参麦注射液对缺氧/缺糖/复氧诱导神经细胞凋亡的影响(基金项目ˇ)
ˇ 基金项目:国家中医药管理局立项(中医药科:00-01L P06号)，正大青春宝药业有限公司资助课题
【摘要】 目的 探讨参麦注射液对缺氧/缺糖/复氧诱导神经细胞损伤的影响，阐明参麦注射液治疗缺血性中风急性期的脑保护作用机制。方法 用孕17～18天SD胎鼠的大脑皮层做原代神经细胞培养，制作缺氧/缺糖/复氧致神经细胞损伤模型，采用Annexin V/PI双染色法行流式细胞仪检测，定量分析参麦注射液对神经细胞凋亡和坏死百分率的影响。结果 参麦注射液能降低缺氧/缺糖/复氧原代培养神经细胞的凋亡率和坏死率。结论 参麦注射液治疗急性缺血性中风的疗效机制与提高神经细胞耐缺血缺氧能力，抑制细胞凋亡，减轻坏死有关。
关键词 参麦注射液 原代培养 神经细胞 缺氧/缺糖/复氧
The effect of Shenmai Injection on the injured heurons following hypoxia/hypogycemia/reoxygenation
Zhang Genming，Sun Sulun，Zhu Lingqun，et al.
Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100700.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Shenmai Injection(SMI)on the injured neurons following hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation and to clarify the intrinsic mechanism of SMI treating acute ischemic apoplexy and protecting brain. Methods The cortical neurons of E17～18 days fetal rat was primarily cultured. The injured model of primary cultured cortical neurons following hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation was established. Effect of SMI on the rate of apoptosis as well as necrosis of neurons induced by hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation was analyzed quantitatively by flow cytometry. Results SMI could reduce the rate of apoptosis and necrosis of neurons following hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation remarkably. Conclusion The intrinsic mechanism of SMI treating acute ischemic apoplexy has relation to the fact that SMI can inhibit the apoptosis and necrosis of neurons induced by hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation.
Key words Shenmai Injection primarily cultured neurons hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation
参麦注射液是由古方“生脉散”衍生的一种中药注射剂，有研究表明参麦注射液可显著提高脑血流量，有抑制氧自由基生成和抗脂质过氧化作用，稳定细胞膜、溶酶体膜和线粒体膜，从而减轻脑细胞的缺血性损伤，使急性脑梗塞病人临床症状得以好转[1]。本实验拟通过观察参麦注射液对缺氧/缺糖/复氧诱导神经细胞凋亡和坏死的影响，进一步探究其神经细胞保护机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 5%CO2培养箱:美国HERAEUS-BB16型。超净工作台:JJT1300型，北京半导体设备仪器厂。倒置相差显微镜:日本OLYMPUS IMT-2型。低温高速离心机:国BIOFUGE28RS型。流式细胞仪:美国B.D公司E1591型。
1.1.2 药品与试剂 参麦注射液(SM):由红参、麦冬组成，每支10ml，含生药各1g，正大青春宝药业有限公司提供，生产批号:943033594;DMEM培养基、胎牛血清及马血清购自Gibco公司;Hepes为B.M公司产品;青霉素、链霉素、多聚赖氨酸、胰蛋白酶、阿糖胞苷及Annexin V/PI均购自Sigma公司。
1.1.3 动物 孕18天的SD大鼠，由北京维通利华实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 原代神经细胞培养[2，3]乙醚麻醉SD孕鼠，无菌操作取出胎鼠，置于预先配制的解剖液中，取脑并分离脑区，剥去脑膜组织后将大脑皮层剪碎(以上过程在冰上进行)。以终浓度为0.125%的胰酶，37℃水浴消化10min。过200目筛将脑组织悬液过滤到一50ml离心管中，1000rpm离心10min后弃上清，加解剖液40ml反复吹打，待细胞分散后再离心10min弃上清，加接种液吹散细胞，静置后取细胞悬液，调细胞数为1×106/ml。接种于预先用0.01%左旋多聚赖氨酸处理过夜的六孔板，每孔2ml。培养板置于37℃、5%CO2培养箱中。接种24h后更换培养液(全换)。神经细胞培养至第4天时，加入阿糖胞苷(终浓度10μM)作用24h以抑制胶质细胞增殖。以后，每3～5天换一次培养液，每次换半液。培养10天后进行实验。
1.2.2 缺氧/缺糖/复氧模型制作[4]及分组 取培养10天的大鼠大脑皮层神经细胞，进行模型制作和分组实验(每组5孔)。(1)正常对照组:以DMEM液继续培养18h;(2)模型组:换以无糖Earles培养液，置于37℃、5%CO2氮气缺氧罐中缺糖/缺氧培养4h，取出换以DMEM培养液，放回37℃、5%CO2培养箱中复氧14h;(3)参麦组:换以含参麦注射液终浓度为1g/L的无糖Earles培养液，置于37℃、5%CO2氮气缺氧罐中缺糖/缺氧培养4h，之后换以含参麦注射液终浓度为1g/L的DMEM培养液，放回37℃、5%CO2培养箱中复氧14h。分别收集细胞进行相关实验。
1.2.3 凋亡细胞检测 各组细胞分别用0.125%的胰蛋白酶和0.1%EDTA37℃消化细胞5min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管1000rpm离心10min，弃去培养液，PBS洗2次，加孵育缓冲液1μl、AnnexinV-FITC和PI各5μl，用Vortex混匀，在室温下避光孵育15min，再加400μl孵育缓冲液，过200目尼龙网，然后上流式细胞仪检测。应用Cell Quest软件获取细胞10000个，分别对凋亡、坏死及正常细胞计数，并绘制双变量流式细胞仪散点图。
1.3 统计学处理 以单向方差分析进行组间比较，数据用x±s表示。
2 结果
见表1。
表1 参麦对缺氧/缺糖/复氧诱导原代皮层神经细胞凋亡的影响 (x±s，%)(略)注:与正常组比较， ˇ P<0.01;与模型组比较， △ P<0.01
从表1模型组神经细胞凋亡率和坏死率均明显高于正常组，正常细胞率则低正常组;参麦组正常细胞率高于模型组，而神经细胞凋亡率和坏死率均低于模型组。经统计学处理，P值均<0.01。
3 讨论
急性脑梗塞时，由于血流中断，缺血中心区脑组织完全缺血缺氧，很快发生不可逆坏死;而半暗带及其周边带是坏死灶中心和正常组织间的移行区，由于侧支循环的存在尚可得到一定的血流供应，但因血液供应不足和内环境的改变，神经细胞发生不同程度的损伤，其主要表现形式为凋亡。随时间和治疗的不同，半暗带区神经细胞呈现两种发展趋势，缺血时间延长或得不到有效的保护性治疗，则缺血细胞发生凋亡，直至坏死，此时梗塞面积将进一步扩大;如果在缺血早期及时合理地使用神经细胞保护药物，增加神经细胞耐缺血缺氧及对抗毒性病理产物侵袭的能力，则能有效地抑制细胞凋亡并可在一定程度上促使早期凋亡神经细胞发生逆转，减轻脑损伤，促使半暗带向正常组织转化或先定半暗带，这对于缺血性中风急性期患者的预后至关重要。
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。这一特征是细胞发生凋亡时的一种早期和普遍事件，发生在与细胞凋亡相关的其他几种事件之前，AnnexinV是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和性，因此该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS，从而用于早期凋亡细胞的检测。细胞凋亡晚期或已坏死，细胞膜完整性遭到破坏，通透性进一步增加，荧光染料PI进入细胞内，DNA可被PI着染产生红色荧光，而正常细胞和早期凋亡细胞对PI有拒染性，因而不着色。采用AnnexinV/PI双染色法进行流式细胞仪检测可以将正常细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞区分开来，克服了PI单染法的缺陷，能更准确地反映细胞的损伤情况。
参麦注射液的主要成分为人参、麦冬，人参大补元气，麦冬清心养肺滋阴，近年来研究表明，人参能减少缺血组织的能量代谢和超微结构损伤，避免细胞内溶酶释放和脂质过氧化物增多[1]。麦冬可增强缺氧状态下糖的有氧代谢、三羧酸循环及氧化磷酸化，使缺氧组织中糖原明显升高，乳酸明显降低，从而改善细胞内的能量缺乏及细胞的缺氧状态[5]。而氧化应激和能量代谢障碍均是导致神经细胞凋亡和坏死的重要原因。本实验采用Annexin V/PI双染色法对缺氧/缺糖/复氧损伤神经细胞进行流式细胞仪检测，可以定量分析缺氧/缺糖/复氧情况下，神经细胞凋亡和坏死的比率，结果表明参麦注射液能够增强神经细胞耐
缺血缺氧能力，抑制神经细胞凋亡，减轻神经细胞坏死，对经, 百拇医药(张根明 孙塑伦 朱陵群 王硕仁 高颖 张壮)
【摘要】 目的 探讨参麦注射液对缺氧/缺糖/复氧诱导神经细胞损伤的影响，阐明参麦注射液治疗缺血性中风急性期的脑保护作用机制。方法 用孕17～18天SD胎鼠的大脑皮层做原代神经细胞培养，制作缺氧/缺糖/复氧致神经细胞损伤模型，采用Annexin V/PI双染色法行流式细胞仪检测，定量分析参麦注射液对神经细胞凋亡和坏死百分率的影响。结果 参麦注射液能降低缺氧/缺糖/复氧原代培养神经细胞的凋亡率和坏死率。结论 参麦注射液治疗急性缺血性中风的疗效机制与提高神经细胞耐缺血缺氧能力，抑制细胞凋亡，减轻坏死有关。
关键词 参麦注射液 原代培养 神经细胞 缺氧/缺糖/复氧
The effect of Shenmai Injection on the injured heurons following hypoxia/hypogycemia/reoxygenation
Zhang Genming，Sun Sulun，Zhu Lingqun，et al.
Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing100700.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of Shenmai Injection(SMI)on the injured neurons following hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation and to clarify the intrinsic mechanism of SMI treating acute ischemic apoplexy and protecting brain. Methods The cortical neurons of E17～18 days fetal rat was primarily cultured. The injured model of primary cultured cortical neurons following hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation was established. Effect of SMI on the rate of apoptosis as well as necrosis of neurons induced by hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation was analyzed quantitatively by flow cytometry. Results SMI could reduce the rate of apoptosis and necrosis of neurons following hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation remarkably. Conclusion The intrinsic mechanism of SMI treating acute ischemic apoplexy has relation to the fact that SMI can inhibit the apoptosis and necrosis of neurons induced by hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation.
Key words Shenmai Injection primarily cultured neurons hypoxia/hypoglycemia/reoxygenation
参麦注射液是由古方“生脉散”衍生的一种中药注射剂，有研究表明参麦注射液可显著提高脑血流量，有抑制氧自由基生成和抗脂质过氧化作用，稳定细胞膜、溶酶体膜和线粒体膜，从而减轻脑细胞的缺血性损伤，使急性脑梗塞病人临床症状得以好转[1]。本实验拟通过观察参麦注射液对缺氧/缺糖/复氧诱导神经细胞凋亡和坏死的影响，进一步探究其神经细胞保护机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 5%CO2培养箱:美国HERAEUS-BB16型。超净工作台:JJT1300型，北京半导体设备仪器厂。倒置相差显微镜:日本OLYMPUS IMT-2型。低温高速离心机:国BIOFUGE28RS型。流式细胞仪:美国B.D公司E1591型。
1.1.2 药品与试剂 参麦注射液(SM):由红参、麦冬组成，每支10ml，含生药各1g，正大青春宝药业有限公司提供，生产批号:943033594;DMEM培养基、胎牛血清及马血清购自Gibco公司;Hepes为B.M公司产品;青霉素、链霉素、多聚赖氨酸、胰蛋白酶、阿糖胞苷及Annexin V/PI均购自Sigma公司。
1.1.3 动物 孕18天的SD大鼠，由北京维通利华实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 原代神经细胞培养[2，3]乙醚麻醉SD孕鼠，无菌操作取出胎鼠，置于预先配制的解剖液中，取脑并分离脑区，剥去脑膜组织后将大脑皮层剪碎(以上过程在冰上进行)。以终浓度为0.125%的胰酶，37℃水浴消化10min。过200目筛将脑组织悬液过滤到一50ml离心管中，1000rpm离心10min后弃上清，加解剖液40ml反复吹打，待细胞分散后再离心10min弃上清，加接种液吹散细胞，静置后取细胞悬液，调细胞数为1×106/ml。接种于预先用0.01%左旋多聚赖氨酸处理过夜的六孔板，每孔2ml。培养板置于37℃、5%CO2培养箱中。接种24h后更换培养液(全换)。神经细胞培养至第4天时，加入阿糖胞苷(终浓度10μM)作用24h以抑制胶质细胞增殖。以后，每3～5天换一次培养液，每次换半液。培养10天后进行实验。
1.2.2 缺氧/缺糖/复氧模型制作[4]及分组 取培养10天的大鼠大脑皮层神经细胞，进行模型制作和分组实验(每组5孔)。(1)正常对照组:以DMEM液继续培养18h;(2)模型组:换以无糖Earles培养液，置于37℃、5%CO2氮气缺氧罐中缺糖/缺氧培养4h，取出换以DMEM培养液，放回37℃、5%CO2培养箱中复氧14h;(3)参麦组:换以含参麦注射液终浓度为1g/L的无糖Earles培养液，置于37℃、5%CO2氮气缺氧罐中缺糖/缺氧培养4h，之后换以含参麦注射液终浓度为1g/L的DMEM培养液，放回37℃、5%CO2培养箱中复氧14h。分别收集细胞进行相关实验。
1.2.3 凋亡细胞检测 各组细胞分别用0.125%的胰蛋白酶和0.1%EDTA37℃消化细胞5min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，移入离心管1000rpm离心10min，弃去培养液，PBS洗2次，加孵育缓冲液1μl、AnnexinV-FITC和PI各5μl，用Vortex混匀，在室温下避光孵育15min，再加400μl孵育缓冲液，过200目尼龙网，然后上流式细胞仪检测。应用Cell Quest软件获取细胞10000个，分别对凋亡、坏死及正常细胞计数，并绘制双变量流式细胞仪散点图。
1.3 统计学处理 以单向方差分析进行组间比较，数据用x±s表示。
2 结果
见表1。
表1 参麦对缺氧/缺糖/复氧诱导原代皮层神经细胞凋亡的影响 (x±s，%)(略)注:与正常组比较， ˇ P<0.01;与模型组比较， △ P<0.01
从表1模型组神经细胞凋亡率和坏死率均明显高于正常组，正常细胞率则低正常组;参麦组正常细胞率高于模型组，而神经细胞凋亡率和坏死率均低于模型组。经统计学处理，P值均<0.01。
3 讨论
急性脑梗塞时，由于血流中断，缺血中心区脑组织完全缺血缺氧，很快发生不可逆坏死;而半暗带及其周边带是坏死灶中心和正常组织间的移行区，由于侧支循环的存在尚可得到一定的血流供应，但因血液供应不足和内环境的改变，神经细胞发生不同程度的损伤，其主要表现形式为凋亡。随时间和治疗的不同，半暗带区神经细胞呈现两种发展趋势，缺血时间延长或得不到有效的保护性治疗，则缺血细胞发生凋亡，直至坏死，此时梗塞面积将进一步扩大;如果在缺血早期及时合理地使用神经细胞保护药物，增加神经细胞耐缺血缺氧及对抗毒性病理产物侵袭的能力，则能有效地抑制细胞凋亡并可在一定程度上促使早期凋亡神经细胞发生逆转，减轻脑损伤，促使半暗带向正常组织转化或先定半暗带，这对于缺血性中风急性期患者的预后至关重要。
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。这一特征是细胞发生凋亡时的一种早期和普遍事件，发生在与细胞凋亡相关的其他几种事件之前，AnnexinV是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和性，因此该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS，从而用于早期凋亡细胞的检测。细胞凋亡晚期或已坏死，细胞膜完整性遭到破坏，通透性进一步增加，荧光染料PI进入细胞内，DNA可被PI着染产生红色荧光，而正常细胞和早期凋亡细胞对PI有拒染性，因而不着色。采用AnnexinV/PI双染色法进行流式细胞仪检测可以将正常细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞区分开来，克服了PI单染法的缺陷，能更准确地反映细胞的损伤情况。
参麦注射液的主要成分为人参、麦冬，人参大补元气，麦冬清心养肺滋阴，近年来研究表明，人参能减少缺血组织的能量代谢和超微结构损伤，避免细胞内溶酶释放和脂质过氧化物增多[1]。麦冬可增强缺氧状态下糖的有氧代谢、三羧酸循环及氧化磷酸化，使缺氧组织中糖原明显升高，乳酸明显降低，从而改善细胞内的能量缺乏及细胞的缺氧状态[5]。而氧化应激和能量代谢障碍均是导致神经细胞凋亡和坏死的重要原因。本实验采用Annexin V/PI双染色法对缺氧/缺糖/复氧损伤神经细胞进行流式细胞仪检测，可以定量分析缺氧/缺糖/复氧情况下，神经细胞凋亡和坏死的比率，结果表明参麦注射液能够增强神经细胞耐
缺血缺氧能力，抑制神经细胞凋亡，减轻神经细胞坏死，对经, 百拇医药(张根明 孙塑伦 朱陵群 王硕仁 高颖 张壮)