BACE1的原核表达 纯化及活性鉴定
【摘要】 目的 原核表达活性BACE1，并建立灵敏、简便、低廉、适于高通量筛选的BACE1酶活性检测体系，为进一步筛选特异性抑制剂及研究BACE1结构与功能关系奠定基础。
方法 利用PCR技术扩增获得全长BACE1，并构建了BACE1功能区的原核表达重组质粒pMALc2-BACE1。重组质粒转化至E.coli JM109，以IPTG诱导MBP-BACE1融合蛋白的表达。经Amylose Resin亲和层析及阴离子交换FPLC纯化MBP-BACE1后，通过Xa因子切割去除MBP标签以获取BACE1。最后，通过电洗脱及阴离子交换FPLC纯化BACE1并用Western blot做了鉴定，以带有APP Swedish突变位点的荧光多肽为底物，荧光共振能量转移(FRET)检测其酶活性。
结果 纯化后的MBP-BACE1及BACE1纯度分别达到98%和99%。酶活性检测显示，所表达的BACE1体现出相对于BACE1S标准蛋白的低活性。
结论 FRET是一种灵敏、简便的检测BACE1活性的方法，为筛选抑制剂建立了检测平台。原核表达的BACE1具有一定活性，为进一步研究BACE1结构与功能关系奠定了基础。
【关键词】 BACE1 原核表达 荧光共振能量转移 β-淀粉样蛋白 阿尔茨海默病
Expression，purification and in vitro activity assay of BACE1in E.coli Meng Jun，Yang Ying，Li Ying，et al.
Department of Biochemistry and Molecular Biology，The School of Basic Medical Sciences， Peking University，Beijing100083.
【Abstract】 Objective To obtain active recombinant BACE1in E.coli and establish a sensitive，convenient assay for BACE1activity in vitro for high-thru screening the inhibitors of BACE1and further researches on the rela-tionship between BACE1's structure and function.Methods The complete coding sequence of BACE1was amplified from a human fetal brain cDNA library using PCR.The recombinant plasmid for the prokaryotic expression of BACE1's function domain，pMALc2-BACE1，was constructed by subclone.After pMALc2-BACE1was transformed into E.coli strain JM109cells，it was induced by IPTG.The induced MBP-BACE1was purified by amylose resin affinity chromatography and Resouse Q ion exchange column under FPLC system，and then was cleavaged by Xa factor.After the target BACE1was separated，it was purified by negative ion exchange FPLC.Finally，the activity of BACE1，which specificity was confirmed by Western blot analysis，was assayed through FRET using a peptide containing APP Swedish site.Results MBP-BACE1and BACE1was highly purified to98%and99%，respectively.The FRET results indi-cated that the recombinant BACE1exhibited relatively low activity compared with the standard BACE1.Conclusion FRETwas a highly sensitive，convenient method for high-thru screening the inhibitors of BACE1.The recombinant
BACE1was of benefit for further researches on the relationship between BACE1's structure and function.
【Key words】 BACE1 prokaryotic expression FRET β-amyloid protein Alzheimer's disease
淀粉样斑块是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的主要病理特征之一，其主要成分β-淀粉样蛋白(β-amy-loid protein，Aβ)在AD的发生、发展中起着重要作用。BACE1(β-site APP cleaving enzyme)，即β-分泌酶，是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)产生Aβ的关键酶。BACE1属于Ⅰ型跨膜蛋白，由501个氨基酸组成，其中46～460位氨基酸为功能活性区域。BACE1通过水解APP670Met-671Asp之间的肽键，生成670个氨基酸的可溶性N末端和包含完整Aβ区的APP跨膜C端。后者经γ分泌酶进一步酶切形成Aβ。最近的研究表明，BACE1基因敲除小鼠脑内的Aβ水平可降低90%，且其生理表型基本正常，显示了BACE1抑制剂在AD治疗中的广阔前景 [1] 。通过酵母或昆虫表达系统表达活性BACE1在最近已见报道 [2，3] 。然而，由于上述系统表达的蛋白量低，且纯化流程复杂，不适合BACE1抑制剂的大规模筛选。而BACE1的原核表达可克服以上缺陷，为筛选特异性抑制剂及研究BACE1结构与功能关系提供大量材料，为最终从根本上治疗AD带来希望。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒及菌株 质粒pMalC2及大肠杆菌JM109菌种为本室保存。pGEM ○ R -T Vector购自Promega公司。
1.1.2 试剂 Pfu DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase购自MBI公司。限制性内切酶、T4连接酶购自华美生物工程公司。QIAquick Gel Extraction Kit为QIAGEN公司产品。淀粉树脂为New England Biolabs公司产品。兔抗人BACE1多克隆抗体购自北京宣武医院多肽室。辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体购自北京中山生物技术公司。ECL化学发光试剂为Pharmacia公司产品。人胎脑cDNA文库为Clon-tech公司产品。BACE1蛋白标准品为腺病毒转染昆虫细胞表达的BACE1，购自美国Panvera Company公司。荧光多肽底物Arg-Glu-(EDANS)-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Lys-(DABCYL)-Arg购自Sigma公司。其它试剂为进口或国产分析纯。引物均由北京奥科生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 BACE1的克隆 参考已公布的BACE1核酸序列(gi:6118538)，在其编码区两侧设计引物(上游引物:5'-AATTCGAAATGGCCCAAGCCCTGCCCT-3';下游引物:5'-AGGGATCCGGGCCTCCTCACTTCAGCAG-3')，从人胎脑cD-NA文库中，以Pfu DNA Polymerase通过PCR扩增全长BACE1。反应条件为94℃变性5min，按94℃30s、59℃45s、72℃2min循环30次，最后于72℃延伸10min。
1.2.2 MBP-BACE1原核表达载体的构建 利用Taq DNA Polymerase对BACE1PCR产物进行加A反应并与pGEM○ R -T载体进行TA克隆，BamHI、SalI双酶切鉴定，获得正向插入重组质粒pGEM-BACE1(+)。以pGEM-BACE1(+)为模板，以Pfu DNA Polymerase通过PCR扩增BACE1功能区(即46E-460Y之间序列)相应核酸序列。上游引物为5'-CAGAATTCGAGACCGACGAAGAGCC CG-3';下游引物为5'-CGAAGCTTCTACTCAGTTGGGAGTAC TGG-3'。上下游引物5'端分别引入EcoRI及HindIII酶切位点。PCR反应条件为94℃变性5min，按94℃30s、60℃45s、72℃1.5min循环30次，最后于72℃延伸10min。回收并连接EcoRI、HindIII双酶切的PCR产物及pMALc2载体片段，构建原核表达重组质粒pMALc2-BACE1，EcoRI、HindIII、ScaI酶切鉴定阳性克隆并测序认证。
1.2.3 MBP-BACE1融合蛋白的诱导表达 融合蛋白的诱导表达参照文献 [3] 。
1.2.4 MBP-BACE1融合蛋白的亲和层析及FPLC纯化 对诱导菌进行超声，离心取上清，以0.2ml/min速率上样于淀粉树脂层析柱，充分洗柱后用含10mM麦芽糖的洗脱缓冲液洗脱表达蛋白质，280nm紫外监测并收集峰成分。所收集样品进一步采用Resouse Q柱进行阴离子交换FPLC纯化，Brandford法检测蛋白质浓度。
1.2.5 MBP-BACE1融合蛋白的Xa因子酶切及BACE1的纯化 以Xa因子酶切MBP-BACE1融合蛋白，MBP-BACE1:Xa因子为50:1(质量比)，反应温度27℃，反应时间为12h。Xa因子切割MBP-BACE1的反应体系进行SDS-PAGE电泳分离后，用KCl浸泡分离胶确定目标蛋白位置，将含目标蛋白的凝胶切出并置于装有1×Tris-甘氨酸缓冲液的透析袋，进行电洗脱。电洗脱纯化得到的BACE1样品进一步采用Mono Q柱进行阴离子交换FPLC纯化，收集峰成分，Brandford法检测蛋白质浓度。
1.2.6 BACE1的Western blot鉴定 FPLC纯化后的BACE1经SDS-PAGE电泳后，电转移至NC膜上，进行Western印迹分析。一抗为兔抗人BACE1多克隆抗体(1:500稀释)，二抗为辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体(1:4000稀释)。采用化学发光法显影。
1.2.7 FRET方法检测BACE1活性 以荧光多肽Arg-Glu -(EDANS)-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Lys-(DABCYL)-Arg作为底物，采用荧光共振能量转移方法(Fluorescence Resonance Energy Transfer assay，FRET)对BACE1进行活性检测。酶切反应分为三组:(1)加有BACE1S标准蛋白酶的阳性对照反应体系;(2)BACE1反应体系;(3)不加BACE1，只有底物的阴性对照反应体系;三组反应体系酶的终浓度均为10nM，底物浓度为12.5nM。每个反应体系均设两个平行反应。37℃避光反应30min、60min、90min、120min后分别加入等体积2.5M NaAc终止反应，用荧光分光光度计激发波长(Ex)350nm/释放波长(Em)490nm检测荧光强度。
2 结果
2.1 BACE1基因克隆 从人胎脑cDNA文库中，通过PCR扩增获得编码全长BACE1的核酸序列，约1.5kb(图1)。 M:DNA marker;1:Negative control;2:PCR amplification of BACE1
图1 PCR扩增BACE1全序列电泳鉴定图(图略)
2.2 MBP-BACE1原核表达载体的构建 扩增的全长BACE1与pGEM-T载体进行TA克隆，获得正向插入重组质粒pGEM-BACE1(+)。以pGEM-BACE1(+)为模板，PCR扩增BACE1功能区(46E-460Y)相应核酸序列(约1.3kb)，并插入表达载体pMALc2中，构建了BACE1功能区原核表达载体pMALc2-BACE1。重组质粒经酶切(图2)及测序认证。 M:DNA marker;1:pMALc2-BACE1/EcoRⅠ;2:pMALc2-BACE1/HindⅢ;3:pMALc2-BACE1/EcoRI+HindⅢ;4:pMALc2-BACE1/ScaI
图2 pMALc2-BACE1酶切鉴定电泳图(图略)
2.3 MBP-BACE1融合蛋白的诱导表达 以IPTG诱导转化有pMalc2-BACE1重组质粒的JM109菌，得到MBP-BACE1融合蛋白质的可溶性表达。SDS-PAGE电泳结果显示，与诱导前相比，诱导后可见一条大小与融合蛋白预计分子量一致的约88kD的条带，而且在上清中高表达(图3，泳道3)，凝胶成像分析软件分析可溶性表达目的蛋白达到总蛋白的28%。
2.4 MBP-BACE1融合蛋白的亲和层析及FPLC纯化 以淀粉树脂层析柱亲和层析纯化MBP-BACE1融合蛋白。10%SDS-PAGE电泳鉴定纯化后得到的蛋白质(图3，泳道4、8)。凝胶软件分析纯化达到79%。亲和层析后的MBP- BACE1样品，进行阴离子交换FPLC，收集峰成分进行10%SDS-PAGE电泳鉴定(图3，泳道5、7、9)。凝胶软件分析纯化达到98%。
2.5 BACE1的获取及纯化 Xa因子特异识别切割MBP与BACE1之间的Ile-Glu-Gly-Arg-氨基酸序列，从而切除MBP，获得BACE1。电洗脱及阴离子交换FPLC纯化后的BACE1通过SDS-PAGE电泳鉴定(图4)。软件分析纯度达到99%。
1:pMALc2-BACE1/E.coli JM109not induced by IPTG;2，6:pMALc2-BACE1/E.coli JM109induced by IPTG;3:Supernatant of pMALc2-BACE1/E.coli JM109induced by IPTG;4，8:MBP-BACE1purified by Amylose Resin;5，7，9:MBP-BACE1purified by FPLC;M:Low molecular weight protein markers
图3 MBP-BACE1诱导及纯化蛋白SDS-PAGE电泳图
M:Low molecular weight protein markers;1:BACE1protein purified by FPLC;2:MBP protein purified by FPLC;3.MBP- BACE1purified by FPLC
图4 FPLC纯化BACE1SDS-PAGE电泳图
2.6 BACE1的Western blot鉴定 对BACE1进行免疫印迹实验，结果(图5)显示，在约43kD处出现一与表达蛋白分子量一致的条带。 1:MBP protein purified by FPLC;2:BACE1protein purified by FPLC;
图5 BACE1Western blot鉴定
2.7 FRET方法检测BACE1活性 不同批次纯化的BACE1蛋白样品通过FRET检测，检测结果均一致，显示了BACE1相对于BACE1S标准蛋白质的低活性(图6)。
3 讨论
阿尔茨海默病是一种不可逆的神经退行性疾病，是导致老年痴呆的主要原因。Aβ是AD患者脑组织中淀粉样沉积的主要成分，其可通过诱导神经元凋亡、影响细胞内Ca 2+ 平衡、引起脂质过氧化等众多途径参与AD的病理过程。大量的研究结果表明，Aβ是AD发病的关键因素，抑制Aβ的产生可有效阻止或减轻AD病变。Aβ是淀粉样前体蛋白经过β-分泌酶和γ-分泌酶依次切割的产物。最近，多家实验室利用不同的方法同时发现了具有β-分 图6 BACE1FRET活性随反应时间变化图 泌酶活性的蛋白水解酶BACE(β-site APP cleaving en-zyme) [5] 。随后的实验进一步证实，BACE即为参与Aβ形 成的β-分泌酶。在发现BACE不久，又发现了与其具有 64%氨基酸相似性的同源蛋白，称为BACE2 [6] 。为区别起见，将BACE更名为BACE1。
2001年，Roberds等人进行了BACE1基因敲除小鼠实验。研究显示，BACE1敲除小鼠(BACE1-/-)发育正常，无论是组织形态学、血液流变学、血尿生化的指标，还是行为学、神经生物学的参数，BACE1敲除小鼠和正常小鼠比较没有明显差别 [7，8] 。另一方面，BACE1敲除小鼠和过表达APP的转基因鼠杂交得到的BACE1-/-;APP+复合转基因鼠，其Aβ生成明显减少 [8] 。综合上述转基因鼠的研究结果，可以预见抑制BACE1的活性可以明显降低Aβ的产生，阻止AD的进展，且不产生较大的副作用。由于BACE1抑制剂对AD治疗的可行性，因此，以β-分泌酶为药物作用靶点筛选抑制剂是AD药物研究新的重要任务。而表达大量有较高活性的BACE1及建立适于高通量筛选的BACE1酶活性检测体系则是筛选其抑制剂的前提。
通过原核表达获取大量蛋白的方法在蛋白结构及功能分析方面有广泛的应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料价格低廉;有各种大肠杆菌菌株及与之匹配的具不同特性的质粒可供选择。当然，原核表达活性蛋白也存在缺陷，即在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少糖基化、磷酸化等翻译后修饰而可能影响表达蛋白的生物学构象及活性。
建立筛选BACE1抑制剂的平台及进一步研究BACE1结构与功能关系都需要建立一种检测BACE1活性的方法。体外检测蛋白酶活性的方法有多种。其中，较为经典的方法是高效液相色谱和质谱联用以分离和鉴定酶解产物成分。此方法准确性高，但过程复杂、价格昂贵、无法进行高通量筛选，因此在本课题中，建立了另一灵敏、简便、低廉、适于高通量筛选的BACE1酶活性检测体系-荧光共振能量转移检测(FRET assay)。由于BACE1对APP Swedish突变位点的切割效率比正常APP切割位点高出1000倍左右 [9] ，因此我们在FRET荧光底物中引入了Swedish突变位点Leu-Asp。在本课题中，FRET被证明具有灵敏度高、选择性好、流程简便、可高通量筛选等优点。
BACE1功能区位于N端膜外区46～460位氨基酸，含有2个天冬氨酸蛋白酶活性位点DTGS(93～96位)和DSGT(289～292位) [10] 。在本研究中，我们利用原核表达系统表 达了BACE1功能区，结果显示，所表达的BACE1体现出相对于BACE1S标准蛋白的低活性。近年来对BACE1研究表明，BACE1包含4个N-连接的糖基化位点:Asn(153)、Asn(172)、Asn(223)、Asn(354)以及可形成3个分子内二硫键(Cys278-Cys443、Cys216-Cys420、Cys330-Cys380)的6个半胱氨酸残基 [11] 。由于蛋白的翻译后修饰如糖基化可在一定程度上影响蛋白的正确折叠及稳定性，因而作为原核表达的BACE1，可能因为缺乏这些修饰和加工而影响了其部分活性。
参考文献
1 Cumming JN，Iserloh U，KennedyME.Design and development of BACE-1inhibitors.Curr Opin Drug Discov Devel，2004，7(4):536-556.
2 Luthi U，Schaerer-Brodbeck C，Tanner S，et al.Human beta-secre-tase activity in yeast detected by a novel cellular growth selection sys-tem.Biochim Biophys Acta，2003，1620(1-3):167-178.
3 Bruinzeel W，Yon J，Giovannelli S，et al.Recombinant insect cell ex-pression and purification of human beta-secretase(BACE-1)for X-ray crystallography.Protein Expr Purif，2002，26(1):139-148.
4 常磊，马康涛，张乃蘅.淀粉样前体蛋白和LRP6在大肠杆菌中的表达及其体外相互作用.中国生物化学与分子生物学报，2001，17(2):185-188.
5 Dingwall C.Spotlight on BACE:the secretases as targets for treatment in Alzheimer disease.J Clin Invest，2001，108(9):1243-1246.
6 Fluhrer R，Capell A，Westmeyer G，et al.A non-amyloidogenic func-tion of BACE-2in the secretory pathway.J Neurochem，2002，81(5): 1011-1020.
7 Roberds SL，Anderson J，Basi G，et al.BACE knockout mice are healthy despite lacking the primary beta-secretase activity in brain:implica-tions for Alzheimer's disease therapeutics.Hum Mol Genet，2001，10(12):1317-1324.
8 Luo Y，Bolon B，Kahn S，et al.Mice deficient in BACE1，the Alzheimer'sβ-secretase，have normal phenotype and abolishedβ-amyloid gener-ation.Nature Neurosci，2001，4:231 232.
9 Steinhilb ML，Turner RS，Gaut JR.ELISA analysis of beta-secretase cleavage of the Swedish amyloid precursor protein in the secretory and endocytic pathways.J Neurochem，2002，80(6):1019-1028.
10 Nunan J，Small DH.Regulation of APP cleavage by alpha-，beta-
and gamma-secretases.FEBS Lett，2000，483(1):6-10.
11 Haniu M，Denis P，Young Y.Characterization of Alzheimer's beta-secretase protein BACE:A pepsin family member with unusual proper-ties.J Biol Chem，2000，275(28):21099-21106.
* 基金项目:北京大学985项目资助。 作者单位:100083北京大学基础医学院，生物化学与分子生物学系, 百拇医药(孟 君 杨 颖 李 英 陈 苹 周春燕 马康涛)
方法 利用PCR技术扩增获得全长BACE1，并构建了BACE1功能区的原核表达重组质粒pMALc2-BACE1。重组质粒转化至E.coli JM109，以IPTG诱导MBP-BACE1融合蛋白的表达。经Amylose Resin亲和层析及阴离子交换FPLC纯化MBP-BACE1后，通过Xa因子切割去除MBP标签以获取BACE1。最后，通过电洗脱及阴离子交换FPLC纯化BACE1并用Western blot做了鉴定，以带有APP Swedish突变位点的荧光多肽为底物，荧光共振能量转移(FRET)检测其酶活性。
结果 纯化后的MBP-BACE1及BACE1纯度分别达到98%和99%。酶活性检测显示，所表达的BACE1体现出相对于BACE1S标准蛋白的低活性。
结论 FRET是一种灵敏、简便的检测BACE1活性的方法，为筛选抑制剂建立了检测平台。原核表达的BACE1具有一定活性，为进一步研究BACE1结构与功能关系奠定了基础。
【关键词】 BACE1 原核表达 荧光共振能量转移 β-淀粉样蛋白 阿尔茨海默病
Expression，purification and in vitro activity assay of BACE1in E.coli Meng Jun，Yang Ying，Li Ying，et al.
Department of Biochemistry and Molecular Biology，The School of Basic Medical Sciences， Peking University，Beijing100083.
【Abstract】 Objective To obtain active recombinant BACE1in E.coli and establish a sensitive，convenient assay for BACE1activity in vitro for high-thru screening the inhibitors of BACE1and further researches on the rela-tionship between BACE1's structure and function.Methods The complete coding sequence of BACE1was amplified from a human fetal brain cDNA library using PCR.The recombinant plasmid for the prokaryotic expression of BACE1's function domain，pMALc2-BACE1，was constructed by subclone.After pMALc2-BACE1was transformed into E.coli strain JM109cells，it was induced by IPTG.The induced MBP-BACE1was purified by amylose resin affinity chromatography and Resouse Q ion exchange column under FPLC system，and then was cleavaged by Xa factor.After the target BACE1was separated，it was purified by negative ion exchange FPLC.Finally，the activity of BACE1，which specificity was confirmed by Western blot analysis，was assayed through FRET using a peptide containing APP Swedish site.Results MBP-BACE1and BACE1was highly purified to98%and99%，respectively.The FRET results indi-cated that the recombinant BACE1exhibited relatively low activity compared with the standard BACE1.Conclusion FRETwas a highly sensitive，convenient method for high-thru screening the inhibitors of BACE1.The recombinant
BACE1was of benefit for further researches on the relationship between BACE1's structure and function.
【Key words】 BACE1 prokaryotic expression FRET β-amyloid protein Alzheimer's disease
淀粉样斑块是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的主要病理特征之一，其主要成分β-淀粉样蛋白(β-amy-loid protein，Aβ)在AD的发生、发展中起着重要作用。BACE1(β-site APP cleaving enzyme)，即β-分泌酶，是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)产生Aβ的关键酶。BACE1属于Ⅰ型跨膜蛋白，由501个氨基酸组成，其中46～460位氨基酸为功能活性区域。BACE1通过水解APP670Met-671Asp之间的肽键，生成670个氨基酸的可溶性N末端和包含完整Aβ区的APP跨膜C端。后者经γ分泌酶进一步酶切形成Aβ。最近的研究表明，BACE1基因敲除小鼠脑内的Aβ水平可降低90%，且其生理表型基本正常，显示了BACE1抑制剂在AD治疗中的广阔前景 [1] 。通过酵母或昆虫表达系统表达活性BACE1在最近已见报道 [2，3] 。然而，由于上述系统表达的蛋白量低，且纯化流程复杂，不适合BACE1抑制剂的大规模筛选。而BACE1的原核表达可克服以上缺陷，为筛选特异性抑制剂及研究BACE1结构与功能关系提供大量材料，为最终从根本上治疗AD带来希望。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒及菌株 质粒pMalC2及大肠杆菌JM109菌种为本室保存。pGEM ○ R -T Vector购自Promega公司。
1.1.2 试剂 Pfu DNA Polymerase、Taq DNA Polymerase购自MBI公司。限制性内切酶、T4连接酶购自华美生物工程公司。QIAquick Gel Extraction Kit为QIAGEN公司产品。淀粉树脂为New England Biolabs公司产品。兔抗人BACE1多克隆抗体购自北京宣武医院多肽室。辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体购自北京中山生物技术公司。ECL化学发光试剂为Pharmacia公司产品。人胎脑cDNA文库为Clon-tech公司产品。BACE1蛋白标准品为腺病毒转染昆虫细胞表达的BACE1，购自美国Panvera Company公司。荧光多肽底物Arg-Glu-(EDANS)-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Lys-(DABCYL)-Arg购自Sigma公司。其它试剂为进口或国产分析纯。引物均由北京奥科生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 BACE1的克隆 参考已公布的BACE1核酸序列(gi:6118538)，在其编码区两侧设计引物(上游引物:5'-AATTCGAAATGGCCCAAGCCCTGCCCT-3';下游引物:5'-AGGGATCCGGGCCTCCTCACTTCAGCAG-3')，从人胎脑cD-NA文库中，以Pfu DNA Polymerase通过PCR扩增全长BACE1。反应条件为94℃变性5min，按94℃30s、59℃45s、72℃2min循环30次，最后于72℃延伸10min。
1.2.2 MBP-BACE1原核表达载体的构建 利用Taq DNA Polymerase对BACE1PCR产物进行加A反应并与pGEM○ R -T载体进行TA克隆，BamHI、SalI双酶切鉴定，获得正向插入重组质粒pGEM-BACE1(+)。以pGEM-BACE1(+)为模板，以Pfu DNA Polymerase通过PCR扩增BACE1功能区(即46E-460Y之间序列)相应核酸序列。上游引物为5'-CAGAATTCGAGACCGACGAAGAGCC CG-3';下游引物为5'-CGAAGCTTCTACTCAGTTGGGAGTAC TGG-3'。上下游引物5'端分别引入EcoRI及HindIII酶切位点。PCR反应条件为94℃变性5min，按94℃30s、60℃45s、72℃1.5min循环30次，最后于72℃延伸10min。回收并连接EcoRI、HindIII双酶切的PCR产物及pMALc2载体片段，构建原核表达重组质粒pMALc2-BACE1，EcoRI、HindIII、ScaI酶切鉴定阳性克隆并测序认证。
1.2.3 MBP-BACE1融合蛋白的诱导表达 融合蛋白的诱导表达参照文献 [3] 。
1.2.4 MBP-BACE1融合蛋白的亲和层析及FPLC纯化 对诱导菌进行超声，离心取上清，以0.2ml/min速率上样于淀粉树脂层析柱，充分洗柱后用含10mM麦芽糖的洗脱缓冲液洗脱表达蛋白质，280nm紫外监测并收集峰成分。所收集样品进一步采用Resouse Q柱进行阴离子交换FPLC纯化，Brandford法检测蛋白质浓度。
1.2.5 MBP-BACE1融合蛋白的Xa因子酶切及BACE1的纯化 以Xa因子酶切MBP-BACE1融合蛋白，MBP-BACE1:Xa因子为50:1(质量比)，反应温度27℃，反应时间为12h。Xa因子切割MBP-BACE1的反应体系进行SDS-PAGE电泳分离后，用KCl浸泡分离胶确定目标蛋白位置，将含目标蛋白的凝胶切出并置于装有1×Tris-甘氨酸缓冲液的透析袋，进行电洗脱。电洗脱纯化得到的BACE1样品进一步采用Mono Q柱进行阴离子交换FPLC纯化，收集峰成分，Brandford法检测蛋白质浓度。
1.2.6 BACE1的Western blot鉴定 FPLC纯化后的BACE1经SDS-PAGE电泳后，电转移至NC膜上，进行Western印迹分析。一抗为兔抗人BACE1多克隆抗体(1:500稀释)，二抗为辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG抗体(1:4000稀释)。采用化学发光法显影。
1.2.7 FRET方法检测BACE1活性 以荧光多肽Arg-Glu -(EDANS)-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Lys-(DABCYL)-Arg作为底物，采用荧光共振能量转移方法(Fluorescence Resonance Energy Transfer assay，FRET)对BACE1进行活性检测。酶切反应分为三组:(1)加有BACE1S标准蛋白酶的阳性对照反应体系;(2)BACE1反应体系;(3)不加BACE1，只有底物的阴性对照反应体系;三组反应体系酶的终浓度均为10nM，底物浓度为12.5nM。每个反应体系均设两个平行反应。37℃避光反应30min、60min、90min、120min后分别加入等体积2.5M NaAc终止反应，用荧光分光光度计激发波长(Ex)350nm/释放波长(Em)490nm检测荧光强度。
2 结果
2.1 BACE1基因克隆 从人胎脑cDNA文库中，通过PCR扩增获得编码全长BACE1的核酸序列，约1.5kb(图1)。 M:DNA marker;1:Negative control;2:PCR amplification of BACE1
图1 PCR扩增BACE1全序列电泳鉴定图(图略)
2.2 MBP-BACE1原核表达载体的构建 扩增的全长BACE1与pGEM-T载体进行TA克隆，获得正向插入重组质粒pGEM-BACE1(+)。以pGEM-BACE1(+)为模板，PCR扩增BACE1功能区(46E-460Y)相应核酸序列(约1.3kb)，并插入表达载体pMALc2中，构建了BACE1功能区原核表达载体pMALc2-BACE1。重组质粒经酶切(图2)及测序认证。 M:DNA marker;1:pMALc2-BACE1/EcoRⅠ;2:pMALc2-BACE1/HindⅢ;3:pMALc2-BACE1/EcoRI+HindⅢ;4:pMALc2-BACE1/ScaI
图2 pMALc2-BACE1酶切鉴定电泳图(图略)
2.3 MBP-BACE1融合蛋白的诱导表达 以IPTG诱导转化有pMalc2-BACE1重组质粒的JM109菌，得到MBP-BACE1融合蛋白质的可溶性表达。SDS-PAGE电泳结果显示，与诱导前相比，诱导后可见一条大小与融合蛋白预计分子量一致的约88kD的条带，而且在上清中高表达(图3，泳道3)，凝胶成像分析软件分析可溶性表达目的蛋白达到总蛋白的28%。
2.4 MBP-BACE1融合蛋白的亲和层析及FPLC纯化 以淀粉树脂层析柱亲和层析纯化MBP-BACE1融合蛋白。10%SDS-PAGE电泳鉴定纯化后得到的蛋白质(图3，泳道4、8)。凝胶软件分析纯化达到79%。亲和层析后的MBP- BACE1样品，进行阴离子交换FPLC，收集峰成分进行10%SDS-PAGE电泳鉴定(图3，泳道5、7、9)。凝胶软件分析纯化达到98%。
2.5 BACE1的获取及纯化 Xa因子特异识别切割MBP与BACE1之间的Ile-Glu-Gly-Arg-氨基酸序列，从而切除MBP，获得BACE1。电洗脱及阴离子交换FPLC纯化后的BACE1通过SDS-PAGE电泳鉴定(图4)。软件分析纯度达到99%。
1:pMALc2-BACE1/E.coli JM109not induced by IPTG;2，6:pMALc2-BACE1/E.coli JM109induced by IPTG;3:Supernatant of pMALc2-BACE1/E.coli JM109induced by IPTG;4，8:MBP-BACE1purified by Amylose Resin;5，7，9:MBP-BACE1purified by FPLC;M:Low molecular weight protein markers
图3 MBP-BACE1诱导及纯化蛋白SDS-PAGE电泳图
M:Low molecular weight protein markers;1:BACE1protein purified by FPLC;2:MBP protein purified by FPLC;3.MBP- BACE1purified by FPLC
图4 FPLC纯化BACE1SDS-PAGE电泳图
2.6 BACE1的Western blot鉴定 对BACE1进行免疫印迹实验，结果(图5)显示，在约43kD处出现一与表达蛋白分子量一致的条带。 1:MBP protein purified by FPLC;2:BACE1protein purified by FPLC;
图5 BACE1Western blot鉴定
2.7 FRET方法检测BACE1活性 不同批次纯化的BACE1蛋白样品通过FRET检测，检测结果均一致，显示了BACE1相对于BACE1S标准蛋白质的低活性(图6)。
3 讨论
阿尔茨海默病是一种不可逆的神经退行性疾病，是导致老年痴呆的主要原因。Aβ是AD患者脑组织中淀粉样沉积的主要成分，其可通过诱导神经元凋亡、影响细胞内Ca 2+ 平衡、引起脂质过氧化等众多途径参与AD的病理过程。大量的研究结果表明，Aβ是AD发病的关键因素，抑制Aβ的产生可有效阻止或减轻AD病变。Aβ是淀粉样前体蛋白经过β-分泌酶和γ-分泌酶依次切割的产物。最近，多家实验室利用不同的方法同时发现了具有β-分 图6 BACE1FRET活性随反应时间变化图 泌酶活性的蛋白水解酶BACE(β-site APP cleaving en-zyme) [5] 。随后的实验进一步证实，BACE即为参与Aβ形 成的β-分泌酶。在发现BACE不久，又发现了与其具有 64%氨基酸相似性的同源蛋白，称为BACE2 [6] 。为区别起见，将BACE更名为BACE1。
2001年，Roberds等人进行了BACE1基因敲除小鼠实验。研究显示，BACE1敲除小鼠(BACE1-/-)发育正常，无论是组织形态学、血液流变学、血尿生化的指标，还是行为学、神经生物学的参数，BACE1敲除小鼠和正常小鼠比较没有明显差别 [7，8] 。另一方面，BACE1敲除小鼠和过表达APP的转基因鼠杂交得到的BACE1-/-;APP+复合转基因鼠，其Aβ生成明显减少 [8] 。综合上述转基因鼠的研究结果，可以预见抑制BACE1的活性可以明显降低Aβ的产生，阻止AD的进展，且不产生较大的副作用。由于BACE1抑制剂对AD治疗的可行性，因此，以β-分泌酶为药物作用靶点筛选抑制剂是AD药物研究新的重要任务。而表达大量有较高活性的BACE1及建立适于高通量筛选的BACE1酶活性检测体系则是筛选其抑制剂的前提。
通过原核表达获取大量蛋白的方法在蛋白结构及功能分析方面有广泛的应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料价格低廉;有各种大肠杆菌菌株及与之匹配的具不同特性的质粒可供选择。当然，原核表达活性蛋白也存在缺陷，即在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少糖基化、磷酸化等翻译后修饰而可能影响表达蛋白的生物学构象及活性。
建立筛选BACE1抑制剂的平台及进一步研究BACE1结构与功能关系都需要建立一种检测BACE1活性的方法。体外检测蛋白酶活性的方法有多种。其中，较为经典的方法是高效液相色谱和质谱联用以分离和鉴定酶解产物成分。此方法准确性高，但过程复杂、价格昂贵、无法进行高通量筛选，因此在本课题中，建立了另一灵敏、简便、低廉、适于高通量筛选的BACE1酶活性检测体系-荧光共振能量转移检测(FRET assay)。由于BACE1对APP Swedish突变位点的切割效率比正常APP切割位点高出1000倍左右 [9] ，因此我们在FRET荧光底物中引入了Swedish突变位点Leu-Asp。在本课题中，FRET被证明具有灵敏度高、选择性好、流程简便、可高通量筛选等优点。
BACE1功能区位于N端膜外区46～460位氨基酸，含有2个天冬氨酸蛋白酶活性位点DTGS(93～96位)和DSGT(289～292位) [10] 。在本研究中，我们利用原核表达系统表 达了BACE1功能区，结果显示，所表达的BACE1体现出相对于BACE1S标准蛋白的低活性。近年来对BACE1研究表明，BACE1包含4个N-连接的糖基化位点:Asn(153)、Asn(172)、Asn(223)、Asn(354)以及可形成3个分子内二硫键(Cys278-Cys443、Cys216-Cys420、Cys330-Cys380)的6个半胱氨酸残基 [11] 。由于蛋白的翻译后修饰如糖基化可在一定程度上影响蛋白的正确折叠及稳定性，因而作为原核表达的BACE1，可能因为缺乏这些修饰和加工而影响了其部分活性。
参考文献
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11 Haniu M，Denis P，Young Y.Characterization of Alzheimer's beta-secretase protein BACE:A pepsin family member with unusual proper-ties.J Biol Chem，2000，275(28):21099-21106.
* 基金项目:北京大学985项目资助。 作者单位:100083北京大学基础医学院，生物化学与分子生物学系, 百拇医药(孟 君 杨 颖 李 英 陈 苹 周春燕 马康涛)