有一致的疗效标准及一致的临床试验设计.但部分临床治疗病例及动物实验证明，体外生物人工肝支持系统对肝功能衰竭的治疗是有效的，随着细胞生物学、材料科学及工程学的不断发展，经过广大科技工作者的共同努力，进一步对人工肝装置的不断完善，相信对肝功能衰竭的治疗将带来新的飞跃.
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Gerlach J. A method to assess biochemicalactivity of liver cells during clinical application of extracorporealhybrid liver
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3 Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Dc PJ,Blumenthal PD, Huggins GR, Gearhart JD. Derivation
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