大鼠胃壁细胞的分离及纯化
李燕舞,王建华, 王汝俊,广州中医药大学脾胃研究所 广东省广州市 510405
国家自然科学基金项目,No. 30271650
项目负责人:王汝俊,510405, 广东省广州市机场路12号,广州中医药大学脾胃研究所.
电话:020-36585555
收稿日期:2004-03-11 接受日期:2004-04-27
摘要
目的:建立和完善大鼠胃壁细胞分离和纯化的方法.
, http://www.100md.com
方法:采用Pronase-EDTA酶消化法，脱颈椎处死大鼠，取胃制作翻转胃袋并注入消化酶溶液. 通过三步即消化-分散-纯化来完成大鼠胃壁细胞的游离和收集过程.
结果:即时分离细胞经HE染色鉴别纯度达到70%，活度经台盼兰排除实验鉴定可达到90%以上，在0-4°C环境下22h后细胞活度仍可达70-80%左右.
结论:严格控制分离细胞操作的条件，可获得较为稳定的实验结果，包括细胞的活度和纯度.
李燕舞,王建华, 王汝俊.大鼠胃壁细胞的分离及纯化.世界华人消化杂志 2004;12(7):1733-1735
0 引言壁细胞是胃底腺干细胞分化的一种终末细胞，主要功能是分泌胃酸，在一些种属包括人、猴子、兔、猫、豚鼠、牛等，壁细胞还有分泌内因子的作用，这对于维生素B12的吸收必不可少，但对于大鼠和小鼠，壁细胞的功能只有泌酸[1].由于许多消化系疾病均与胃酸分泌有关，故对胃黏膜及壁细胞的研究必不可少. 国外1970年代就建立了分离壁细胞的方法[1].近年国内李晓波etal [2]建立了兔胃壁细胞的分离方法，我室聂克etal [3]根据Lewin的方法略加改善建立了大鼠胃壁细胞的分离方法. 由于壁细胞的分离较难，操作过程较为复杂，因此分离细胞的活率和纯度也存在较大差异，我们在此基础上对该法进一步摸索，有几点体会.
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1 大鼠胃壁细胞的分离方法
1.1 材料 实验动物采用SD普通级大鼠，雌雄均可，200-250g，实验前不予禁食.基础营养液包括:NaH2PO4，Na2HPO4，NaHCO3，NaCl，KCl，HEPES，Glucose. A液: 基础液+BSA+EDTA，B液:基础液+BSA+CaCl2+MgCl2，C液:B液+DTT，消化液:A液+pronase. 其中A液中BSA的含量由20g/L减至10 g/L，细胞分离的数量和活率未见明显变化. HEPES配制时应单独溶解，为无色溶液,若颜色变黄时会影响细胞分离结果. DTT在临用前加入,所用各种营养液均用NaOH调整pH值7.0-7.5，酶的用量应控制在1g/L，EDTA用量为2mmoL/L.
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1.2 胃袋 脱颈椎处死动物，剖开腹腔，结扎贲门和幽门，将取出的胃放入冰冷的生理盐水中冲洗表面，由胃底剪开一口，用玻璃棒将胃翻转后再置冰冷生理盐水中洗涤胃内容物及黏液，在胃盲囊与胃体交界处结扎切口，由胃窦部进针(4号)注入消化液至胃袋充满为止. 若胃袋出现充血、溃疡、胃内容物变稀等异常状况，则对胃壁细胞的分离结果有很大影响.
1.3 消化 消化液注入胃袋应小心操作，若出现漏液则影响细胞的活率. 胃袋放入A液内，37°C水浴振荡(100次/min)，并通入950mL/L O2和50mL/L CO2，此时胃袋内层即浆膜面处于消化液(pronase-EDTA)的作用，外层即黏膜面处于A液(EDTA+BSA)中，既保证消化酶的分离作用又避免了直接作用对胃黏膜细胞的损伤. 消化时间为90min，整个消化过程分为3步，每步30min，更换新鲜A液后重复进行，每次换液须预先37°C温浴并通气，以保证细胞分离过程始终处于一个较为恒定的环境.
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1.4 分散 是指胃黏膜细胞由胃袋组织游离下来的过程. 此过程主要由2步组成:一是磁力搅拌，二是低速离心. 搅拌的目的是将消化过程中胃黏膜层松散的细胞从组织上游离下来，离心的目的则是集中收集细胞. 搅拌时胃袋处于B液中，B液较A液多了Ca2+和Mg2+离子，使分离下来的细胞所处的环境更加接近生理条件. 搅拌时间以50min为宜，且每10min更换一次B液，更换前B液同样需要预先温浴和通气. 搅拌的速度要缓慢轻柔，以胃袋刚好可以在B液中自由旋转为宜，每次搅拌后，混有细胞及组织残渣的B液要经200目尼龙滤膜过滤，然后离心，离心速度控制900-1000 r/min，离心5min，细胞可沉于管底用C液混悬后收集，因C液中含有分散细胞的DTT，且离心速度低，细胞易于吹打分散，团块较少. 每次收集的细胞混悬液要放入0-4°C环境保存，此温度对细胞形态损伤较小.
1.5 细胞活率 即时分离的细胞，特别是应用消化酶，最大的一个缺点就是对细胞的损伤，通过翻转胃袋及消化酶用量和细胞保护剂BSA用量的控制，分离细胞的活率大有提高，可以达到90%以上(台盼蓝染色实验)，但随着时间的延长，细胞的死亡率迅速增加.室温操作大约2h后细胞活率降为50%以下，这很不利于对细胞形态及功能的进一步检测. 为了对细胞活率的改善，有报道对分离胃壁细胞进行原代培养[4]，在整个过程中，壁细胞每日的死亡率为5-10%，但因本室条件限制，分离过程无法保证无菌操作，细胞培养难以实现.设想将分离细胞混悬于F12/DMEM培养基(加胰岛素、转铁蛋白、抗生素、葡萄糖、牛血清白蛋白)，在37°C恒温开放环境中，并通入50mL/L CO2过夜观察细胞活率的变化，发现分离2h后细胞活率可保持80%左右，但14h后只有个别细胞存活. 考虑是因为37°C及培养基适宜细菌繁殖，对细胞的影响很大. 而0-4 °C环境对细胞损伤小，且不利于细菌生长，故将细胞混悬液放入0-4°C冰箱，结果发现2h后活率大于80%，22h后活率为70%，44h后活率为40-50%，细胞死亡速度明显减慢. 后又观察将分离细胞混悬于C营养液中0-4°C保存，细胞的活率22h后仍可达到70-80%，这对于进行即时分离细胞的进一步功能检测无疑是非常有利的.
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2 大鼠胃壁细胞的纯化方法由于分离出的胃黏膜细胞包括主细胞、壁细胞、黏液细胞及少数内分泌细胞，而胃壁细胞只占总体细胞的20-30%，为得到较高纯度的壁细胞用于实验研究是一个必须解决的问题. 李晓波曾用淘洗及离心的方法可获得较高纯度的兔胃壁细胞[2]，但由于仪器设备及兔、鼠所分离胃黏膜细胞数量多少的差异，淘洗方法难以实施. Percoll作为一种细胞分离液，具有对细胞损伤小的特点，且易于从细胞表面洗脱,可用于对大鼠胃壁细胞的纯化分离. 我室采用400g/L，600 g/LPercoll非连续密度梯度离心法,可得到较稳定的70%左右纯度的壁细胞.
2.1 Percoll的配制 用生理盐水或0.25moL/L蔗糖配制,可保证细胞处于等渗环境. 我室采用生理盐水配制:首先，将Percoll原液与1.5moL/L 的NaCl 9:1混合(体积比)作为纯Percoll储存液，密度为1130±5g/L. 用时再根据需要用0.15moL/L NaCl配制不同百分比浓度的Percoll.
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2.2 富集壁细胞 我室以往采取恒流泵制作40-60%连续密度梯度递质离心富集壁细胞，经操作发现非连续密度梯度离心细胞更容易分层收集. 在离心管中依次铺入600g/L (1 080 g/L )，400g/L (1 056 g/L)Percoll分离液各2mL，再轻轻铺入细胞混悬液1mL，细胞浓度在(1-2×109/L)，离心速度2000 r/min，15min. 细胞在不同界面出现分层，分别收集40%及60%界面处细胞，台盼蓝染色鉴定活率，HE染色鉴定纯度，结果发现，40%层界面处细胞数量较少，细胞碎片较多，活率低，而60%层界面处富集细胞数量较多，细胞活率可达到90-95%，细胞涂片经HE染色后壁细胞比例可达到70%左右，且结果稳定. 陈蕾etal [4]报道大鼠壁细胞分离并培养后纯度可达到80%，可能与其采用幼年大鼠(体重100g左右)及经过培养有关.
3 讨论细胞分离的方法通常有两种:机械分离法和酶分离法. 与其他组织相比较，比如肝或胰腺，胃黏膜因细胞排列紧密而不易分离. 单纯应用机械法分离胃黏膜细胞效果并不理想. 应用胶原酶可对狗、豚鼠、兔的胃黏膜细胞进行成功的分离，由于不同种属的动物及不同类型的蛋白水解酶对细胞分离效果影响迥异，胶原酶对大鼠胃黏膜细胞的分离并不理想，而Pronase(链酶蛋白酶)对分离大鼠胃黏膜细胞很有效，这种酶具有广泛的消化作用，与EDTA联合使用作用更加突出，但对细胞的生物结构有一定影响.
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大鼠胃壁细胞的分离采用pronase-EDTA酶消化法，根据Lewinet al 制作翻转胃袋并注入消化液进行细胞分离. 分离过程主要分为三步:消化-分散-纯化.具体来说，是指(1)pronase-EDTA消化液注入翻转胃袋，并将胃袋放入营养液中37°C水浴振荡消化过程;(2)磁力搅拌分散细胞并低速离心收集细胞过程;(3)percoll非连续密度梯度离心富集壁细胞过程. 即时分离纯化后壁细胞纯度为70%，活率90%，在0-4°C环境下保存22h后活率仍可达到70-80%.
细胞分离过程往往较为烦琐，需细致操作，而结果也常因人因地有很大差异，我室针对大鼠胃壁细胞的分离方法进行摸索，在本实验室条件下已取得较为稳定的结果. 壁细胞的纯化是影响细胞功能检测的关键步骤，目前国外报道应用JE-6B淘洗系统可对狗或兔的胃黏膜细胞进行纯化，获得70%纯度的壁细胞，再进一步用percoll梯度离心的方法可纯化至95-100%[5]. Chew et al [6]用Nycodens梯度离心联合淘洗可获得95%纯度的兔壁细胞.Schepp et al[7]报道应用淘洗和percoll梯度离心的方法纯化大鼠壁细胞，纯度可达到97%以上. 本室在已有的实验条件下可获得大鼠壁细胞纯度70%，尚需进一步提高.
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胃壁细胞分离及纯化方法的建立为泌酸相关疾病提供了体外细胞研究模型，为细胞表面受体的研究提供了基础，也使研究细胞内信息传递及药物调节成为可能，将推动我国胃酸相关疾病的研究.
4 参考文献1 Chew CS. Parietal cell culture:new models and directions. Annu RevPhysiol 1994;56:445-461
2 李晓波,钱家鸣, 陈元方.壁细胞的淘洗分离与应用.胃肠病学和肝病学杂志 1996;5:254-256
3 聂克, 王汝俊,王建华. 大鼠胃壁细胞的分离方法.世界华人消化杂志 1999;7:994-995
4 陈蕾,黄威权, 孙绪德,吕宝真, 蒲若蕾.大鼠胃壁细胞的分离及培养.第四军医大学学报 2002;23:769-771
, 百拇医药
5 Delvalle J, Tsunoda Y, Williams JA, Yamada T. Regulation of [Ca2+]iby secretagogue stimulation of canine gastric
parietal cells. Am J Physiol GastrointestLiver Physiol 1992;262:G420-G426
6 Chew CS, Brown MR. Release of intracellular Ca2+ andelevation of inositol trisphosphate by secretagogues in parietal
and chief cells isolated from rabbitgastric mucosa. Biochim Biophys Acta 1986;888:116-125
7 Schepp W, Dehne K, Herrmuth H, Pfeffer K, Prinz C. Identificationand functional importance of IL-1 receptors on rat
parietal cells. Am J Physiol 1998;275:G1094-1105, http://www.100md.com( 李燕舞, 王建华, 王汝俊)
国家自然科学基金项目,No. 30271650
项目负责人:王汝俊,510405, 广东省广州市机场路12号,广州中医药大学脾胃研究所.
电话:020-36585555
收稿日期:2004-03-11 接受日期:2004-04-27
摘要
目的:建立和完善大鼠胃壁细胞分离和纯化的方法.
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方法:采用Pronase-EDTA酶消化法，脱颈椎处死大鼠，取胃制作翻转胃袋并注入消化酶溶液. 通过三步即消化-分散-纯化来完成大鼠胃壁细胞的游离和收集过程.
结果:即时分离细胞经HE染色鉴别纯度达到70%，活度经台盼兰排除实验鉴定可达到90%以上，在0-4°C环境下22h后细胞活度仍可达70-80%左右.
结论:严格控制分离细胞操作的条件，可获得较为稳定的实验结果，包括细胞的活度和纯度.
李燕舞,王建华, 王汝俊.大鼠胃壁细胞的分离及纯化.世界华人消化杂志 2004;12(7):1733-1735
0 引言壁细胞是胃底腺干细胞分化的一种终末细胞，主要功能是分泌胃酸，在一些种属包括人、猴子、兔、猫、豚鼠、牛等，壁细胞还有分泌内因子的作用，这对于维生素B12的吸收必不可少，但对于大鼠和小鼠，壁细胞的功能只有泌酸[1].由于许多消化系疾病均与胃酸分泌有关，故对胃黏膜及壁细胞的研究必不可少. 国外1970年代就建立了分离壁细胞的方法[1].近年国内李晓波etal [2]建立了兔胃壁细胞的分离方法，我室聂克etal [3]根据Lewin的方法略加改善建立了大鼠胃壁细胞的分离方法. 由于壁细胞的分离较难，操作过程较为复杂，因此分离细胞的活率和纯度也存在较大差异，我们在此基础上对该法进一步摸索，有几点体会.
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1 大鼠胃壁细胞的分离方法
1.1 材料 实验动物采用SD普通级大鼠，雌雄均可，200-250g，实验前不予禁食.基础营养液包括:NaH2PO4，Na2HPO4，NaHCO3，NaCl，KCl，HEPES，Glucose. A液: 基础液+BSA+EDTA，B液:基础液+BSA+CaCl2+MgCl2，C液:B液+DTT，消化液:A液+pronase. 其中A液中BSA的含量由20g/L减至10 g/L，细胞分离的数量和活率未见明显变化. HEPES配制时应单独溶解，为无色溶液,若颜色变黄时会影响细胞分离结果. DTT在临用前加入,所用各种营养液均用NaOH调整pH值7.0-7.5，酶的用量应控制在1g/L，EDTA用量为2mmoL/L.
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1.2 胃袋 脱颈椎处死动物，剖开腹腔，结扎贲门和幽门，将取出的胃放入冰冷的生理盐水中冲洗表面，由胃底剪开一口，用玻璃棒将胃翻转后再置冰冷生理盐水中洗涤胃内容物及黏液，在胃盲囊与胃体交界处结扎切口，由胃窦部进针(4号)注入消化液至胃袋充满为止. 若胃袋出现充血、溃疡、胃内容物变稀等异常状况，则对胃壁细胞的分离结果有很大影响.
1.3 消化 消化液注入胃袋应小心操作，若出现漏液则影响细胞的活率. 胃袋放入A液内，37°C水浴振荡(100次/min)，并通入950mL/L O2和50mL/L CO2，此时胃袋内层即浆膜面处于消化液(pronase-EDTA)的作用，外层即黏膜面处于A液(EDTA+BSA)中，既保证消化酶的分离作用又避免了直接作用对胃黏膜细胞的损伤. 消化时间为90min，整个消化过程分为3步，每步30min，更换新鲜A液后重复进行，每次换液须预先37°C温浴并通气，以保证细胞分离过程始终处于一个较为恒定的环境.
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1.4 分散 是指胃黏膜细胞由胃袋组织游离下来的过程. 此过程主要由2步组成:一是磁力搅拌，二是低速离心. 搅拌的目的是将消化过程中胃黏膜层松散的细胞从组织上游离下来，离心的目的则是集中收集细胞. 搅拌时胃袋处于B液中，B液较A液多了Ca2+和Mg2+离子，使分离下来的细胞所处的环境更加接近生理条件. 搅拌时间以50min为宜，且每10min更换一次B液，更换前B液同样需要预先温浴和通气. 搅拌的速度要缓慢轻柔，以胃袋刚好可以在B液中自由旋转为宜，每次搅拌后，混有细胞及组织残渣的B液要经200目尼龙滤膜过滤，然后离心，离心速度控制900-1000 r/min，离心5min，细胞可沉于管底用C液混悬后收集，因C液中含有分散细胞的DTT，且离心速度低，细胞易于吹打分散，团块较少. 每次收集的细胞混悬液要放入0-4°C环境保存，此温度对细胞形态损伤较小.
1.5 细胞活率 即时分离的细胞，特别是应用消化酶，最大的一个缺点就是对细胞的损伤，通过翻转胃袋及消化酶用量和细胞保护剂BSA用量的控制，分离细胞的活率大有提高，可以达到90%以上(台盼蓝染色实验)，但随着时间的延长，细胞的死亡率迅速增加.室温操作大约2h后细胞活率降为50%以下，这很不利于对细胞形态及功能的进一步检测. 为了对细胞活率的改善，有报道对分离胃壁细胞进行原代培养[4]，在整个过程中，壁细胞每日的死亡率为5-10%，但因本室条件限制，分离过程无法保证无菌操作，细胞培养难以实现.设想将分离细胞混悬于F12/DMEM培养基(加胰岛素、转铁蛋白、抗生素、葡萄糖、牛血清白蛋白)，在37°C恒温开放环境中，并通入50mL/L CO2过夜观察细胞活率的变化，发现分离2h后细胞活率可保持80%左右，但14h后只有个别细胞存活. 考虑是因为37°C及培养基适宜细菌繁殖，对细胞的影响很大. 而0-4 °C环境对细胞损伤小，且不利于细菌生长，故将细胞混悬液放入0-4°C冰箱，结果发现2h后活率大于80%，22h后活率为70%，44h后活率为40-50%，细胞死亡速度明显减慢. 后又观察将分离细胞混悬于C营养液中0-4°C保存，细胞的活率22h后仍可达到70-80%，这对于进行即时分离细胞的进一步功能检测无疑是非常有利的.
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2 大鼠胃壁细胞的纯化方法由于分离出的胃黏膜细胞包括主细胞、壁细胞、黏液细胞及少数内分泌细胞，而胃壁细胞只占总体细胞的20-30%，为得到较高纯度的壁细胞用于实验研究是一个必须解决的问题. 李晓波曾用淘洗及离心的方法可获得较高纯度的兔胃壁细胞[2]，但由于仪器设备及兔、鼠所分离胃黏膜细胞数量多少的差异，淘洗方法难以实施. Percoll作为一种细胞分离液，具有对细胞损伤小的特点，且易于从细胞表面洗脱,可用于对大鼠胃壁细胞的纯化分离. 我室采用400g/L，600 g/LPercoll非连续密度梯度离心法,可得到较稳定的70%左右纯度的壁细胞.
2.1 Percoll的配制 用生理盐水或0.25moL/L蔗糖配制,可保证细胞处于等渗环境. 我室采用生理盐水配制:首先，将Percoll原液与1.5moL/L 的NaCl 9:1混合(体积比)作为纯Percoll储存液，密度为1130±5g/L. 用时再根据需要用0.15moL/L NaCl配制不同百分比浓度的Percoll.
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2.2 富集壁细胞 我室以往采取恒流泵制作40-60%连续密度梯度递质离心富集壁细胞，经操作发现非连续密度梯度离心细胞更容易分层收集. 在离心管中依次铺入600g/L (1 080 g/L )，400g/L (1 056 g/L)Percoll分离液各2mL，再轻轻铺入细胞混悬液1mL，细胞浓度在(1-2×109/L)，离心速度2000 r/min，15min. 细胞在不同界面出现分层，分别收集40%及60%界面处细胞，台盼蓝染色鉴定活率，HE染色鉴定纯度，结果发现，40%层界面处细胞数量较少，细胞碎片较多，活率低，而60%层界面处富集细胞数量较多，细胞活率可达到90-95%，细胞涂片经HE染色后壁细胞比例可达到70%左右，且结果稳定. 陈蕾etal [4]报道大鼠壁细胞分离并培养后纯度可达到80%，可能与其采用幼年大鼠(体重100g左右)及经过培养有关.
3 讨论细胞分离的方法通常有两种:机械分离法和酶分离法. 与其他组织相比较，比如肝或胰腺，胃黏膜因细胞排列紧密而不易分离. 单纯应用机械法分离胃黏膜细胞效果并不理想. 应用胶原酶可对狗、豚鼠、兔的胃黏膜细胞进行成功的分离，由于不同种属的动物及不同类型的蛋白水解酶对细胞分离效果影响迥异，胶原酶对大鼠胃黏膜细胞的分离并不理想，而Pronase(链酶蛋白酶)对分离大鼠胃黏膜细胞很有效，这种酶具有广泛的消化作用，与EDTA联合使用作用更加突出，但对细胞的生物结构有一定影响.
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大鼠胃壁细胞的分离采用pronase-EDTA酶消化法，根据Lewinet al 制作翻转胃袋并注入消化液进行细胞分离. 分离过程主要分为三步:消化-分散-纯化.具体来说，是指(1)pronase-EDTA消化液注入翻转胃袋，并将胃袋放入营养液中37°C水浴振荡消化过程;(2)磁力搅拌分散细胞并低速离心收集细胞过程;(3)percoll非连续密度梯度离心富集壁细胞过程. 即时分离纯化后壁细胞纯度为70%，活率90%，在0-4°C环境下保存22h后活率仍可达到70-80%.
细胞分离过程往往较为烦琐，需细致操作，而结果也常因人因地有很大差异，我室针对大鼠胃壁细胞的分离方法进行摸索，在本实验室条件下已取得较为稳定的结果. 壁细胞的纯化是影响细胞功能检测的关键步骤，目前国外报道应用JE-6B淘洗系统可对狗或兔的胃黏膜细胞进行纯化，获得70%纯度的壁细胞，再进一步用percoll梯度离心的方法可纯化至95-100%[5]. Chew et al [6]用Nycodens梯度离心联合淘洗可获得95%纯度的兔壁细胞.Schepp et al[7]报道应用淘洗和percoll梯度离心的方法纯化大鼠壁细胞，纯度可达到97%以上. 本室在已有的实验条件下可获得大鼠壁细胞纯度70%，尚需进一步提高.
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胃壁细胞分离及纯化方法的建立为泌酸相关疾病提供了体外细胞研究模型，为细胞表面受体的研究提供了基础，也使研究细胞内信息传递及药物调节成为可能，将推动我国胃酸相关疾病的研究.
4 参考文献1 Chew CS. Parietal cell culture:new models and directions. Annu RevPhysiol 1994;56:445-461
2 李晓波,钱家鸣, 陈元方.壁细胞的淘洗分离与应用.胃肠病学和肝病学杂志 1996;5:254-256
3 聂克, 王汝俊,王建华. 大鼠胃壁细胞的分离方法.世界华人消化杂志 1999;7:994-995
4 陈蕾,黄威权, 孙绪德,吕宝真, 蒲若蕾.大鼠胃壁细胞的分离及培养.第四军医大学学报 2002;23:769-771
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5 Delvalle J, Tsunoda Y, Williams JA, Yamada T. Regulation of [Ca2+]iby secretagogue stimulation of canine gastric
parietal cells. Am J Physiol GastrointestLiver Physiol 1992;262:G420-G426
6 Chew CS, Brown MR. Release of intracellular Ca2+ andelevation of inositol trisphosphate by secretagogues in parietal
and chief cells isolated from rabbitgastric mucosa. Biochim Biophys Acta 1986;888:116-125
7 Schepp W, Dehne K, Herrmuth H, Pfeffer K, Prinz C. Identificationand functional importance of IL-1 receptors on rat
parietal cells. Am J Physiol 1998;275:G1094-1105, http://www.100md.com( 李燕舞, 王建华, 王汝俊)
