干扰素-a对人肝癌细胞增殖及侵袭的抑制作用
乔世峰, 北京世纪坛医院普外科 北京市 100038
王季堃, 锦州医学院附属第一医院肿瘤诊治中心 辽宁省锦州市 121000
通讯作者: 乔世峰,100038, 北京市海淀区羊坊店10号, 北京世纪坛医院. qiaoshf@tom.com
电话: 010-80647613
收稿日期: 2005-01-29 接受日期: 2005-04-01
摘要
目的:研究人干扰素-a对人肝癌细胞系BEL-7402细胞增殖及侵袭的抑制作用.
, http://www.100md.com
方法:常规培养的BEL-7402细胞加入人干扰素-a(1×106U/L)共同孵育24 h后，以MTT法检测干扰素-a对肿瘤细胞增殖的影响;Boyden小室法检测肝癌细胞侵袭能力的变化;明胶酶谱法检测肝癌细胞基质金属蛋白酶的变化.免疫组化法检测肿瘤细胞增殖核抗原的表达;TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡.
结果:人干扰素-a可以明显抑制体外BEL-7402细胞的增殖(抑制率为20.2%);干扰素-a作用后在Boyden 小室穿膜的肿瘤细胞数明显减少(抑制率为23.9%);肝癌细胞基质金属蛋白酶的分泌没有明显变化.干扰素-a组肿瘤细胞增殖核抗原的表达明显下降，凋亡细胞数明显增加.
结论:低剂量的干扰素-a可以直接抑制肝癌细胞株BEL-7402的增殖，对BEL-7402细胞的侵袭有明显的抑制作用;可以抑制肿瘤细胞增殖核抗原的表达并诱导细胞凋亡.
, http://www.100md.com
乔世峰, 王季堃. 干扰素-a对人肝癌细胞增殖及侵袭的抑制作用. 世界华人消化杂志 2005;13(8):1021-1023(PDF) MTT法检测IFN-a对BEL-7402细胞增殖的影响.
2.2Boyden 小室检测的细胞体外侵袭的结果表明，作用24 h后IFN-a组BEL-7402细胞穿过Matrigel发生侵袭的细胞数分别为每高倍视野101.2±5.8个，PBS组为131.8±9.5个，抑制率为23.9%，二者比较有显著性差异(P<0.01，图2).
图2 Boyden小室检测BEL-7402穿膜细胞. A:PBS; B:INF-a组.
2.3IFN-a对BEL-7402细胞MMPs分泌的影响经IFN-a作用后，BEL-7402细胞分泌的MMPs种类和数量都没有变化.
, http://www.100md.com
2.4 BEL-7402细胞PCNA的表达 人肝癌细胞系BEL-7402细胞与PCNA单抗染色后，阳性细胞染色为棕色，染色部位在细胞核;同一反应条件下IFN-a组PCNA染色与对照组比较显色明显减弱.
2.5 肿瘤组织细胞的凋亡 细胞核呈棕褐色着染者即为凋亡细胞，IFN-a组每100个细胞中阳性细胞数为19.53±3.18个，对照组阳性细胞数为11.36±0.55，IFN-a组与对照组比较凋亡细胞明显增多(P<0.01).
3 讨论IFN-a是一种糖蛋白，属于I型干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种生物学功能，许多体内和体外试验都充分证明，IFN不仅可以抑制肿瘤病毒诱发的肿瘤的生长，而且可以抑制移植性肿瘤和由化学致癌物诱发的肿瘤的生长，已经被广泛应用在多种领域及多种疾病的治疗中[7].但IFN的抗肿瘤机制尚不十分清楚.
, http://www.100md.com
肝细胞肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率较高.手术切除仍是首选的治疗方案，但常有复发的危险.有报道在肝细胞癌切除术后应用IFN-a治疗可以降低肝细胞癌的复发[4]，我们利用肝癌细胞系BEL-7402进行实验，以不同剂量(105-107U/L)的IFN-a2b进行增殖的抑制作用筛选，发现低剂量IFN-a2b(5×105U/mL)既有抗肝癌细胞增殖的效果，IFN-a对BEL-7402细胞的增殖有明显的抑制作用，也证明了IFN-a对肿瘤细胞可能有直接的抑制作用.
转移是引起癌症死亡的主要原因，在研究IFN对肿瘤细胞转移作用的细胞侵袭实验中我们利用了Boyden chambers的实验模型，结果发现IFN-a作用后BEL-7402细胞的侵袭能力明显受到抑制，穿膜细胞数明显减少，说明IFN-a可以抑制细胞对Matrigel胶的侵袭.在转移的过程中，肿瘤细胞的侵袭依赖于细胞的迁移和细胞外基质蛋白的水解.基质金属蛋白酶(MMPs)是一种存在于人类许多组织并发挥重要功能的金属蛋白酶，是降解细胞外基质的主要酶类，为Zn2+依赖性内切酶，参与了肿瘤转移过程中的多个步骤[8].通过明胶酶谱法检测MMPs的分泌发现，IFN-a作用的BEL-7402细胞培养上清中分泌MMPs的质和量都没有发生变化，分析IFN-a在体外不能阻止BEL-7402细胞MMPs的分泌，IFN-a对细胞侵袭的抑制作用可能是通过其他渠道实现的.
, 百拇医药
增殖细胞核抗原(PCNA)是一种无种属和组织特异性的、广泛存在于增殖活跃细胞中的细胞周期蛋白[9].作为DNA聚合酶d的辅助蛋白，PCNA直接参与DNA合成.在细胞周期G1晚期开始增加，S期达高峰，G2期明显下降，凡进入增殖周期的细胞均为阳性，而处在G0/G1期细胞则基本不表达，他可作为细胞增埴的一个指标[10]，肿瘤组织中PCNA阳性细胞数可反映肿瘤组织增殖的速度[11].我们的实验中IFN-a组BEL-7402细胞PCNA的表达明显低于对照组，表明IFN-a可以影响BEL-7402细胞PCNA的表达，其机制可能与肿瘤生长的抑制相关.细胞凋亡(apoptosis)与肿瘤的关系仍是目前研究的热点.我们应用TUNEL法检测发现，IFN-a可以明显使BEL-7402细胞凋亡的阳性细胞数量增加，诱导肝癌细胞的凋亡.细胞凋亡对肿瘤起着负调控作用[12]，肿瘤的发生发展不仅是由于细胞增殖速率升高，而且与细胞死亡速率下降有关，细胞凋亡对评估肿瘤预后有一定意义.
, http://www.100md.com
总之，IFN-a作为一种细胞因子，他既可用于全身治疗，也可用于局部治疗.他的作用机制是非常复杂的，而他的抗肿瘤作用是我们不能忽视的.目前将各种干扰素、干扰素与其他抗肿瘤药物以及干扰素与其他抗癌疗法联合应用的联合疗法是目前的发展趋势.
4 参考文献1 Kirkwood JM, Ibrahim JG, Sondak VK, Richards J, Flaherty LE, Ernstoff MS, Smith TJ, Rao U, Steele M, Blum RH. High-
and low-dose interferon-alfa-2b in high-risk melanoma: first analysis of intergroup trial E1690/S9111/C9190.
, http://www.100md.com
J Clin Oncol 2000;18:2444-58
2 Wakabayashi T, Hatano N, Kajita Y, Yoshida T, Mizuno M, Taniguchi K, Ohno T, Nagasaka T, Yoshida J. Initial and
maintenance combination treatment with interferon-beta, MCNU (Ranimustine), and radiotherapy for patients with
previously untreated malignant glioma. J Neurooncol 2000;49:57-62
3 王鲁, 汤钊猷, 薛琼, 孙惠川, 陈军, 高冬梅, 赵燕, 陈洁, 孙瑞霞, 刘银坤, 叶胜龙. a干扰素对肝癌切除术
, 百拇医药
后转移复发干预作用的实验研究. 中华肝脏病杂志 2001;9:154-156
4 Lin SM, Lin CJ, Hsu CW, Tai DI, Sheen IS, Lin DY, Liaw YF.Prospective randomized controlled study of interferon-alpha
in preventing hepatocellular carcinomarecurrence after medical ablation therapy for primary tumors. Cancer
2004;100:376-382
5 Albini A, Iwamoto Y, Kleinman HK, Martin GR, Aaronson SA, KozlowskiJM, McEwan RN. A rapid in vitro assay for
, 百拇医药
quantitating the invasive potential oftumor cells. Cancer Res 1987;47:3239-3245
6 沈关心, 周汝麟. 现代免疫学实验技术. 第1版. 湖北: 湖北科学技术出版社, 1998:162-168
7 杨吉成, 李丽娥, 盛伟华, 董宁征, 徐伦. 基因工程IFNa2a和IFNa 2b对肿瘤细胞生长的抑制作用.
实用癌症杂志 1999;14:164-166
8 Sternlicht MD, Werb Z. How matrix metalloproternases regulate cell behavior. Annu Rev Cell Dev Biol 2001;17:463-516
, 百拇医药
9 Pizem J, Marolt VF, Luzar B, Cor A. Proliferative and apoptotic activity in hepatocellular carcinoma and surrounding non
neoplastic liver tissue. Pflugers Arch 2001;442(Suppl 1):R174-176
10 Kim YH, Lee JH, Chun H, Nam SJ, Lee WY, Song SY, Kwon OJ, Hyun JG, Sung IK, Son HJ, Rhee PL, Kim JJ, Paik SW,Rhee JC, Choi KW. Apopotsis and its correlation with proliferative activity in rectal cancer. J Surg Oncol
, http://www.100md.com
2002;79:236-242
11 Sever-Chroneos Z, Angus SP, Fribourg AF, Wan H, Todorov I, Knudsen KE, Knudsen ES. Retinoblastoma tumor
suppressor protein signals through inhibition of cyclin-dependent kinase 2 activity to disrupt PCNA function in S phase.
Mol Cell Biol 2001;21:4032-4045
12 Matturri L, Colombo B, Lavezzi AM. Evidence for apoptosis in non-small cell lung carcinoma. Relationship with cell
kinetics and prognosis. Anal Quant Cytol Histol 1999;21:240-244
编辑 张海宁, http://www.100md.com( 乔世峰,王季堃)
王季堃, 锦州医学院附属第一医院肿瘤诊治中心 辽宁省锦州市 121000
通讯作者: 乔世峰,100038, 北京市海淀区羊坊店10号, 北京世纪坛医院. qiaoshf@tom.com
电话: 010-80647613
收稿日期: 2005-01-29 接受日期: 2005-04-01
摘要
目的:研究人干扰素-a对人肝癌细胞系BEL-7402细胞增殖及侵袭的抑制作用.
, http://www.100md.com
方法:常规培养的BEL-7402细胞加入人干扰素-a(1×106U/L)共同孵育24 h后，以MTT法检测干扰素-a对肿瘤细胞增殖的影响;Boyden小室法检测肝癌细胞侵袭能力的变化;明胶酶谱法检测肝癌细胞基质金属蛋白酶的变化.免疫组化法检测肿瘤细胞增殖核抗原的表达;TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡.
结果:人干扰素-a可以明显抑制体外BEL-7402细胞的增殖(抑制率为20.2%);干扰素-a作用后在Boyden 小室穿膜的肿瘤细胞数明显减少(抑制率为23.9%);肝癌细胞基质金属蛋白酶的分泌没有明显变化.干扰素-a组肿瘤细胞增殖核抗原的表达明显下降，凋亡细胞数明显增加.
结论:低剂量的干扰素-a可以直接抑制肝癌细胞株BEL-7402的增殖，对BEL-7402细胞的侵袭有明显的抑制作用;可以抑制肿瘤细胞增殖核抗原的表达并诱导细胞凋亡.
, http://www.100md.com
乔世峰, 王季堃. 干扰素-a对人肝癌细胞增殖及侵袭的抑制作用. 世界华人消化杂志 2005;13(8):1021-1023(PDF) MTT法检测IFN-a对BEL-7402细胞增殖的影响.
2.2Boyden 小室检测的细胞体外侵袭的结果表明，作用24 h后IFN-a组BEL-7402细胞穿过Matrigel发生侵袭的细胞数分别为每高倍视野101.2±5.8个，PBS组为131.8±9.5个，抑制率为23.9%，二者比较有显著性差异(P<0.01，图2).
图2 Boyden小室检测BEL-7402穿膜细胞. A:PBS; B:INF-a组.
2.3IFN-a对BEL-7402细胞MMPs分泌的影响经IFN-a作用后，BEL-7402细胞分泌的MMPs种类和数量都没有变化.
, http://www.100md.com
2.4 BEL-7402细胞PCNA的表达 人肝癌细胞系BEL-7402细胞与PCNA单抗染色后，阳性细胞染色为棕色，染色部位在细胞核;同一反应条件下IFN-a组PCNA染色与对照组比较显色明显减弱.
2.5 肿瘤组织细胞的凋亡 细胞核呈棕褐色着染者即为凋亡细胞，IFN-a组每100个细胞中阳性细胞数为19.53±3.18个，对照组阳性细胞数为11.36±0.55，IFN-a组与对照组比较凋亡细胞明显增多(P<0.01).
3 讨论IFN-a是一种糖蛋白，属于I型干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种生物学功能，许多体内和体外试验都充分证明，IFN不仅可以抑制肿瘤病毒诱发的肿瘤的生长，而且可以抑制移植性肿瘤和由化学致癌物诱发的肿瘤的生长，已经被广泛应用在多种领域及多种疾病的治疗中[7].但IFN的抗肿瘤机制尚不十分清楚.
, http://www.100md.com
肝细胞肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率较高.手术切除仍是首选的治疗方案，但常有复发的危险.有报道在肝细胞癌切除术后应用IFN-a治疗可以降低肝细胞癌的复发[4]，我们利用肝癌细胞系BEL-7402进行实验，以不同剂量(105-107U/L)的IFN-a2b进行增殖的抑制作用筛选，发现低剂量IFN-a2b(5×105U/mL)既有抗肝癌细胞增殖的效果，IFN-a对BEL-7402细胞的增殖有明显的抑制作用，也证明了IFN-a对肿瘤细胞可能有直接的抑制作用.
转移是引起癌症死亡的主要原因，在研究IFN对肿瘤细胞转移作用的细胞侵袭实验中我们利用了Boyden chambers的实验模型，结果发现IFN-a作用后BEL-7402细胞的侵袭能力明显受到抑制，穿膜细胞数明显减少，说明IFN-a可以抑制细胞对Matrigel胶的侵袭.在转移的过程中，肿瘤细胞的侵袭依赖于细胞的迁移和细胞外基质蛋白的水解.基质金属蛋白酶(MMPs)是一种存在于人类许多组织并发挥重要功能的金属蛋白酶，是降解细胞外基质的主要酶类，为Zn2+依赖性内切酶，参与了肿瘤转移过程中的多个步骤[8].通过明胶酶谱法检测MMPs的分泌发现，IFN-a作用的BEL-7402细胞培养上清中分泌MMPs的质和量都没有发生变化，分析IFN-a在体外不能阻止BEL-7402细胞MMPs的分泌，IFN-a对细胞侵袭的抑制作用可能是通过其他渠道实现的.
, 百拇医药
增殖细胞核抗原(PCNA)是一种无种属和组织特异性的、广泛存在于增殖活跃细胞中的细胞周期蛋白[9].作为DNA聚合酶d的辅助蛋白，PCNA直接参与DNA合成.在细胞周期G1晚期开始增加，S期达高峰，G2期明显下降，凡进入增殖周期的细胞均为阳性，而处在G0/G1期细胞则基本不表达，他可作为细胞增埴的一个指标[10]，肿瘤组织中PCNA阳性细胞数可反映肿瘤组织增殖的速度[11].我们的实验中IFN-a组BEL-7402细胞PCNA的表达明显低于对照组，表明IFN-a可以影响BEL-7402细胞PCNA的表达，其机制可能与肿瘤生长的抑制相关.细胞凋亡(apoptosis)与肿瘤的关系仍是目前研究的热点.我们应用TUNEL法检测发现，IFN-a可以明显使BEL-7402细胞凋亡的阳性细胞数量增加，诱导肝癌细胞的凋亡.细胞凋亡对肿瘤起着负调控作用[12]，肿瘤的发生发展不仅是由于细胞增殖速率升高，而且与细胞死亡速率下降有关，细胞凋亡对评估肿瘤预后有一定意义.
, http://www.100md.com
总之，IFN-a作为一种细胞因子，他既可用于全身治疗，也可用于局部治疗.他的作用机制是非常复杂的，而他的抗肿瘤作用是我们不能忽视的.目前将各种干扰素、干扰素与其他抗肿瘤药物以及干扰素与其他抗癌疗法联合应用的联合疗法是目前的发展趋势.
4 参考文献1 Kirkwood JM, Ibrahim JG, Sondak VK, Richards J, Flaherty LE, Ernstoff MS, Smith TJ, Rao U, Steele M, Blum RH. High-
and low-dose interferon-alfa-2b in high-risk melanoma: first analysis of intergroup trial E1690/S9111/C9190.
, http://www.100md.com
J Clin Oncol 2000;18:2444-58
2 Wakabayashi T, Hatano N, Kajita Y, Yoshida T, Mizuno M, Taniguchi K, Ohno T, Nagasaka T, Yoshida J. Initial and
maintenance combination treatment with interferon-beta, MCNU (Ranimustine), and radiotherapy for patients with
previously untreated malignant glioma. J Neurooncol 2000;49:57-62
3 王鲁, 汤钊猷, 薛琼, 孙惠川, 陈军, 高冬梅, 赵燕, 陈洁, 孙瑞霞, 刘银坤, 叶胜龙. a干扰素对肝癌切除术
, 百拇医药
后转移复发干预作用的实验研究. 中华肝脏病杂志 2001;9:154-156
4 Lin SM, Lin CJ, Hsu CW, Tai DI, Sheen IS, Lin DY, Liaw YF.Prospective randomized controlled study of interferon-alpha
in preventing hepatocellular carcinomarecurrence after medical ablation therapy for primary tumors. Cancer
2004;100:376-382
5 Albini A, Iwamoto Y, Kleinman HK, Martin GR, Aaronson SA, KozlowskiJM, McEwan RN. A rapid in vitro assay for
, 百拇医药
quantitating the invasive potential oftumor cells. Cancer Res 1987;47:3239-3245
6 沈关心, 周汝麟. 现代免疫学实验技术. 第1版. 湖北: 湖北科学技术出版社, 1998:162-168
7 杨吉成, 李丽娥, 盛伟华, 董宁征, 徐伦. 基因工程IFNa2a和IFNa 2b对肿瘤细胞生长的抑制作用.
实用癌症杂志 1999;14:164-166
8 Sternlicht MD, Werb Z. How matrix metalloproternases regulate cell behavior. Annu Rev Cell Dev Biol 2001;17:463-516
, 百拇医药
9 Pizem J, Marolt VF, Luzar B, Cor A. Proliferative and apoptotic activity in hepatocellular carcinoma and surrounding non
neoplastic liver tissue. Pflugers Arch 2001;442(Suppl 1):R174-176
10 Kim YH, Lee JH, Chun H, Nam SJ, Lee WY, Song SY, Kwon OJ, Hyun JG, Sung IK, Son HJ, Rhee PL, Kim JJ, Paik SW,Rhee JC, Choi KW. Apopotsis and its correlation with proliferative activity in rectal cancer. J Surg Oncol
, http://www.100md.com
2002;79:236-242
11 Sever-Chroneos Z, Angus SP, Fribourg AF, Wan H, Todorov I, Knudsen KE, Knudsen ES. Retinoblastoma tumor
suppressor protein signals through inhibition of cyclin-dependent kinase 2 activity to disrupt PCNA function in S phase.
Mol Cell Biol 2001;21:4032-4045
12 Matturri L, Colombo B, Lavezzi AM. Evidence for apoptosis in non-small cell lung carcinoma. Relationship with cell
kinetics and prognosis. Anal Quant Cytol Histol 1999;21:240-244
编辑 张海宁, http://www.100md.com( 乔世峰,王季堃)
