hMSH2在胃癌组织中的表达及其与DNA甲基化之间的关系
程中华,房静远, 杨丽,陈萦, 陆嵘,朱红音, 顾伟齐,陈晓宇, 彭延申,施尧,上海第二医科大学附属仁济医院,上海市消化疾病研究所 上海市 200001
国家自然科学基金资助项目,No. 30170413
高等学校全国优秀博士论文作者专项资金资助,No. 199946
项目负责人:房静远,200001, 上海市山东中路145号,上海第二医科大学附属仁济医院,上海市消化疾病研究所. jingyuanfang@yahoo.com
电话:021-62360930
收稿日期:2004-01-15 接受日期:2004-04-05
, 百拇医药
摘要
目的:分析胃癌组织中DNA甲基化酶Dnmt1和hMSH2表达情况的相关性及与肿瘤生物学行为之间的关系.
方法:以real-time RTPCR法检测28例胃癌组织中Dnmt1和hMSH2mRNA的表达，亚硫酸氢钠变性后测序分析hMSH2启动子区甲基化状态.
结果:在28例胃癌组织中有9例(32%)DNMT1mRNA的高表达，10例hMSH2(35.7%)的低表达，在hMSH2低表达的胃癌组织中有2例存在DNA启动子区的高甲基化.两个基因mRNA的表达与胃癌生物学行为包括肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性.
, 百拇医药
结论:胃癌组织中存在Dnmt1的高表达，DNA甲基化在一定程度上参与了hMSH2基因表达的缺失.
程中华,房静远, 杨丽,陈萦, 陆嵘,朱红音, 顾伟齐,陈晓宇, 彭延申,施尧. hMSH2在胃癌组织中的表达及其与DNA甲基化之间的关系.世界华人消化杂志 2004;12(7):1731-1733
0 引言肿瘤组织多有DNA甲基化的紊乱.DNA甲基化由DNA甲基化酶(DNAmethylatransferase，Dnmt)催化，他能将甲基供体提供的甲基集团转移至胞嘧啶5位碳上形成5-甲基胞嘧啶.DNA甲基化酶包括参与甲基化的形成(Dnmt3a和Dnmt3b的主要作用)和维持(主要是Dnmt1)两类酶.人类DNA错配修复系统(mismatchrepair system，MMR)是由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成，此系统的存在能避免遗传物质产生突变，保证DNA复制的高保真度.hMSH2是目前研究较广泛的DNA错配修复基因，他的失活可导致DNA错配修复能力的降低，引起微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)，可使癌基因激活或抑癌基因失活，诱发细胞癌变[1].现已发现，癌发生过程中导致错配修复基因失活的另一方式为DNA甲基化的改变，这种改变常伴有错配修复基因表达的丢失[2-3].目前对于hMSH2启动子甲基化情况的研究还较少.我们研究了胃癌组织中DNA甲基化酶Dnmt1和hMSH2表达情况的相关性及与肿瘤生物学行为之间的关系，并进一步分析了hMSH2启动子区的甲基化状态.
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1 材料和方法
1.1 材料 2001-05/2002-07组织学确诊为胃癌的手术患者28例，临床资料完整，术前均未进行任何抗肿瘤治疗.癌组织取自肿块中央非坏死部分，癌旁组织取自距癌灶边缘5cm以内的黏膜组织，正常组织取自距肿块10cm以上的正常黏膜组织.所有标本均经本院两位高年资病理科医生证实.患者平均年龄58.4岁.行胃癌根治术27例，姑息性胃大部切除术1例.病理类型: 溃疡性腺癌6例，浸润溃疡15例，弥漫浸润腺癌7例.临床分期:Ⅰ期2例，Ⅱ-Ⅲ期26例.淋巴结转移:21例存在淋巴结转移，7例不存在.
1.2 方法 RNA的提取和cDNA的合成见文献[4].定量PCR检测Dnmt，hMSH2的表达方法见文献[4].具体引物和探针见表1.hMSH2 DNA亚硫酸氢钠变性后测序.DNA经亚硫酸氢盐修饰能够使没有甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，后者在PCR扩增中以胸腺嘧啶形式扩增，而原有甲基化的胞嘧啶则保持胞嘧啶不变.处理步骤:取5 mgDNA加NaOH至终浓度为0.2moL/L，37 °C变性10min. 向变性DNA中加入新鲜配置的10mmoL/L的氰醌30ul及3 moL/L的亚硫酸氢钠(pH=5)520 ul，加入矿物油200ul. 样品于50 °C孵育16min. 修饰后的DNA根据说明书用WizerdDNA纯化树脂(Promega)纯化，用50ul水洗脱.加5.5ul 3 moL/L NaOH至洗脱液，室温放置5min. 加17 uL 10moL/L的醋酸胺，1uL的糖原及500uL的950 mL/L冰冷乙醇，过夜.14000 r/min 4 °C离心30min，以700 mL/L乙醇洗沉淀物.真空干燥，加20uL水稀释.处理后的DNA行潮式PCR，基因bank号AB006445，引物序列循环1为:正义5’-TGTTTA GAA AGA AAA AGG GA-3’; 反义5’-AAACCT CCT CAC CTC CT-3’. 循环2为:正义5’-AAATAT TGG GAG GAG GAG GA-3’; 反义5’-ACCCAC TAA ACT ATT TCC CA-3’. 产物片断357bp，位于第一外显子上游启动子-32～-388.两次PCR反应体系均为:3 mLMgCl2 (25 mmoL/L)，2mLdNTP(2.5 mmoL/L)，10pmoL上下游引物，模板2uL. 产物送上海申友生物科技公司测序.
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统计学处理 t检验，x2检验，相关分析法.
2 结果
2.1 Dnmt1与hMSH2mRNA的表达 定量RT-PCR反应良好，扩增符合要求.28例胃癌组织中有9例(32%)Dnmt1高表达，10例(36%)不同程度的低表达;癌组织平均Dnmt1为5.08±10.11，明显高于正常组织均值1(P=0.04). hMSH2 10例(35.7%)低表达，3例(10.7%)高表达，其余无明显变化.癌组织平均hMSH2为1.86±3.01，与正常组织无明显差异(P=0.14). 在mRNA表达水平上，Dnmt1与hMSH2无显著相关性(P=0.53).
2.2 hMSH2亚硫酸氢钠测序 将10例hMSH2mRNA低表达的样品DNA进行测序，分析其启动子区甲基化情况.用亚硫酸氢钠测序法可以检测到其中2例存在癌组织DNA启动子区的高甲基化.测序结果见图1.正常组织中单链DNACpG中的未甲基化的胞嘧啶已被亚硫酸氢钠脱氨基而变成U，U经PCR扩增后被T代替;反之，在癌和癌旁组织相应的甲基化序列中，CpG二核苷酸中的胞嘧啶保持不变，说明他们因甲基化而未被亚硫酸氢盐修饰，而CpG二核苷酸以外的胞嘧啶由于未被甲基化，都变成T(U).
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2.3 Dnmt1、hmsh2与肿瘤生物学行为的关系 不但如我们前文所述[4]Dnmt1转录水平与胃癌生物学行为不明确关系，且hMSH2基因mRNA表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性.
表1 定量PCR的引物和探针
, 百拇医药
图1(PDF)hmsh2测序结果.
3 讨论基因不稳在胃癌的发生中起重要作用.这种基因不稳可以分为二种不同的形式，即染色体不稳和微卫星不稳.hMLH1和hMSH2是错配修复基因系统中最重要的成员.胃癌hMLH1突变均发生在MSI阳性的癌组织，但相当一部分MSI阳性胃癌组织并未发现hMLH1和hMSH2基因的突变，因此可能有其他机制参与了这种缺陷.目前认为肿瘤发生过程中导致hMLH1失活的另一重要方式为DNA甲基化的改变，这种改变可引起hMLH1表达的丢失[5].Dnmt1是体内最重要的DNA甲基化酶，他能维持DNA的甲基化修饰.在癌细胞中，Dnmt1基因表达升高往往先于高甲基化改变，一般认为Dnmt1活性升高是癌组织的一个具有特征的早期分子改变.很多肿瘤组织存在着不同程度的Dnmt1高表达[6-7].但目前对于DNA甲基化是否能引起hMSH2表达缺失仍有异议[8-9].
, 百拇医药
我们发现32%的胃癌组织存在Dnmt1的高表达，癌区Dnmt1的表达均值显著高于正常黏膜区(P=0.04); Dnmt1的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性.这一结果与日本学者得到的结论相近[10].同时，我们还发现胃癌组织中的Dnmt1高表达以及DNA甲基化在一定程度上参与了hMSH2基因表达的缺失.我们同时发现这两例存在hMSH2癌组织启动子高甲基化的病例其Dnmt1在mRNA的表达上并无明显变化，我们猜测Dnmt1可能通过影响hMLH1而非hMSH2的甲基化状态，从而导致微卫星不稳定，并进一步参与了肿瘤的进程.在本次实验中我们没有观察到Dnmt1和hMSH2与肿瘤各种生物学行为之间有相关性.我们拟进一步研究DNA甲基化与微卫星不稳定之间的关系.
4 参考文献1 Tang R, Changchien CR, Wu MC, Fan CW, Liu KW, Chen JS, Chien HT,Hsieh LL. Colorectal cancer without high
, http://www.100md.com
microsatellite instability and chromosomalinstability-an alternative genetic pathway to human colorectalcancer.
Carcinogenesis 2004;25:841-846
2 Fang DC, Wang RQ, Yang SM, Yang JM, Liu HF, Peng GY, Xiao TL, LuoYH. Mutation and methylation of hMLH1 in gastric
carcinomas with microsatellite instability.World J Gastroenterol 2003;9:655-659
3 Kang GH, Lee S, Shim YH, Kim JC, Ro JY. Profile of methylated CpGsites of hMLH1 promoter in primary gastric
, 百拇医药
carcinoma with microsatellite instability.Pathol Int 2002;52:764-768
4 程中华,房静远, 杨丽,陈萦, 陆嵘,陆娟, 朱红音,顾伟齐. 人胃癌组织DNA甲基化酶、去甲基化酶与肿瘤相关基因的表达.
中华消化杂志 2004;24:203-206
5 Sakata K, Tamura G, Endoh Y, Ohmura K, Ogata S, Motoyama T.Hypermethylation of the hMLH1 gene promoter in
solitary and multiple gastric cancers withmicrosatellite instability. Br J Cancer 2002;86:564-567
, 百拇医药
6 Girault I, Tozlu S, Lidereau R, Bieche I. Expression analysis ofDNA methyltransferases 1, 3A, and 3B in sporadic breast
carcinomas. Clin Cancer Res 2003;9:4415-4422
7 Sato M, Horio Y, Sekido Y, Minna JD, Shimokata K, Hasegawa Y. Theexpression of DNA methyltransferases and
methyl-CpG-binding proteins is notassociated with the methylation status of p14(ARF), p16(INK4a) and RASSF1Ain
, 百拇医药
human lung cancer cell lines. Oncogene 2002;21:4822-4829
8 Kim HC, Kim CN, Yu CS, Roh SA, Kim JC. Methylation of the hMLH1 andhMSH2 promoter in early-onset sporadic
colorectal carcinomas with microsatelliteinstability. Int J Colorectal Dis 2003;18:196-202
9 Saito T, Oda Y, Kawaguchi K, Takahira T, Yamanoto H, Sakamoto A,Tamiya S, Iwamoto Y, Tsuneyoshi M. Possible
, http://www.100md.com
association between tumor-suppressor genemutations and hMSH2/hMLH1 inactivation in alveolar soft partsarcoma.
Hum Pathol 2003;34:841-849
10 Kanai Y, Ushijima S, Kondo Y, Nakanishi Y, Hirohashi S.DNAmethyltransterase expression and DNA methylation of CPG
islands and peri-centromeric satelliteregions in human colorectal and stomach cancers. Int J Cancer 2001;91:205-212, 百拇医药( 程中华, 房静远, 杨 丽, 陈 萦, 陆 嵘, 朱红音, 顾伟齐, 陈晓宇, 彭延申, 施 尧)
国家自然科学基金资助项目,No. 30170413
高等学校全国优秀博士论文作者专项资金资助,No. 199946
项目负责人:房静远,200001, 上海市山东中路145号,上海第二医科大学附属仁济医院,上海市消化疾病研究所. jingyuanfang@yahoo.com
电话:021-62360930
收稿日期:2004-01-15 接受日期:2004-04-05
, 百拇医药
摘要
目的:分析胃癌组织中DNA甲基化酶Dnmt1和hMSH2表达情况的相关性及与肿瘤生物学行为之间的关系.
方法:以real-time RTPCR法检测28例胃癌组织中Dnmt1和hMSH2mRNA的表达，亚硫酸氢钠变性后测序分析hMSH2启动子区甲基化状态.
结果:在28例胃癌组织中有9例(32%)DNMT1mRNA的高表达，10例hMSH2(35.7%)的低表达，在hMSH2低表达的胃癌组织中有2例存在DNA启动子区的高甲基化.两个基因mRNA的表达与胃癌生物学行为包括肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性.
, 百拇医药
结论:胃癌组织中存在Dnmt1的高表达，DNA甲基化在一定程度上参与了hMSH2基因表达的缺失.
程中华,房静远, 杨丽,陈萦, 陆嵘,朱红音, 顾伟齐,陈晓宇, 彭延申,施尧. hMSH2在胃癌组织中的表达及其与DNA甲基化之间的关系.世界华人消化杂志 2004;12(7):1731-1733
0 引言肿瘤组织多有DNA甲基化的紊乱.DNA甲基化由DNA甲基化酶(DNAmethylatransferase，Dnmt)催化，他能将甲基供体提供的甲基集团转移至胞嘧啶5位碳上形成5-甲基胞嘧啶.DNA甲基化酶包括参与甲基化的形成(Dnmt3a和Dnmt3b的主要作用)和维持(主要是Dnmt1)两类酶.人类DNA错配修复系统(mismatchrepair system，MMR)是由一系列特异性修复DNA碱基错配的酶分子组成，此系统的存在能避免遗传物质产生突变，保证DNA复制的高保真度.hMSH2是目前研究较广泛的DNA错配修复基因，他的失活可导致DNA错配修复能力的降低，引起微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)，可使癌基因激活或抑癌基因失活，诱发细胞癌变[1].现已发现，癌发生过程中导致错配修复基因失活的另一方式为DNA甲基化的改变，这种改变常伴有错配修复基因表达的丢失[2-3].目前对于hMSH2启动子甲基化情况的研究还较少.我们研究了胃癌组织中DNA甲基化酶Dnmt1和hMSH2表达情况的相关性及与肿瘤生物学行为之间的关系，并进一步分析了hMSH2启动子区的甲基化状态.
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料 2001-05/2002-07组织学确诊为胃癌的手术患者28例，临床资料完整，术前均未进行任何抗肿瘤治疗.癌组织取自肿块中央非坏死部分，癌旁组织取自距癌灶边缘5cm以内的黏膜组织，正常组织取自距肿块10cm以上的正常黏膜组织.所有标本均经本院两位高年资病理科医生证实.患者平均年龄58.4岁.行胃癌根治术27例，姑息性胃大部切除术1例.病理类型: 溃疡性腺癌6例，浸润溃疡15例，弥漫浸润腺癌7例.临床分期:Ⅰ期2例，Ⅱ-Ⅲ期26例.淋巴结转移:21例存在淋巴结转移，7例不存在.
1.2 方法 RNA的提取和cDNA的合成见文献[4].定量PCR检测Dnmt，hMSH2的表达方法见文献[4].具体引物和探针见表1.hMSH2 DNA亚硫酸氢钠变性后测序.DNA经亚硫酸氢盐修饰能够使没有甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，后者在PCR扩增中以胸腺嘧啶形式扩增，而原有甲基化的胞嘧啶则保持胞嘧啶不变.处理步骤:取5 mgDNA加NaOH至终浓度为0.2moL/L，37 °C变性10min. 向变性DNA中加入新鲜配置的10mmoL/L的氰醌30ul及3 moL/L的亚硫酸氢钠(pH=5)520 ul，加入矿物油200ul. 样品于50 °C孵育16min. 修饰后的DNA根据说明书用WizerdDNA纯化树脂(Promega)纯化，用50ul水洗脱.加5.5ul 3 moL/L NaOH至洗脱液，室温放置5min. 加17 uL 10moL/L的醋酸胺，1uL的糖原及500uL的950 mL/L冰冷乙醇，过夜.14000 r/min 4 °C离心30min，以700 mL/L乙醇洗沉淀物.真空干燥，加20uL水稀释.处理后的DNA行潮式PCR，基因bank号AB006445，引物序列循环1为:正义5’-TGTTTA GAA AGA AAA AGG GA-3’; 反义5’-AAACCT CCT CAC CTC CT-3’. 循环2为:正义5’-AAATAT TGG GAG GAG GAG GA-3’; 反义5’-ACCCAC TAA ACT ATT TCC CA-3’. 产物片断357bp，位于第一外显子上游启动子-32～-388.两次PCR反应体系均为:3 mLMgCl2 (25 mmoL/L)，2mLdNTP(2.5 mmoL/L)，10pmoL上下游引物，模板2uL. 产物送上海申友生物科技公司测序.
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统计学处理 t检验，x2检验，相关分析法.
2 结果
2.1 Dnmt1与hMSH2mRNA的表达 定量RT-PCR反应良好，扩增符合要求.28例胃癌组织中有9例(32%)Dnmt1高表达，10例(36%)不同程度的低表达;癌组织平均Dnmt1为5.08±10.11，明显高于正常组织均值1(P=0.04). hMSH2 10例(35.7%)低表达，3例(10.7%)高表达，其余无明显变化.癌组织平均hMSH2为1.86±3.01，与正常组织无明显差异(P=0.14). 在mRNA表达水平上，Dnmt1与hMSH2无显著相关性(P=0.53).
2.2 hMSH2亚硫酸氢钠测序 将10例hMSH2mRNA低表达的样品DNA进行测序，分析其启动子区甲基化情况.用亚硫酸氢钠测序法可以检测到其中2例存在癌组织DNA启动子区的高甲基化.测序结果见图1.正常组织中单链DNACpG中的未甲基化的胞嘧啶已被亚硫酸氢钠脱氨基而变成U，U经PCR扩增后被T代替;反之，在癌和癌旁组织相应的甲基化序列中，CpG二核苷酸中的胞嘧啶保持不变，说明他们因甲基化而未被亚硫酸氢盐修饰，而CpG二核苷酸以外的胞嘧啶由于未被甲基化，都变成T(U).
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2.3 Dnmt1、hmsh2与肿瘤生物学行为的关系 不但如我们前文所述[4]Dnmt1转录水平与胃癌生物学行为不明确关系，且hMSH2基因mRNA表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性.
表1 定量PCR的引物和探针
| Gene | 正义引物 (5’→3’) | 反义引物(5’→3’) | 探针 |
| b-actin | CTG GCA CCC AGC ACA GAT | GGA CAG CGA GGC CGA ATG | ATC ATT GCT CCT CCT GAG |
| Dnmt1 | GCA CCT CAT TTG CCG AAT ACA | TCT CCT GCA TCA GCC CAA ATA | AGT CCC GAG TAT GCG C |
| HMSH2 | ATC CAA GGA GAA TGA TTG GTA TTT G | CAA AGA GAA TGT CTT CAA ACT GAG AGA | CAT ATA AGG CTT CTC CTG GC |
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图1(PDF)hmsh2测序结果.
3 讨论基因不稳在胃癌的发生中起重要作用.这种基因不稳可以分为二种不同的形式，即染色体不稳和微卫星不稳.hMLH1和hMSH2是错配修复基因系统中最重要的成员.胃癌hMLH1突变均发生在MSI阳性的癌组织，但相当一部分MSI阳性胃癌组织并未发现hMLH1和hMSH2基因的突变，因此可能有其他机制参与了这种缺陷.目前认为肿瘤发生过程中导致hMLH1失活的另一重要方式为DNA甲基化的改变，这种改变可引起hMLH1表达的丢失[5].Dnmt1是体内最重要的DNA甲基化酶，他能维持DNA的甲基化修饰.在癌细胞中，Dnmt1基因表达升高往往先于高甲基化改变，一般认为Dnmt1活性升高是癌组织的一个具有特征的早期分子改变.很多肿瘤组织存在着不同程度的Dnmt1高表达[6-7].但目前对于DNA甲基化是否能引起hMSH2表达缺失仍有异议[8-9].
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我们发现32%的胃癌组织存在Dnmt1的高表达，癌区Dnmt1的表达均值显著高于正常黏膜区(P=0.04); Dnmt1的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型均无明显相关性.这一结果与日本学者得到的结论相近[10].同时，我们还发现胃癌组织中的Dnmt1高表达以及DNA甲基化在一定程度上参与了hMSH2基因表达的缺失.我们同时发现这两例存在hMSH2癌组织启动子高甲基化的病例其Dnmt1在mRNA的表达上并无明显变化，我们猜测Dnmt1可能通过影响hMLH1而非hMSH2的甲基化状态，从而导致微卫星不稳定，并进一步参与了肿瘤的进程.在本次实验中我们没有观察到Dnmt1和hMSH2与肿瘤各种生物学行为之间有相关性.我们拟进一步研究DNA甲基化与微卫星不稳定之间的关系.
4 参考文献1 Tang R, Changchien CR, Wu MC, Fan CW, Liu KW, Chen JS, Chien HT,Hsieh LL. Colorectal cancer without high
, http://www.100md.com
microsatellite instability and chromosomalinstability-an alternative genetic pathway to human colorectalcancer.
Carcinogenesis 2004;25:841-846
2 Fang DC, Wang RQ, Yang SM, Yang JM, Liu HF, Peng GY, Xiao TL, LuoYH. Mutation and methylation of hMLH1 in gastric
carcinomas with microsatellite instability.World J Gastroenterol 2003;9:655-659
3 Kang GH, Lee S, Shim YH, Kim JC, Ro JY. Profile of methylated CpGsites of hMLH1 promoter in primary gastric
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carcinoma with microsatellite instability.Pathol Int 2002;52:764-768
4 程中华,房静远, 杨丽,陈萦, 陆嵘,陆娟, 朱红音,顾伟齐. 人胃癌组织DNA甲基化酶、去甲基化酶与肿瘤相关基因的表达.
中华消化杂志 2004;24:203-206
5 Sakata K, Tamura G, Endoh Y, Ohmura K, Ogata S, Motoyama T.Hypermethylation of the hMLH1 gene promoter in
solitary and multiple gastric cancers withmicrosatellite instability. Br J Cancer 2002;86:564-567
, 百拇医药
6 Girault I, Tozlu S, Lidereau R, Bieche I. Expression analysis ofDNA methyltransferases 1, 3A, and 3B in sporadic breast
carcinomas. Clin Cancer Res 2003;9:4415-4422
7 Sato M, Horio Y, Sekido Y, Minna JD, Shimokata K, Hasegawa Y. Theexpression of DNA methyltransferases and
methyl-CpG-binding proteins is notassociated with the methylation status of p14(ARF), p16(INK4a) and RASSF1Ain
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human lung cancer cell lines. Oncogene 2002;21:4822-4829
8 Kim HC, Kim CN, Yu CS, Roh SA, Kim JC. Methylation of the hMLH1 andhMSH2 promoter in early-onset sporadic
colorectal carcinomas with microsatelliteinstability. Int J Colorectal Dis 2003;18:196-202
9 Saito T, Oda Y, Kawaguchi K, Takahira T, Yamanoto H, Sakamoto A,Tamiya S, Iwamoto Y, Tsuneyoshi M. Possible
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association between tumor-suppressor genemutations and hMSH2/hMLH1 inactivation in alveolar soft partsarcoma.
Hum Pathol 2003;34:841-849
10 Kanai Y, Ushijima S, Kondo Y, Nakanishi Y, Hirohashi S.DNAmethyltransterase expression and DNA methylation of CPG
islands and peri-centromeric satelliteregions in human colorectal and stomach cancers. Int J Cancer 2001;91:205-212, 百拇医药( 程中华, 房静远, 杨 丽, 陈 萦, 陆 嵘, 朱红音, 顾伟齐, 陈晓宇, 彭延申, 施 尧)
