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编号:10692938
拉米夫定治疗中病毒核酸无应答患者体内乙型肝炎病毒逆转录酶基因变异分析
http://www.100md.com 2005年1月1日 《世界华人消化杂志》 2005年第1期
     闫杰,冯鑫, 宋淑静,谢雯, 李蕴铷,北京地坛医院 北京市 100011

    王磊,山东大学医学院济南市传染病医院山东省济南市 250021

    首都医学发展科研基金,No. 2002-3046

    山东省卫生厅计划项目,No. 2001CA1CAA11

    项目负责人:闫杰, 100011, 北京市安外大街地坛公园13号,北京地坛医院. jieyan@bbn.cn

    电话:010-64211031-2330 传真:010-64281540
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    收稿日期:2004-09-29 接受日期:2004-10-11

    摘要

    目的
:了解拉米夫定病毒核酸无应答与HBV逆转录酶基因变异之间的关系.

    方法:采用PCR产物直接测序方法对3例病毒核酸无应答患者体内HBVRT区基因序列治疗前后的变异情况进行分析.

    结果:治疗前后6份标本核苷酸变异率为0.63-1.52%,氨基酸变异率为0.38-1.90%,其中出现rtY203H、rtS256C、rtL269I变异的频率较高,此外尚有1例出现rtL180M变异.
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    结论:拉米夫定治疗中病毒核酸无应答可能与HBVRT区基因变异有关.

    闫杰,冯鑫, 王磊,宋淑静, 谢雯,李蕴铷. 拉米夫定治疗中病毒核酸无应答患者体内乙型肝炎病毒逆转录酶基因变异分析.世界华人消化杂志 2005;13(1):130-132

    0 引言拉米夫定是目前主流抗乙型肝炎病毒(HBV)药物之一,在短期内可使HBVDNA水平下降,但仍有部分患者出现病毒核酸无应答[1].为了解拉米夫定病毒核酸无应答与HBV逆转录酶(reversetranscriptase,RT)基因变异有无关系,我们采用PCR产物直接测序方法对病毒核酸无应答患者体内HBVRT区基因序列治疗前后的变异情况进行分析.

    1 材料和方法
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    1.1 材料
自北京地坛医院就诊的慢性HBV感染者中选取3例经拉米夫定治疗12mo血清DNA始终阳性者作为研究对象;分别采集治疗前及治疗12mo血清,于-70°C保存备用.3例患者均为男性,年龄19-51岁,临床诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准[2];治疗方法为拉米夫定(贺普丁,由英国葛兰素公司生产)100mg,每日1次;每2mo 随访1次,检测肝功能、HBVDNA及HBVM(表1).

    1.2方法

    1.2.1病毒DNA
的提取采用异硫氰酸胍一步法提取血清中的DNA.待检血清50mL加入含4mol/L异硫氰酸胍的裂解液60mL,37°C温育10min;加入酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)50mL,震荡混匀后13000 g离心10min;取上清,加入等量异丙醇,-20°C沉淀2h,13 000 g离心10min,弃上清;加入600mL/L乙醇50 mL,13000 g离心10min,弃上清,室温干燥后加入20mL双蒸水溶解,-20°C保存.
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    1.2.2 HBV基因型检测采用巢式PCR技术进行HBV基因型检测,具体方法见参考文献[3].

    1.2.3 HBV RT区基因测序

    1.2.3.1巢式PCR
引物设计检索GenBank收录的HBV基因全序,采用PrimerPremier 5.0及Oligo 6.67软件辅助分析,于HBVRT区内设计巢式PCR引物,其中外引物:P1:5’-CCTCACCCATATCGTCAA-3’(nt105-122),P2:5’-GAGCCACAAAGGTTCCAC-3’(nt1255-1238);内引物:P3:5’-GCACCGAACATGGAGAAC-3’(nt146-163),P4:5’-AGGCAGGATAGCCACATT-3’(nt1051-1034)(引物由上海生工生物技术公司合成).
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    1.2.3.2 巢式PCR反应30 mLPCR反应体系含TaKaRaEx TaqTM DNA聚合酶(购自大连宝生物工程有限公司)1U、10×扩增缓冲液3mL、25mol/L dNTP 0.12 mL、50mmol/L引物0.12 mL;第一轮PCR模板为血清抽提物6mL,引物为P1、P2;第二轮PCR模板为第一轮PCR产物3mL,引物为P3、P4.两轮PCR循环温度条件均为94°C 3 min,94°C 45 s、55°C 45 s、72°C 45 s,共30循环,72°C 7 min.取第二轮PCR产物8mL,以10g/L琼脂糖凝胶电泳,EB染色后,于紫外灯下观察结果,于906bp处出现荧光条带者为阳性.

    1.2.3.3 PCR产物测序将第二轮PCR产物经10g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化后,分别以P3、P4为测序引物,应用双脱氧末端终止法进行序列测定(由北京鼎国生物技术公司完成).
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    1.2.3.4 序列分析 基因型检测结果显示各标本均为C型,故选取GenBank中收录的HBVC型基因序列50条(均与拉米夫定治疗无关),生成共享序列(consensus);并从中随机选取6条(AB014378、AF223960、AF068756、D23683、AB014389、AF458664)与6份标本测序结果一同进行核苷酸序列及氨基酸序列分析.序列分析应用DNAstar、clustalx、GeneDoc等分子生物学软件完成.

    表1 三例患者拉米夫定治疗前后临床资料
病例号年龄(岁)治疗前治疗12 mo 后
ALT (IU/L)Tbil (mmo l/L)HBeAgAnti -HBeHBV DNA (copies/L)ALT (IU/L)Tbil (mmo l/L)HBeAgAnti -HBeHBV DNA (copies/L)
2162010820+-3.6×10103320+-8.1×109
393516514+-8.1×10112642+-3.4×109
506196212+-2.3×10124618+-2.9×1010

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    2 结果

    2.1 巢式PCR
产物电泳结果阳性标本PCR产物大小与预期值相符,为906bp(图1).

    图1(PDF)PCR产物电泳结果.P: 阳性标本;N: 空白对照;M: DGL2000 DNA Marker.

    2.2 HBV RT区测序结果 3例患者治疗前及治疗12mo 时共6份标本均成功测序,有效序列长度为786bp(nt217-1002).测序结果已提交至GenBank,其序列号(accessionnumber)分别为:AY762897,AY762898,AY762899,AY762900,AY762901,AY762902.

    2.3 HBV RT区序列分析 6份标本核苷酸变异率为0.63-1.52%,氨基酸变异率为0.38-1.90%,较既往GenBank中收录的HBVC型基因序列的变异率无明显差别(1.01-2.67%,0.76-3.43%)(表2).但进一步分析拉米夫定治疗前后HBVRT区氨基酸变异情况发现:变异集中在逆转录酶第269,256,203氨基酸位点上,此外尚有一例出现rtL180M变异(表3).
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    表2 各序列与concensus间的变异率
核苷酸序列(%)氨基酸序列(%)
AB0143781.651.52
AF2239602.673.43
AF0687561.650.76
D236831.391.14
AB0143891.522.67
AF4586641.011.52
21621.271.14
21610.760.76
39321.272.29
39310.630.76
50620.890.38
50611.521.90

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    1拉米夫定治疗12mo 后; 2拉米夫定治疗前.

    表3 经拉米夫定治疗12mo 后HBV RT区氨基酸变异情况
病例号氨基酸位置核苷酸变异氨基酸变异
21630GTT→TTTV→F
269ATC→CTCI→L
39337AGC→ACCS→T
180CTG→ATGL→M
189TTA→TCAL→S
203CAT→TATH→Y
256T GT→AGTC→S
269ATC→CTCI→L
506164CTG→ATGL→M
203TAT→CATY→H
256AGT→TGTS→C
269CTC→ATCL→I

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    3 讨论作为有效的抗HBV药物,拉米夫定治疗12mo 时的 HBVDNA阴转率约为80%[4],仍有部分患者表现为病毒核酸无应答[1].既往研究多聚焦在拉米夫定耐药与HBVP区变异间的关系,鲜有关于拉米夫定治疗中病毒核酸无应答患者体内乙型肝炎病毒基因变异状况的报道.但曾有研究揭示HBVC区基因变异可能与干扰素治疗无应答有关[5],HBVP区V555I变异多出现在泛昔洛韦初治无应答患者体内[6].为解拉米夫定病毒核酸无应答与HBVRT区变异有无关系,本研究采用PCR产物直接测序方法对病毒核酸无应答患者体内HBVRT区基因序列治疗前后的变异情况进行了分析.除检测到rtL180M这一常见拉米夫定耐药变异外,尚发现病毒核酸无应答患者体内HBVRT区出现rtY203H、rtS256C、rtL269I变异的频率较高.进一步检索GenBank发现rtL269I在以往发表序列中亦较多见,说明该位点保守性较差,可能对逆转录酶活性影响不大;但未检索到其他位点变异.上述变异位点均在HBV逆转录酶活性区域内,也是拉米夫定抑制HBV复制的关键部位,因此有必要进行体外实验研究,以进一步明确上述变异对拉米夫定的药代动力学和药效学的影响.再者,本研究样本量较小且PCR产物直接测序花费较大,故尚应设计更为经济、有效的检测方法以进行大样本研究,进一步明确与病毒核酸无应答相关的关键变异位点.
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    HBV存在准种状态,随机克隆测序不适于研究抗病毒治疗前后的病毒基因序列变化,应从准种中的优势种群的变异情况来阐明HBV基因的变化与临床病情间的相互关系[7].故本研究采用PCR产物直接测序方法进行拉米夫定治疗前后HBVRT区基因序列变异分析.该方法所获得的测序结果可代表患者体内某时点的HBV优势株,故而具备治疗前后的可比性.为保证测序结果的可靠性,在PCR及测序实验中均应用了具有3’→5’外切活性的高保真DNA聚合酶,从而保证了实验结果的可信性.

    4 参考文献1 拉米夫定临床应用专家组.2004年拉米夫定临床应用专家共识.中华肝脏病杂志 2004;12:425-428

    2 中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病学分会联合修订.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志 2000;8:324-329
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    3 王小红,何忠平, 庄辉,阎杰, 董庆鸣,宋淑静. 乙型肝炎病毒聚合酶链反应基因分型法的建立及应用.中华肝脏病杂志

    2003;11:310-311

    4 姚光弼,崔振宇, 姚集鲁,张定凤, 籍纳新,黄瑛. 国产拉米夫定治疗2200例慢性乙型肝炎的Ⅳ期临床试验.中华肝脏病杂志

    2003;11:103-108

    5 Yoo BC, Kim HJ, Do JH, Park SM. Relationship between core genemutations of hepatitis B virus and response to alpha

    interferon therapy in chronic hepatitis B.Taehan Kan Hakhoe Chi 2002;8:381-388
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    6 Gunther S, von Breunig F, Santantonio T, Jung MC, Gaeta GB, FischerL, Sterneck M, Will H. Absence of mutations in

    the YMDD motif/B region of the hepatitis Bvirus polymerase in famciclovir therapy failure. J Hepatol 1999;30:749-754

    7 成军. 科学研究的设计和方法中的科学性.世界华人消化杂志 2004;12:1513-1516

    编辑 张海宁, 百拇医药( 闫 杰, 冯 鑫, 王 磊, 宋淑静, 谢 雯, 李蕴铷)
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