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中国医学论坛报
摘 要
本文对丹参保护心肌的细胞及分子机制进行了研究，结果表明：丹参及其有效成分是良好的慢钙通道阻滞剂，效果优于维拉帕米，并具有膜稳定作用，可防止缺血、缺氧条件下膜结构及功能的障碍。
丹参为唇形科鼠尾草属植物，其根入药。化学成分有脂溶性的二萜醌和水溶性的酚性酸二大类，均具有血管药理作用，自古即用于活血化瘀，单方可入药。它入心肝二经，除活血化瘀外尚有清热解毒、镇痛作用，《神农本草经》有“丹参味苦微寒主心腹邪气”之说。近代研究证明其具有抗缺氧、扩冠、抗血小板凝集、拮抗钙、抗感染等作用。临床应用很广，主要作为活血化瘀药用于心、脑、肝病的治疗。
鉴于丹参为经典的活血化瘀药，我们在研究心肌缺血—再灌注损伤中，使用丹参及其水溶性成分丹参素或其脂溶性成分丹参酮Ⅱ-A作为心肌保护药，力图在以往研究的基础上，进一步从分子水平上阐明其作用机制，以期弘扬祖国医药学，为世界医学做出贡献。
实验研究
以整体—器官—细胞—细胞器为模型，从四个主要方面：对自由基的清除作用，对细胞膜的保护作用，对钙的拮抗作用，对能量代谢的调节作用等对丹参进行了深入研究。
对自由基的清除作用：
不论从抗脂质过氧化的角度，以丙二醛(MDA，氧自由基引发的脂质过氧化中间产物)为指标或用化学发光、电子自旋共振(ESR)、高效液相色谱(HPLC)等法直接测定氧自由基(O2、OH)，都证明丹参及其有效成份(丹参素、丹参酮)为良好的自由基清除剂，与超氧化物岐化酶(SOD)作对比，其效果优于SOD且药源广、价廉、效果好，SOD之所以难以应用到临床，是因为其价高、半衰期短。
对细胞膜的保护作用：
细胞膜是细胞得以营养并维持自主功能的主要结构，细胞损伤始于膜，保护在于膜。
我们实验室不论用DPH为膜脂探剂进行荧光分析还是用脂肪酸标记，ESR测定均提示心肌缺血—再灌注损伤时，心肌线粒体膜流动性下降，影响膜的生物学功能。而加入丹参素则可防止膜的流动性下降，保护膜脂双层的正常液态。
用放射配基法证明，缺血—再灌注时，随缺血时间的延长及再灌注质膜α及β受体数目剧增，预先给予丹参处理则可使受体数目保持正常，提示丹参对细胞膜具有稳定作用。
对钙的拮抗作用：
细胞内钙是细胞内的第二信使，对细胞信息的跨膜传递及细胞功能的发挥具有重要作用。细胞死亡主要是由于大量钙进入细胞引起细胞“钙超载”所致。
为研究心肌缺血—再灌注时细胞内钙分布的变化，我们采用兔在体及大鼠分离的心肌细胞为模型进行了实验研究，并观察了丹参及丹参素的影响。结果证明：以焦锑酸钾为探针，电子显微镜为观察手段，看钙在心肌细胞内的分布时，可见钙集中于线粒体，并在一定时限内随缺血时间延长及再灌注而增加，预先给予丹参可明显降低细胞“钙超载”。以最新一代Ca2+荧光控剂Fkuo-3进行实验，观察分离的心肌细胞内游离钙浓度时，提示心肌细胞缺血，特别是再灌注时，细胞内游离钙增加。丹参素可明显减少细胞内游离钙浓度，防止“钙超载”，效果优于维拉帕米。
用微电极联用微机的电生理学方法证明，心肌缺血—再灌注时动作电位时程(APD)特别是APD50延长，APD50常作为平台期(Ca2+跨膜内流进入细胞)的衡量标准，丹参能明显缩短被延长的平台期。用现代先进的全细胞膜片钳技术检测Ca2+的内向电流时，进一步证实了心肌缺血，特别是再灌注时Ca2+内向电流增加。丹参素明显降低Ca2+内向电流，说明丹参及其有效成分有明显的钙通道阻滞作用。
对能量代谢的调节作用：
缺血性心肌损伤的初发机制当属能量障碍。氧供不足，在电子传递链上导致氧自由基的过量产生。能量供应不足，生物膜难以维持其结构的完整及功能的发挥，致使依赖能量的离子转动障碍，导致细胞内稳态失衡。因此，研究缺血—再灌注时能量代谢的变化规律，将对阐明缺血—再灌注操作机制提供最基本、最重要的资料。为此，本实验室从生物力能学的角度对心肌细胞能量代谢，特别是线粒体内膜上相互偶联的三部分基本分子生化环节：电子传递、质子跨内膜转运；H+—ATP酶活性；能量的利用，对缺血心肌能量代谢变化的特点及其规律进行了探讨。
电子(e-)传递，质子(H+)跨内膜转运所形成的H+跨内膜梯度及电化学电位(质子驱动力ΔμH+)的变化：
ΔμH+由被氧化物质利用电子传递释放的化学能转变而来(本身也是一个耗能过程)，是能量形成的最基本动力。它的减弱降低了驱动H+—ATP酶合成ATP的动力，致使ATP合成减少。我们通过大鼠心肌线粒体或内膜体的实验证明，缺血特别是再灌注时电子的传递，质子的转运均发生障碍(泵出不足或回漏)，H+/2e-比降低，膜电位下降，因而ΔμH+下降。丹参素可明显保护线粒体或内膜体的这一功能，使H+/2e-及膜电位升高。
H+—ATP酶活性的变化：
H+—ATP酶是合成ATP的基本酶，它既有合成活性又有分解活性。其合成ATP的活性受ΔμH+的驱动。缺血—再灌注时不论分解或合成活性均下降。缺血时心肌ATP含量的下降主要是由于合成活性下降所致。给予丹参素可提高H+—ATP酶的活性促进ATP的合成。
能量利用的变化：
呼吸链末端的氧化取决于ATP对线粒体的供应，我们的实验从腺苷酸的测定方面证明，缺血—再灌注时，ATP生成减少，总腺苷酸池减小，能荷变小。而给予丹参或其有效成分均可提高ATP的产量，增大腺苷酸池及能荷。
综上所述，心肌缺血—再灌注时，电子传递、H+转动、H+—ATP酶活性，能量的利用三个线粒体内膜上相互偶联的基本分子生化环节均发生改变，而最基本的起始改变是电子传递和H+转动。丹参及其有效成分对三个分子生化环节均具保护作用，而最基本的可能是对ΔμH+和H+—ATP酶的保护。
临床研究
我们在心外科40例换瓣手术中，于不同的灌流条件下，在手术的不同时间点，取右房心肌活检标本，以细胞膜通透性、细胞内钙分布、腺苷酸含量为指标，观察了心脏停跳及血流恢复后，是否存在心肌缺血—再灌注损伤以及丹参的保护作用。
灌注方法：
(1)以冷钾稀释血顺灌(经主动脉灌)，(2)冷钾稀释血逆灌(经冠状动脉窦灌)，(3)温血持续灌，(4)温血+丹参持续灌(术前点滴丹参3天，术中停跳液中加丹参)。
观察指标及方法：
(1)以硝酸镧为探针，通过电镜观察细胞膜通透性(镧离子正常情况下不能通过细胞膜)；
(2)以焦锑酸钾为探针，通过电镜观察细胞内钙分布(焦锑酸与钙结合形成不解离的焦锑酸钙沉淀颗粒)；
(3)以高效液相色谱检测心肌腺苷酸含量(ATP、ADP、AMP、总腺苷酸池、能荷)。
活检时间：
停跳立即，停跳40分，复流立即，复流20分。
结 果
比较4种灌流方法下，4个不同的手术时间点上，3种指标的变化可见温血+丹参组心肌保护效果最好：细胞膜通透性变化不大，能量保护最好(ATP高，总腺苷酸及能荷大)。
小 结
丹参及有效成分丹参素、丹参酮是有效的氧自由基清除剂，是良好的慢钙通道阻滞剂，效果优于维拉帕米；其具膜稳定作用，可防止缺血、缺氧条件下膜结构及功能的障碍；其可有效调控心肌缺血—再灌注条件下心肌的能量代谢，维持代谢正常进行。丹参对钙的拮抗作用和对能量代谢的调节作用，可能是丹参及其有效成分保护心肌的主要机制。(参考文献从略)
本文对丹参保护心肌的细胞及分子机制进行了研究，结果表明：丹参及其有效成分是良好的慢钙通道阻滞剂，效果优于维拉帕米，并具有膜稳定作用，可防止缺血、缺氧条件下膜结构及功能的障碍。
丹参为唇形科鼠尾草属植物，其根入药。化学成分有脂溶性的二萜醌和水溶性的酚性酸二大类，均具有血管药理作用，自古即用于活血化瘀，单方可入药。它入心肝二经，除活血化瘀外尚有清热解毒、镇痛作用，《神农本草经》有“丹参味苦微寒主心腹邪气”之说。近代研究证明其具有抗缺氧、扩冠、抗血小板凝集、拮抗钙、抗感染等作用。临床应用很广，主要作为活血化瘀药用于心、脑、肝病的治疗。
鉴于丹参为经典的活血化瘀药，我们在研究心肌缺血—再灌注损伤中，使用丹参及其水溶性成分丹参素或其脂溶性成分丹参酮Ⅱ-A作为心肌保护药，力图在以往研究的基础上，进一步从分子水平上阐明其作用机制，以期弘扬祖国医药学，为世界医学做出贡献。
实验研究
以整体—器官—细胞—细胞器为模型，从四个主要方面：对自由基的清除作用，对细胞膜的保护作用，对钙的拮抗作用，对能量代谢的调节作用等对丹参进行了深入研究。
对自由基的清除作用：
不论从抗脂质过氧化的角度，以丙二醛(MDA，氧自由基引发的脂质过氧化中间产物)为指标或用化学发光、电子自旋共振(ESR)、高效液相色谱(HPLC)等法直接测定氧自由基(O2、OH)，都证明丹参及其有效成份(丹参素、丹参酮)为良好的自由基清除剂，与超氧化物岐化酶(SOD)作对比，其效果优于SOD且药源广、价廉、效果好，SOD之所以难以应用到临床，是因为其价高、半衰期短。
对细胞膜的保护作用：
细胞膜是细胞得以营养并维持自主功能的主要结构，细胞损伤始于膜，保护在于膜。
我们实验室不论用DPH为膜脂探剂进行荧光分析还是用脂肪酸标记，ESR测定均提示心肌缺血—再灌注损伤时，心肌线粒体膜流动性下降，影响膜的生物学功能。而加入丹参素则可防止膜的流动性下降，保护膜脂双层的正常液态。
用放射配基法证明，缺血—再灌注时，随缺血时间的延长及再灌注质膜α及β受体数目剧增，预先给予丹参处理则可使受体数目保持正常，提示丹参对细胞膜具有稳定作用。
对钙的拮抗作用：
细胞内钙是细胞内的第二信使，对细胞信息的跨膜传递及细胞功能的发挥具有重要作用。细胞死亡主要是由于大量钙进入细胞引起细胞“钙超载”所致。
为研究心肌缺血—再灌注时细胞内钙分布的变化，我们采用兔在体及大鼠分离的心肌细胞为模型进行了实验研究，并观察了丹参及丹参素的影响。结果证明：以焦锑酸钾为探针，电子显微镜为观察手段，看钙在心肌细胞内的分布时，可见钙集中于线粒体，并在一定时限内随缺血时间延长及再灌注而增加，预先给予丹参可明显降低细胞“钙超载”。以最新一代Ca2+荧光控剂Fkuo-3进行实验，观察分离的心肌细胞内游离钙浓度时，提示心肌细胞缺血，特别是再灌注时，细胞内游离钙增加。丹参素可明显减少细胞内游离钙浓度，防止“钙超载”，效果优于维拉帕米。
用微电极联用微机的电生理学方法证明，心肌缺血—再灌注时动作电位时程(APD)特别是APD50延长，APD50常作为平台期(Ca2+跨膜内流进入细胞)的衡量标准，丹参能明显缩短被延长的平台期。用现代先进的全细胞膜片钳技术检测Ca2+的内向电流时，进一步证实了心肌缺血，特别是再灌注时Ca2+内向电流增加。丹参素明显降低Ca2+内向电流，说明丹参及其有效成分有明显的钙通道阻滞作用。
对能量代谢的调节作用：
缺血性心肌损伤的初发机制当属能量障碍。氧供不足，在电子传递链上导致氧自由基的过量产生。能量供应不足，生物膜难以维持其结构的完整及功能的发挥，致使依赖能量的离子转动障碍，导致细胞内稳态失衡。因此，研究缺血—再灌注时能量代谢的变化规律，将对阐明缺血—再灌注操作机制提供最基本、最重要的资料。为此，本实验室从生物力能学的角度对心肌细胞能量代谢，特别是线粒体内膜上相互偶联的三部分基本分子生化环节：电子传递、质子跨内膜转运；H+—ATP酶活性；能量的利用，对缺血心肌能量代谢变化的特点及其规律进行了探讨。
电子(e-)传递，质子(H+)跨内膜转运所形成的H+跨内膜梯度及电化学电位(质子驱动力ΔμH+)的变化：
ΔμH+由被氧化物质利用电子传递释放的化学能转变而来(本身也是一个耗能过程)，是能量形成的最基本动力。它的减弱降低了驱动H+—ATP酶合成ATP的动力，致使ATP合成减少。我们通过大鼠心肌线粒体或内膜体的实验证明，缺血特别是再灌注时电子的传递，质子的转运均发生障碍(泵出不足或回漏)，H+/2e-比降低，膜电位下降，因而ΔμH+下降。丹参素可明显保护线粒体或内膜体的这一功能，使H+/2e-及膜电位升高。
H+—ATP酶活性的变化：
H+—ATP酶是合成ATP的基本酶，它既有合成活性又有分解活性。其合成ATP的活性受ΔμH+的驱动。缺血—再灌注时不论分解或合成活性均下降。缺血时心肌ATP含量的下降主要是由于合成活性下降所致。给予丹参素可提高H+—ATP酶的活性促进ATP的合成。
能量利用的变化：
呼吸链末端的氧化取决于ATP对线粒体的供应，我们的实验从腺苷酸的测定方面证明，缺血—再灌注时，ATP生成减少，总腺苷酸池减小，能荷变小。而给予丹参或其有效成分均可提高ATP的产量，增大腺苷酸池及能荷。
综上所述，心肌缺血—再灌注时，电子传递、H+转动、H+—ATP酶活性，能量的利用三个线粒体内膜上相互偶联的基本分子生化环节均发生改变，而最基本的起始改变是电子传递和H+转动。丹参及其有效成分对三个分子生化环节均具保护作用，而最基本的可能是对ΔμH+和H+—ATP酶的保护。
临床研究
我们在心外科40例换瓣手术中，于不同的灌流条件下，在手术的不同时间点，取右房心肌活检标本，以细胞膜通透性、细胞内钙分布、腺苷酸含量为指标，观察了心脏停跳及血流恢复后，是否存在心肌缺血—再灌注损伤以及丹参的保护作用。
灌注方法：
(1)以冷钾稀释血顺灌(经主动脉灌)，(2)冷钾稀释血逆灌(经冠状动脉窦灌)，(3)温血持续灌，(4)温血+丹参持续灌(术前点滴丹参3天，术中停跳液中加丹参)。
观察指标及方法：
(1)以硝酸镧为探针，通过电镜观察细胞膜通透性(镧离子正常情况下不能通过细胞膜)；
(2)以焦锑酸钾为探针，通过电镜观察细胞内钙分布(焦锑酸与钙结合形成不解离的焦锑酸钙沉淀颗粒)；
(3)以高效液相色谱检测心肌腺苷酸含量(ATP、ADP、AMP、总腺苷酸池、能荷)。
活检时间：
停跳立即，停跳40分，复流立即，复流20分。
结 果
比较4种灌流方法下，4个不同的手术时间点上，3种指标的变化可见温血+丹参组心肌保护效果最好：细胞膜通透性变化不大，能量保护最好(ATP高，总腺苷酸及能荷大)。
小 结
丹参及有效成分丹参素、丹参酮是有效的氧自由基清除剂，是良好的慢钙通道阻滞剂，效果优于维拉帕米；其具膜稳定作用，可防止缺血、缺氧条件下膜结构及功能的障碍；其可有效调控心肌缺血—再灌注条件下心肌的能量代谢，维持代谢正常进行。丹参对钙的拮抗作用和对能量代谢的调节作用，可能是丹参及其有效成分保护心肌的主要机制。(参考文献从略)