大鼠肠上皮细胞缺血缺氧损伤后基因表达谱变化的实验研究
贾震易,秦环龙,上海交通大学附属第六人民医院普通外科
上海市 200233
贾震易,男,1975-07-14生,上海市人,汉族.2005年上海第二医科大学硕士毕业,住院医师, 主要从事胃肠外科疾病研究.
国家自然科学基金资助项目,No. 30271286
上海市科委青年科技启明星跟踪计划资助项目,No. 02QMB1406
通讯作者:秦环龙,200233, 上海市宜山路600号,上海交通大学附属第六人民医院普通外科. sshosp@public.sta.net.cn
, http://www.100md.com
电话: 021-64942226 传真:021-64368920
收稿日期:2005-03-22 接受日期:2005-04-20
Change of gene expression in
intestinal epithelial cells under ischemia and anoxia in rats
Zhen-Yi Jia, Huan-Long Qin
Zhen-Yi Jia, Huan-Long Qin, Department of General Surgery, theAffliated Sixth People's Hospital of ShanghaiJiaotong University, Shanghai 200233, China
, http://www.100md.com
Supported by National Natural Science Foundation of China,No.30271286, and Shanghai Science and Technology committee Foundation, No.02QMB1406
Correspondence to: Huan-Long Qin, Department of General Surgery,the Affliated Sixth People's Hospital ofShanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China. sshosp@public.sta.net.cn
Received: 2005-03-22 Accepted:2005-04-20
, http://www.100md.com
Abstract
AIM: To investigate the change of gene expression in intestinalepithelial cells (IECs) under ischemia and anoxia in rats and to searchfor the correlated genes with IECs injury.
METHODS: IECs injury model was induced by ischemia and anoxia, andthe cells were divided into four groups: control group, ischemia group,anoxia group and ischemia and anoxia (I/A) group. Fluorescence reversetranscription was used to label mRNA. The cDNA microarray was used todetect the difference between gene expression of control group andexperiment groups.
, http://www.100md.com
RESULTS: There were 207 genes differently expressed between controland ischemia group, of which 132 were down-regulated while 75 wereup-regulated. One hundred and sixty-eight genes were differently expressedbetween control and anoxia group, of which 84 were down-regulated while 84were up-regulated. Between control and I/A group, 321 genes weredifferently expressed, of which 97 were down-regulated while 224 wereup-regulated.
CONCLUSION: cDNA microarray can be used to screen diversified geneexpression related to injury under ischemia and anoxia, which brings somenew clues for studying the mechanism of IECs injury.
, 百拇医药
Key Words: cDNA microarray; Ischemia; Anoxia; Intestinal epithelialcells; Rats
Jia ZY, Qin HL. Change of gene expression in intestinal epithelial cellsunder ischemia and anoxia in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005;13(11):1263-1266
摘要
目的:研究大鼠肠上皮细胞(IEC)缺血缺氧后基因表达谱的改变，寻找与IEC损伤相关的基因.
方法:建立缺血缺氧大鼠IEC的实验模型，实验分为对照组、缺血组、缺氧组和缺血缺氧组.荧光逆转录标记mRNA,采用大鼠基因表达谱芯片检测正常IEC与缺血组、缺氧组及缺血缺氧组IEC基因表达谱，并对比分析检测结果.
, 百拇医药
结果:与正常IEC相比，缺血组基因表达有差异的共207组，其中132组下调，75组上调;缺氧组基因表达有差异的共168组，其中84组下调，84组上调;缺血缺氧组基因表达有差异的共321组，其中97组下调，224组上调.
结论:应用基因芯片技术筛选了与IEC缺血缺氧损伤密切相关的差异表达基因，为阐明这方面的机制提供了新的线索.
关键词:基因芯片;缺血;缺氧;肠上皮细胞;大鼠
贾震易，秦环龙.大鼠肠上皮细胞缺血缺氧损伤后基因表达谱变化的实验研究.世界华人消化杂志 2005;13(11):1263-1266
(PDF) RNA电泳图. A: 缺血/正常组; B: 缺氧/正常组; C: 缺血缺氧/正常组.
, 百拇医药
图2 双色荧光标记叠加图. A: 缺血/正常组; B: 缺氧/正常组; C: 缺血缺氧/正常组.
图3 (PDF) 杂交信号强度散点图. A: 缺血/正常组; B: 缺氧/正常组; C: 缺血缺氧/正常组.
表1 部分表达差异的基因
A: 缺血/正常组; B: 缺氧/正常组; C: 缺血缺氧/正常组.
3 讨论
基因芯片(genechip)，也称基因微矩阵(microarray)，是在玻璃、硅等载体上有序地、高密度地(目前点与点之间的距离小于500mm)排列，以固定大量的靶基因片段(也称分子探针).样品核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的点同时进行杂交，杂交信息通过计算机进行集约化和平行处理，这就是基因芯片技术.这一技术能以大规模、高通量方式同时研究成千上万个基因在某种生理和病理条件下的表达变化，其获得信息量及效率是传统生物学技术无法比拟的[1].我们应用此技术于IEC缺血缺氧损伤的分子机制研究，采用含有4096个点阵的高密度芯片，研究正常大鼠IEC与缺血缺氧损伤后基因表达的差异，结果显示损伤后2h即有一部分基因发生了差异表达，不同的刺激条件下差异基因数量有所不同，由多到少依次为缺血缺氧组、缺血组、缺氧组.这些基因主要属于细胞信号和传递蛋白类、凋亡相关蛋白类、DNA结合、转录和转录因子类、细胞表面抗原和黏附蛋白类、离子通道和运输蛋白类、代谢类及一些未知功能类基因[2].同时我们发现不同的实验组发生差异表达的基因既有联系，也有所区别.其联系表现为各组间均有相同的基因发生差异表达，而区别则体现在不同的实验组有不同的基因发生差异表达以及相同的差异表达基因存在表达方式和表达量的不同.这就提示不同的刺激条件下细胞损伤的发生存在着共同的机制，而彼此间基因表达的不同可能导致了细胞损伤程度的差异.
, http://www.100md.com
我们发现细胞内一些抗凋亡基因发生了变化，如抗凋亡蛋白Bcl-2、抗凋亡细胞通路蛋白ERK2、血清/糖皮质激素调节激酶(SGK)及双特异性蛋白磷酸酶(rVH6)均较正常细胞表达减少[3-5].其中前二者在缺血缺氧组、缺氧组属差异表达，而SGK和rVH6在三组芯片中均呈差异表达.下调程度由大到小依次是缺血缺氧组、缺氧组、缺血组，这一排列顺序与我们先前研究显示的IEC凋亡率由高到低的排列序相对应[6].由此看来，某些抗凋亡因素的减弱及其减弱程度与缺血缺氧后IEC凋亡密切相关.细胞骨架与凋亡关系密切，大量研究表明凋亡时多种细胞骨架蛋白发生了改变，而细胞骨架的状态也直接影响着凋亡信号的传导[7].本研究显示三组细胞中肌动蛋白和微管蛋白均发生了差异表达，缺血后二者均下调，而缺氧和缺血缺氧刺激后二者均上调，上调的程度缺血缺氧组高于缺氧组.这就证实缺血缺氧后IEC细胞骨架的确发生了变化，且不同的刺激条件下细胞骨架的变化亦有不同.至于这一变化发生的原因及其与IEC凋亡的关系尚需深入研究.已知nectin-3a是nectin家族中的一种亚型，是不依赖Ca2+的细胞黏附分子，分布于IEC细胞锚定连接处.其主要功能是与E-钙黏素共同构成细胞锚定连接及促进细胞紧密连接形成[8-9].本研究还显示实验组nectin-3a表达减少，其中缺血缺氧组、缺血组属差异表达.减少程度由大到小依次是缺血缺氧组、缺血组、缺氧组.由此提示缺血缺氧损伤导致的细胞连接破坏、肠道通透性增高与nectin-3a密切相关.此外钙泵功能在缺血缺氧后也发生了变化，表现为IEC钙泵相关ATP合成酶表达下调，在三组中均呈差异表达，下调程度由大到小依次是缺血组、缺氧组、缺血缺氧组.这一结果提示ATP依赖的钙泵功能障碍与缺血缺氧后IEC钙超载密切相关.
, http://www.100md.com
总之，IEC缺血缺氧损伤的基因谱变化是多方面的，钙泵、Bcl-2、ERK通路、SGK、rVH6、nectin-3a及细胞骨架均可能与IEC损伤相关.其中有关细胞骨架、nectin家族、SGK及rVH6的改变目前尚缺乏研究，此外研究中还发现一些未知功能基因，如N27的改变.这些基因在IEC缺血缺氧损伤中的表达差异及缺血、缺氧敏感性差异还有待进一步研究.
4 参考文献
1 陈胜良, 萧树东. 基因芯片技术在消化病学领域的应用进展. 中华消化杂志 2002;22:494-496
2 吴朝晖, 金惠铭, 顾玉东. 大鼠臂丛神经损伤后萎缩骨骼肌基因表达谱的变化. 中华创伤杂志 2002;18:357-360
3 郑曙云, 付小兵, 徐建国. MAPK信号传导通路与肠损伤后黏膜上皮修复. 中国危重病急救医学 2004;16:59-62
, 百拇医药
4 Muda M, Theodosiou A, Rodrigues N, Boschert U, Camps M, Gillieron C, Davies K, Ashworth A, Arkinstall S. The
dual specificity phosphatases M3/6 and MKP-3 are highly selective for inactivation of distinct mitogen-activated
protein kinases. J Biol Chem 1996;271:27205-27208
5 Brunet A, Park J, Tran H, Hu LS, Hemmings BA, Greenberg ME. Protein kinase SGK mediates survival signals
, 百拇医药
by phosphorylating the forkhead transcription factor FKHRL1 (FOXO 3a). Mol Cell Biol 2001;22:952-965
6 陈前, 秦环龙. 缺血缺氧损伤对肠上皮细胞整合素极性及细胞凋亡的影响. 世界华人消化杂志 2005;13:456-459
7 夏伟, 周建伟. 细胞骨架与细胞凋亡及细胞内信息通路的关系. 细胞生物学杂志 2001;23:205-209
8 Takai Y, Nakanishi H. Nectin and afadin: novel organizers ofintercellular junctions. JCell Sci 2003;116(Pt1):17-27
9 Satoh-Horikawa K, Nakanishi H, Takahashi K, Miyahara M, NishimuraM, Tachibana K, Mizoguchi A, Takai Y. Nectin-3,a new member of immunoglobulin-like celladhesion molecules that shows homophilic and heterophilic cell-cell
adhesion activities. J Biol Chem 2000;275:10291-10299
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, http://www.100md.com( 贾震易, 秦环龙)
上海市 200233
贾震易,男,1975-07-14生,上海市人,汉族.2005年上海第二医科大学硕士毕业,住院医师, 主要从事胃肠外科疾病研究.
国家自然科学基金资助项目,No. 30271286
上海市科委青年科技启明星跟踪计划资助项目,No. 02QMB1406
通讯作者:秦环龙,200233, 上海市宜山路600号,上海交通大学附属第六人民医院普通外科. sshosp@public.sta.net.cn
, http://www.100md.com
电话: 021-64942226 传真:021-64368920
收稿日期:2005-03-22 接受日期:2005-04-20
Change of gene expression in
intestinal epithelial cells under ischemia and anoxia in rats
Zhen-Yi Jia, Huan-Long Qin
Zhen-Yi Jia, Huan-Long Qin, Department of General Surgery, theAffliated Sixth People's Hospital of ShanghaiJiaotong University, Shanghai 200233, China
, http://www.100md.com
Supported by National Natural Science Foundation of China,No.30271286, and Shanghai Science and Technology committee Foundation, No.02QMB1406
Correspondence to: Huan-Long Qin, Department of General Surgery,the Affliated Sixth People's Hospital ofShanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China. sshosp@public.sta.net.cn
Received: 2005-03-22 Accepted:2005-04-20
, http://www.100md.com
Abstract
AIM: To investigate the change of gene expression in intestinalepithelial cells (IECs) under ischemia and anoxia in rats and to searchfor the correlated genes with IECs injury.
METHODS: IECs injury model was induced by ischemia and anoxia, andthe cells were divided into four groups: control group, ischemia group,anoxia group and ischemia and anoxia (I/A) group. Fluorescence reversetranscription was used to label mRNA. The cDNA microarray was used todetect the difference between gene expression of control group andexperiment groups.
, http://www.100md.com
RESULTS: There were 207 genes differently expressed between controland ischemia group, of which 132 were down-regulated while 75 wereup-regulated. One hundred and sixty-eight genes were differently expressedbetween control and anoxia group, of which 84 were down-regulated while 84were up-regulated. Between control and I/A group, 321 genes weredifferently expressed, of which 97 were down-regulated while 224 wereup-regulated.
CONCLUSION: cDNA microarray can be used to screen diversified geneexpression related to injury under ischemia and anoxia, which brings somenew clues for studying the mechanism of IECs injury.
, 百拇医药
Key Words: cDNA microarray; Ischemia; Anoxia; Intestinal epithelialcells; Rats
Jia ZY, Qin HL. Change of gene expression in intestinal epithelial cellsunder ischemia and anoxia in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005;13(11):1263-1266
摘要
目的:研究大鼠肠上皮细胞(IEC)缺血缺氧后基因表达谱的改变，寻找与IEC损伤相关的基因.
方法:建立缺血缺氧大鼠IEC的实验模型，实验分为对照组、缺血组、缺氧组和缺血缺氧组.荧光逆转录标记mRNA,采用大鼠基因表达谱芯片检测正常IEC与缺血组、缺氧组及缺血缺氧组IEC基因表达谱，并对比分析检测结果.
, 百拇医药
结果:与正常IEC相比，缺血组基因表达有差异的共207组，其中132组下调，75组上调;缺氧组基因表达有差异的共168组，其中84组下调，84组上调;缺血缺氧组基因表达有差异的共321组，其中97组下调，224组上调.
结论:应用基因芯片技术筛选了与IEC缺血缺氧损伤密切相关的差异表达基因，为阐明这方面的机制提供了新的线索.
关键词:基因芯片;缺血;缺氧;肠上皮细胞;大鼠
贾震易，秦环龙.大鼠肠上皮细胞缺血缺氧损伤后基因表达谱变化的实验研究.世界华人消化杂志 2005;13(11):1263-1266
(PDF) RNA电泳图. A: 缺血/正常组; B: 缺氧/正常组; C: 缺血缺氧/正常组.
, 百拇医药
图2 双色荧光标记叠加图. A: 缺血/正常组; B: 缺氧/正常组; C: 缺血缺氧/正常组.
图3 (PDF) 杂交信号强度散点图. A: 缺血/正常组; B: 缺氧/正常组; C: 缺血缺氧/正常组.
表1 部分表达差异的基因
Genbank_ID | Definition | RatioA | RatioB | , http://www.100md.com RatioC |
NM_058213 | ATPaseCa2+transporting | 0.231 | 0.265 | 0.487 |
U30789 | N27 | 4.613 | 5.460 | 6.069 |
, 百拇医药 M64300 | ERK2 | 0.786 | 0.488 | 0.429 |
U42627 | dual-specificityprotein tyrosine phosphatase(rVH6) | 0.257 | 0.295 | 0.074 |
, http://www.100md.com XM_215801 | actin | 0.394 | 2.147 | 4.215 |
XM_219470 | tubulin | 0.408 | 3.849 | 2.640 |
XM_213626 | , 百拇医药 celladhesion molecule nectin-3a | 0.499 | 0.525 | 0.380 |
XM_232252 | Bcl-2 | 0.588 | 0.497 | 0.424 |
L01624 | , 百拇医药 Serumand glucocorticoid-regulated kinase(SGK) | 0.238 | 0.213 | 0.205 |
A: 缺血/正常组; B: 缺氧/正常组; C: 缺血缺氧/正常组.
3 讨论
基因芯片(genechip)，也称基因微矩阵(microarray)，是在玻璃、硅等载体上有序地、高密度地(目前点与点之间的距离小于500mm)排列，以固定大量的靶基因片段(也称分子探针).样品核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的点同时进行杂交，杂交信息通过计算机进行集约化和平行处理，这就是基因芯片技术.这一技术能以大规模、高通量方式同时研究成千上万个基因在某种生理和病理条件下的表达变化，其获得信息量及效率是传统生物学技术无法比拟的[1].我们应用此技术于IEC缺血缺氧损伤的分子机制研究，采用含有4096个点阵的高密度芯片，研究正常大鼠IEC与缺血缺氧损伤后基因表达的差异，结果显示损伤后2h即有一部分基因发生了差异表达，不同的刺激条件下差异基因数量有所不同，由多到少依次为缺血缺氧组、缺血组、缺氧组.这些基因主要属于细胞信号和传递蛋白类、凋亡相关蛋白类、DNA结合、转录和转录因子类、细胞表面抗原和黏附蛋白类、离子通道和运输蛋白类、代谢类及一些未知功能类基因[2].同时我们发现不同的实验组发生差异表达的基因既有联系，也有所区别.其联系表现为各组间均有相同的基因发生差异表达，而区别则体现在不同的实验组有不同的基因发生差异表达以及相同的差异表达基因存在表达方式和表达量的不同.这就提示不同的刺激条件下细胞损伤的发生存在着共同的机制，而彼此间基因表达的不同可能导致了细胞损伤程度的差异.
, http://www.100md.com
我们发现细胞内一些抗凋亡基因发生了变化，如抗凋亡蛋白Bcl-2、抗凋亡细胞通路蛋白ERK2、血清/糖皮质激素调节激酶(SGK)及双特异性蛋白磷酸酶(rVH6)均较正常细胞表达减少[3-5].其中前二者在缺血缺氧组、缺氧组属差异表达，而SGK和rVH6在三组芯片中均呈差异表达.下调程度由大到小依次是缺血缺氧组、缺氧组、缺血组，这一排列顺序与我们先前研究显示的IEC凋亡率由高到低的排列序相对应[6].由此看来，某些抗凋亡因素的减弱及其减弱程度与缺血缺氧后IEC凋亡密切相关.细胞骨架与凋亡关系密切，大量研究表明凋亡时多种细胞骨架蛋白发生了改变，而细胞骨架的状态也直接影响着凋亡信号的传导[7].本研究显示三组细胞中肌动蛋白和微管蛋白均发生了差异表达，缺血后二者均下调，而缺氧和缺血缺氧刺激后二者均上调，上调的程度缺血缺氧组高于缺氧组.这就证实缺血缺氧后IEC细胞骨架的确发生了变化，且不同的刺激条件下细胞骨架的变化亦有不同.至于这一变化发生的原因及其与IEC凋亡的关系尚需深入研究.已知nectin-3a是nectin家族中的一种亚型，是不依赖Ca2+的细胞黏附分子，分布于IEC细胞锚定连接处.其主要功能是与E-钙黏素共同构成细胞锚定连接及促进细胞紧密连接形成[8-9].本研究还显示实验组nectin-3a表达减少，其中缺血缺氧组、缺血组属差异表达.减少程度由大到小依次是缺血缺氧组、缺血组、缺氧组.由此提示缺血缺氧损伤导致的细胞连接破坏、肠道通透性增高与nectin-3a密切相关.此外钙泵功能在缺血缺氧后也发生了变化，表现为IEC钙泵相关ATP合成酶表达下调，在三组中均呈差异表达，下调程度由大到小依次是缺血组、缺氧组、缺血缺氧组.这一结果提示ATP依赖的钙泵功能障碍与缺血缺氧后IEC钙超载密切相关.
, http://www.100md.com
总之，IEC缺血缺氧损伤的基因谱变化是多方面的，钙泵、Bcl-2、ERK通路、SGK、rVH6、nectin-3a及细胞骨架均可能与IEC损伤相关.其中有关细胞骨架、nectin家族、SGK及rVH6的改变目前尚缺乏研究，此外研究中还发现一些未知功能基因，如N27的改变.这些基因在IEC缺血缺氧损伤中的表达差异及缺血、缺氧敏感性差异还有待进一步研究.
4 参考文献
1 陈胜良, 萧树东. 基因芯片技术在消化病学领域的应用进展. 中华消化杂志 2002;22:494-496
2 吴朝晖, 金惠铭, 顾玉东. 大鼠臂丛神经损伤后萎缩骨骼肌基因表达谱的变化. 中华创伤杂志 2002;18:357-360
3 郑曙云, 付小兵, 徐建国. MAPK信号传导通路与肠损伤后黏膜上皮修复. 中国危重病急救医学 2004;16:59-62
, 百拇医药
4 Muda M, Theodosiou A, Rodrigues N, Boschert U, Camps M, Gillieron C, Davies K, Ashworth A, Arkinstall S. The
dual specificity phosphatases M3/6 and MKP-3 are highly selective for inactivation of distinct mitogen-activated
protein kinases. J Biol Chem 1996;271:27205-27208
5 Brunet A, Park J, Tran H, Hu LS, Hemmings BA, Greenberg ME. Protein kinase SGK mediates survival signals
, 百拇医药
by phosphorylating the forkhead transcription factor FKHRL1 (FOXO 3a). Mol Cell Biol 2001;22:952-965
6 陈前, 秦环龙. 缺血缺氧损伤对肠上皮细胞整合素极性及细胞凋亡的影响. 世界华人消化杂志 2005;13:456-459
7 夏伟, 周建伟. 细胞骨架与细胞凋亡及细胞内信息通路的关系. 细胞生物学杂志 2001;23:205-209
8 Takai Y, Nakanishi H. Nectin and afadin: novel organizers ofintercellular junctions. JCell Sci 2003;116(Pt1):17-27
9 Satoh-Horikawa K, Nakanishi H, Takahashi K, Miyahara M, NishimuraM, Tachibana K, Mizoguchi A, Takai Y. Nectin-3,a new member of immunoglobulin-like celladhesion molecules that shows homophilic and heterophilic cell-cell
adhesion activities. J Biol Chem 2000;275:10291-10299
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, http://www.100md.com( 贾震易, 秦环龙)
