蝎毒抗癌多肽对辐射小鼠免疫防护作用的实验研究
【摘要】 目的 研究蝎毒抗癌多肽(APBMV)对辐射损伤小鼠免疫功能的防护作用。方法 小鼠60只，随机均分为正常对照组、照射对照组、照射中药组共3组，照射中药组采取腹腔灌注APBMV结合X线照射。观察各组白细胞计数、脾脏指数、胸腺指数及免疫荧光染色法和流式细胞仪测定外周血T淋巴细胞亚群等指标。结果 照射对照组的白细胞计数、脾脏指数、胸腺指数、CD4、CD8亚群与其它两组比较均明显下降(P<0.01)，而照射中药组虽有下降，但与正常对照组对比差异无显著性。结论 APBMV对辐射损伤小鼠免疫功能有一定改善及保护作用。
Yang Zhihua，Xiao Guiyuan，Kong Tianhan
Department of Oncology，Central Hospital of Zhanjiang，Guangdong Medecal College，Zhanjiang524037.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of antineoplastic polypeptide from buthus martensii venom(APBMV)on immune function in radiated mice with radiation injury.Methods 60mice were average divide randomˉly into3groups:control group，radiotherapy(RT)group and the comparing with RT and APBMV group.WBC count，thymus index，spleen index，T lymphocyte subsets of in peripheral blood mice was determined by indirect immunofluoˉrescence and flow cytometer were used as the parameters.Results WBC count，thymus index，spleen index，T lymˉphocyte subsets of RT group were lower than two irradiated groups(P<0.01).Compared with the normal control group，the results of all parameters on RT+PABMV group were no differences(P>0.05).Conclusion Antineoplasˉtic polypeptide from buthus martensii venom(APBMV)can improve and protect the immune function in radiated mice with radiation injury.
Key words scorpion venom peptide immune function radiation
目前在医疗方面，放射诊断与治疗的新技术、新设备不断出现，使职业性受照射人员数量增加，而且癌症患者进行放疗期间也可导致机体免疫功能低下，有的甚至被迫终止治疗。如何进行辐射防护，已日益受到各学者的重视。蝎毒抗癌多肽(antineoplastic polypeptide from buthus martensii venom，APBMV)是从蝎毒中分离出的抗肿瘤有效成分 [1] ，研究证明APBMV对多种肿瘤细胞及移植癌有明显的抑制作用 [2～4] 。本研究主要是探讨APBMV对受X射线辐射损伤小鼠免疫功能防护作用的研究。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 APBMV由广州医学院蛇毒研究所提供，系从东亚钳蝎蝎毒中采用常规方法进行分离，HPLC法分析监测分离效果，经冷冻干燥后-20℃保存，临用前用生理盐水配制成所需浓度。小鼠T细胞单克隆抗体及第二荧光抗体:抗小鼠CD4、CD8单克隆抗体为大鼠IgG(Coulter-immunotech China)，FITC标记抗体为兔抗大鼠IgG(武汉博士德公司)。
1.2 动物 昆明种小鼠，雄性，7～8周龄，体重(20±2)g，清洁级，由广东医学院实验中心提供。
1.3 照射条件 Varian直线加速器治疗机，把10只小鼠放入15cm×15cm的有机玻璃盒，盒上盖1cm厚有机玻璃，小鼠呈分散状态，源皮距为100cm，照射面积15cm×15cm，照射剂量率为2Gy/min，总剂量为6Gy，一次性全身照射。
1.4 方法
1.4.1 分组与给药方法 实验小鼠随机分为3组，每组20只。①正常对照组(Control):等体积生理盐水腹腔注射，每日1次，共10天，不行X线照射;②照射对照组(RT):予正常对照组一样的腹腔注射生理盐水，在第4天行X线照射;③照射中药组(RT+APBMV):予腹腔注射APBMV0.06mg/(kg·d)(APBMV的给药剂量参照其半致死量，并经预实验确定)，共10天，在第4天行X线照射。
1.4.2 外周血白细胞计数 剪尾采血20μl/只，按常规方法计数。
1.4.3 免疫器官指数的测定 末次给药24h后，眼眶放血处死小鼠，称体重，解剖取胸腺和脾脏，并用电子天平精密称重，计算各组小鼠的胸腺指数及脾指数。
1.4.4 免疫荧光染色法测定外周血T淋巴细胞亚群 末次给药后24h，小鼠摘眼球取血，用肝素抗凝(50U/ml)。分为2管，每管0.1ml，分别加入抗CD4、抗CD8McAb，充分混匀，温育45min，用细胞洗液洗2次，离心1000r/min×2min，弃上清，加稀释的荧光标记第二抗体0.1ml，温育45min，洗1次，弃上清，加红细胞溶解液3ml，充分摆动2～3min，待红细胞完全溶解后，离心1000r/min×2min，再用细胞洗液洗1次，离心弃上清，余约0.5ml细胞悬液，加固定液50μl。以上操作在室温(12～15℃)下进行。染色标本台盼兰染色，死细胞率<5%。在FACS-420型流式细胞仪(BD公司)上计数淋巴细胞3000个，数据和图像输入HP-300Consort30计算机上用Cellquest软件分析处理检测结果。从抽血至分析在8h内完成。
1.4.5 统计学处理 采用SPSS10.0软件分析包进行t检验、方差分析、相关分析。
2 结果
2.1 APBMV对小鼠外周血白细胞及免疫器官指数的影响 单纯照射组与对照组相比较，外周血白细胞、胸腺指数、脾脏指数均急剧下降(P<0.01);加用APBMV照射后外周血白细胞下降不大，胸腺指数、脾脏指数也维持正常水平(P>0.05)(见表1)。
2.2 T淋巴细胞CD4、CD8亚群变化 与正常组对比，两照射组的CD4、CD8亚群比例，CD4/CD8值均有下降，但单纯照射组与对照组及加APBMV照射组比较差异有显著性(P<0.01)。而加APBMV照射组与正常对照组比较差异无统计学意义(见表2)。
表1 APBMV对小鼠外周血白细胞及免疫器官指数的影响 (X±s)(略)
注:与正常对照组比较， ˇ P<0.01;与照射对照组比较， ˇˇ P<0.01
表2 各组小鼠T淋巴细胞CD4、CD8亚群比例及CD4/CD8 (X±s)(略)
注:与正常对照组比较， ˇ P<0.01;与照射对照组比较， ˇˇ P<0.01
3 讨论
直线加速器是现今放射治疗常用的机器，目前国内约有70%以上恶性肿瘤患者需要X射线放疗 [5] 。可是电离辐射常对骨髓造血系统及免疫系统造成损伤，尤其是免疫功能低下使患者处于对细菌、病毒等病原体和其他损伤因子的高敏状态，影响了患者生存质量，促进了病情恶化。本研究将蝎毒抗癌多肽(APBMV)结合放
疗以观察蝎毒抗癌多肽对受X射线照射小鼠免疫功能的影响。
脾脏、胸腺是参与免疫功能调节的免疫器官，是高辐射敏感的细胞群，辐射作用于这些细胞群使机体免疫功能降低，从而使得脾脏指数、胸腺指数明显降低。骨髓是另一高辐射敏感组织，如骨髓抑制易引起外周血白细胞下降。本实验结果显示，经用APBMV的小鼠X线照射后脾脏指数、胸腺指数、外周血白细胞均无明显下降，明显高于单纯照射组(P<0.01)。说明了APBMV对免疫器官有一定的保护作用，并降低骨髓细胞对辐射敏感性，对造血系统起防辐射作用。对脾脏的保护作用可能是APBMV增强脾细胞混合淋巴细胞反应和迟发超敏反应，拮抗辐射引起的小鼠脾细胞SRBC抗体形成能力降低 [6] 。
当机体受到大剂量电离辐射后使得机体免疫活性细胞数量减少，主要是对辐射最敏感的T淋巴细胞下降 [7] 。本研究通过免疫荧光染色法和流式细胞仪测定外周血T淋巴细胞亚群，实验结果表明经X线照射后小鼠T淋巴细胞CD4、CD8亚群、CD4/CD8下降明显，与正常组对照组有显著下降(P<0.01);加用APBMV后T淋巴细胞CD4、CD8亚群下降不大(P>0.05)，CD4/CD8与正常对照差异无显著性。T淋巴细胞CD4、CD8亚群对射线的敏感性有不同的研究，有的学者认为是一致性的 [8] ，近年来研究认为CD8亚群相对高些 [9，10] 。上述结果表明，蝎毒抗癌多肽对受辐射损伤 小鼠免疫功能有保护及提高作用，起到辐射防护作用，其具体作用靶点、作用机制有待深入研究。
参考文献
1 孔天翰，肖桂元，周少雄，等.7种蝎毒的高效液相分析及毒理学研究.河南医科大学学报，1999，34(1):63-66.
2 魏玲，孔天翰，董伟华.东亚钳蝎毒抗癌多肽对人肿瘤细胞系和动物移植瘤的作用.中国癌症杂志，2002，12(2):97-101.
3 Lepple WA，Berweck s，RohmigM，et al.K+channels and the intracelˉlular calcium signal in human melanoma cell proliferation.J Membr Biˉol，1996，15(2):149-153.
4 Devaux C，Moreau E，Goyffon M，et al.Construction and functional eˉvaluation of a single-chain antibody fragment that neutralizes toxin AahI from the venom of the scorpion Androctonus australis hector.Eur J Biochem，2001，268(3):694-702.
5 殷蔚伯，谷铣之.肿瘤放射治疗学，第3版.北京:中国协和医科大学出版社，2002，15.
6 Freedman BD，Fleischmann BK，Punt JA，et al.Identification of Kv1.1expression by murine CD4-CD8-thymocytes，A role for voltage-dependent K + channels in murine thymocyte development.J Biol Chem，1995，270(38):22406-22411.
7 刘志辉，孟庆勇.多糖抗辐射研究现状.中华放射医学与防护杂志，2003，23(1):70-71.
8 Nakamura N，Kusunoki Y，Akiyama M.Radiosensitivity of CD4or CD8positive human T lymphocytes by an in vitro formation assay.Radiat Res，1990，23(2):224.
9 Seki H，Iwai K，Kanegane H，et al.Differential protective action of cyˉtokines on radiation induced apoptosis of peripheral lymphocyte subpopuˉlations.Cell Immunol，1995，163:30-36.
10 Crolmpton NEA，Pzsabin M，A versatile and rapid assay to radiosensiˉtivity of peripheral blood leukocyte based on DNA and surface marker assessment of cytotoxicity.Radiat Res，1997，147:55.
(收稿日期:2004-07-12)
作者单位:524037广东医学院附属湛江中心人民医院肿瘤中心
510182广州医学院蛇毒研究所
(编辑毅文), 百拇医药(杨志华 肖桂元 孔天翰)
Yang Zhihua，Xiao Guiyuan，Kong Tianhan
Department of Oncology，Central Hospital of Zhanjiang，Guangdong Medecal College，Zhanjiang524037.
【Abstract】 Objective To investigate the effect of antineoplastic polypeptide from buthus martensii venom(APBMV)on immune function in radiated mice with radiation injury.Methods 60mice were average divide randomˉly into3groups:control group，radiotherapy(RT)group and the comparing with RT and APBMV group.WBC count，thymus index，spleen index，T lymphocyte subsets of in peripheral blood mice was determined by indirect immunofluoˉrescence and flow cytometer were used as the parameters.Results WBC count，thymus index，spleen index，T lymˉphocyte subsets of RT group were lower than two irradiated groups(P<0.01).Compared with the normal control group，the results of all parameters on RT+PABMV group were no differences(P>0.05).Conclusion Antineoplasˉtic polypeptide from buthus martensii venom(APBMV)can improve and protect the immune function in radiated mice with radiation injury.
Key words scorpion venom peptide immune function radiation
目前在医疗方面，放射诊断与治疗的新技术、新设备不断出现，使职业性受照射人员数量增加，而且癌症患者进行放疗期间也可导致机体免疫功能低下，有的甚至被迫终止治疗。如何进行辐射防护，已日益受到各学者的重视。蝎毒抗癌多肽(antineoplastic polypeptide from buthus martensii venom，APBMV)是从蝎毒中分离出的抗肿瘤有效成分 [1] ，研究证明APBMV对多种肿瘤细胞及移植癌有明显的抑制作用 [2～4] 。本研究主要是探讨APBMV对受X射线辐射损伤小鼠免疫功能防护作用的研究。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 APBMV由广州医学院蛇毒研究所提供，系从东亚钳蝎蝎毒中采用常规方法进行分离，HPLC法分析监测分离效果，经冷冻干燥后-20℃保存，临用前用生理盐水配制成所需浓度。小鼠T细胞单克隆抗体及第二荧光抗体:抗小鼠CD4、CD8单克隆抗体为大鼠IgG(Coulter-immunotech China)，FITC标记抗体为兔抗大鼠IgG(武汉博士德公司)。
1.2 动物 昆明种小鼠，雄性，7～8周龄，体重(20±2)g，清洁级，由广东医学院实验中心提供。
1.3 照射条件 Varian直线加速器治疗机，把10只小鼠放入15cm×15cm的有机玻璃盒，盒上盖1cm厚有机玻璃，小鼠呈分散状态，源皮距为100cm，照射面积15cm×15cm，照射剂量率为2Gy/min，总剂量为6Gy，一次性全身照射。
1.4 方法
1.4.1 分组与给药方法 实验小鼠随机分为3组，每组20只。①正常对照组(Control):等体积生理盐水腹腔注射，每日1次，共10天，不行X线照射;②照射对照组(RT):予正常对照组一样的腹腔注射生理盐水，在第4天行X线照射;③照射中药组(RT+APBMV):予腹腔注射APBMV0.06mg/(kg·d)(APBMV的给药剂量参照其半致死量，并经预实验确定)，共10天，在第4天行X线照射。
1.4.2 外周血白细胞计数 剪尾采血20μl/只，按常规方法计数。
1.4.3 免疫器官指数的测定 末次给药24h后，眼眶放血处死小鼠，称体重，解剖取胸腺和脾脏，并用电子天平精密称重，计算各组小鼠的胸腺指数及脾指数。
1.4.4 免疫荧光染色法测定外周血T淋巴细胞亚群 末次给药后24h，小鼠摘眼球取血，用肝素抗凝(50U/ml)。分为2管，每管0.1ml，分别加入抗CD4、抗CD8McAb，充分混匀，温育45min，用细胞洗液洗2次，离心1000r/min×2min，弃上清，加稀释的荧光标记第二抗体0.1ml，温育45min，洗1次，弃上清，加红细胞溶解液3ml，充分摆动2～3min，待红细胞完全溶解后，离心1000r/min×2min，再用细胞洗液洗1次，离心弃上清，余约0.5ml细胞悬液，加固定液50μl。以上操作在室温(12～15℃)下进行。染色标本台盼兰染色，死细胞率<5%。在FACS-420型流式细胞仪(BD公司)上计数淋巴细胞3000个，数据和图像输入HP-300Consort30计算机上用Cellquest软件分析处理检测结果。从抽血至分析在8h内完成。
1.4.5 统计学处理 采用SPSS10.0软件分析包进行t检验、方差分析、相关分析。
2 结果
2.1 APBMV对小鼠外周血白细胞及免疫器官指数的影响 单纯照射组与对照组相比较，外周血白细胞、胸腺指数、脾脏指数均急剧下降(P<0.01);加用APBMV照射后外周血白细胞下降不大，胸腺指数、脾脏指数也维持正常水平(P>0.05)(见表1)。
2.2 T淋巴细胞CD4、CD8亚群变化 与正常组对比，两照射组的CD4、CD8亚群比例，CD4/CD8值均有下降，但单纯照射组与对照组及加APBMV照射组比较差异有显著性(P<0.01)。而加APBMV照射组与正常对照组比较差异无统计学意义(见表2)。
表1 APBMV对小鼠外周血白细胞及免疫器官指数的影响 (X±s)(略)
注:与正常对照组比较， ˇ P<0.01;与照射对照组比较， ˇˇ P<0.01
表2 各组小鼠T淋巴细胞CD4、CD8亚群比例及CD4/CD8 (X±s)(略)
注:与正常对照组比较， ˇ P<0.01;与照射对照组比较， ˇˇ P<0.01
3 讨论
直线加速器是现今放射治疗常用的机器，目前国内约有70%以上恶性肿瘤患者需要X射线放疗 [5] 。可是电离辐射常对骨髓造血系统及免疫系统造成损伤，尤其是免疫功能低下使患者处于对细菌、病毒等病原体和其他损伤因子的高敏状态，影响了患者生存质量，促进了病情恶化。本研究将蝎毒抗癌多肽(APBMV)结合放
疗以观察蝎毒抗癌多肽对受X射线照射小鼠免疫功能的影响。
脾脏、胸腺是参与免疫功能调节的免疫器官，是高辐射敏感的细胞群，辐射作用于这些细胞群使机体免疫功能降低，从而使得脾脏指数、胸腺指数明显降低。骨髓是另一高辐射敏感组织，如骨髓抑制易引起外周血白细胞下降。本实验结果显示，经用APBMV的小鼠X线照射后脾脏指数、胸腺指数、外周血白细胞均无明显下降，明显高于单纯照射组(P<0.01)。说明了APBMV对免疫器官有一定的保护作用，并降低骨髓细胞对辐射敏感性，对造血系统起防辐射作用。对脾脏的保护作用可能是APBMV增强脾细胞混合淋巴细胞反应和迟发超敏反应，拮抗辐射引起的小鼠脾细胞SRBC抗体形成能力降低 [6] 。
当机体受到大剂量电离辐射后使得机体免疫活性细胞数量减少，主要是对辐射最敏感的T淋巴细胞下降 [7] 。本研究通过免疫荧光染色法和流式细胞仪测定外周血T淋巴细胞亚群，实验结果表明经X线照射后小鼠T淋巴细胞CD4、CD8亚群、CD4/CD8下降明显，与正常组对照组有显著下降(P<0.01);加用APBMV后T淋巴细胞CD4、CD8亚群下降不大(P>0.05)，CD4/CD8与正常对照差异无显著性。T淋巴细胞CD4、CD8亚群对射线的敏感性有不同的研究，有的学者认为是一致性的 [8] ，近年来研究认为CD8亚群相对高些 [9，10] 。上述结果表明，蝎毒抗癌多肽对受辐射损伤 小鼠免疫功能有保护及提高作用，起到辐射防护作用，其具体作用靶点、作用机制有待深入研究。
参考文献
1 孔天翰，肖桂元，周少雄，等.7种蝎毒的高效液相分析及毒理学研究.河南医科大学学报，1999，34(1):63-66.
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4 Devaux C，Moreau E，Goyffon M，et al.Construction and functional eˉvaluation of a single-chain antibody fragment that neutralizes toxin AahI from the venom of the scorpion Androctonus australis hector.Eur J Biochem，2001，268(3):694-702.
5 殷蔚伯，谷铣之.肿瘤放射治疗学，第3版.北京:中国协和医科大学出版社，2002，15.
6 Freedman BD，Fleischmann BK，Punt JA，et al.Identification of Kv1.1expression by murine CD4-CD8-thymocytes，A role for voltage-dependent K + channels in murine thymocyte development.J Biol Chem，1995，270(38):22406-22411.
7 刘志辉，孟庆勇.多糖抗辐射研究现状.中华放射医学与防护杂志，2003，23(1):70-71.
8 Nakamura N，Kusunoki Y，Akiyama M.Radiosensitivity of CD4or CD8positive human T lymphocytes by an in vitro formation assay.Radiat Res，1990，23(2):224.
9 Seki H，Iwai K，Kanegane H，et al.Differential protective action of cyˉtokines on radiation induced apoptosis of peripheral lymphocyte subpopuˉlations.Cell Immunol，1995，163:30-36.
10 Crolmpton NEA，Pzsabin M，A versatile and rapid assay to radiosensiˉtivity of peripheral blood leukocyte based on DNA and surface marker assessment of cytotoxicity.Radiat Res，1997，147:55.
(收稿日期:2004-07-12)
作者单位:524037广东医学院附属湛江中心人民医院肿瘤中心
510182广州医学院蛇毒研究所
(编辑毅文), 百拇医药(杨志华 肖桂元 孔天翰)