HPLC法分离和测定山荷叶中的鬼臼毒素
摘要
目的：建立高效液相色谱法分离和测定山荷叶中鬼臼毒素的方法。
方法：色谱柱 Whatman PartiShere C18，流动相 甲醇-0.1 mol.L-1磷酸氢二钾(50∶50)，检测波长290 nm。
结果：鬼臼毒素的线性范围 0.026～0.130 μg，r=0.9997，回收率为101.4%，RSD=1.2%。
结论：方法准确、快速、简便。可用于其它鬼臼类植物中鬼臼毒素的测定。
南方山荷叶(Diphylleia sinensis Li)为小檗科山荷叶属植物，分布于陕西、甘肃、四川、云南和湖北等省，主要用于治疗蛇咬伤、痈疖肿毒、跌打、风湿筋骨痛及气管炎等症[1]。其主要成分之一的鬼臼毒素为一系列人工合成的抗癌新药(如VP-16、VM-26等)的前体。对其成分的测定有比色法[2]和薄层色谱扫描法[3]，已有多篇论文报道了用HPLC法来测定小檗科桃儿七属和八角莲属植物中鬼臼毒素的含量[4～6]。我们也曾参照了上述方法来分离和检测鬼臼毒素，但发现山荷叶中的1个未知成分与鬼臼毒素部分重叠，未能完全分离，有关这种情况尚未见上述文献进行探讨。为此，我们对此进行了研究。最后得到了较满意的高效液相色谱流动相的组成，同时也考察了不同的溶剂和提取方法对鬼臼毒素含量测定的影响。
, 百拇医药
1 仪器、试剂和药品
Hewlett-Packard 1100高效液相色谱仪, 四元梯度泵, DAD检测器, HP ChemStation化学工作站。甲醇(色谱纯),双蒸水,鬼臼毒素对照品(98%，Sigma公司), 生药购自湖北巴东，经江苏植物研究所邓懋彬教授鉴定为南方山荷叶(Diphylleia sinensis Li)。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱：Whatman PartiShere C18(125 mm×4.6 mm, 粒径5 μm)，流动相：甲醇-0.1 mol.L-1磷酸氢二钾(pH≈7.5)(50∶50)，流速：1.0 mL.min-1，检测波长：290 nm，柱温：25 ℃。
2.2 线性范围 精密称取鬼臼毒素对照品，用流动相稀释成浓度为2.6、5.2、7.8、10.4和13.0 μg.mL-1的溶液，分别进样10 μL(重复进样3次)，测得鬼臼毒素的平均峰面积分别为11.85、23.65、34.54、46.28和58.91，以对照品溶液浓度(μg.mL-1)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得一线性方程为：Y＝0.021+4.49 X r＝0.9994
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2.3 加样回收率试验 进行加样回收率试验，按含量测定项下操作，测得平均回收率为101.4 %，RSD为1.2 %，n=3。
2.4 精密度试验 取样品测定项下的溶液，按含量测定项下操作，重复进样6次，测得鬼臼毒素的峰面积，RSD为0.9 %。
2.5 溶剂及抽提方法的试验 分别采用不同的溶剂(甲醇、乙醇、丙酮和氯仿)及提取方法(索氏提取和超声波抽提)来测定鬼臼毒素的提取效果。其中以80%的甲醇水溶液，用超声波抽提所得到的溶液中鬼臼毒素的含量为最高，约比用乙醇回流8 h高出10%。另外比较了抽提时间的影响，发现用超声波抽提30 min和60 min基本上没有差别。所以，最后确定样品的提取方式为用80%的甲醇水溶液超声波振荡30 min。
2.6 样品测定 分别精密称取3份山荷叶根茎的粉末25 mg于25 mL的容量瓶中，加80%的甲醇水溶液适量，用超声波振荡30 min，溶液冷却至室温后，再用80%的甲醇水溶液稀释至刻度。摇匀后离心，取上清液10 μL，注入高效液相色谱仪，重复进样3次，测得鬼臼毒素的平均峰面积，以外标法测定其含量。测得山荷叶中鬼臼毒素的含量分别为7.4 %、7.5 %和7.8 %。
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3 讨论
3.1 流动相的选择 我们参照文献[4～8]，用甲醇-水(50∶50)作为流动相，但同时使用了206、265和290 nm 3个波长来检测，结果发现在206和290 nm处，鬼臼毒素表现为峰前延或有一肩峰，与文献报道的色谱图相似，而在265 nm，则明显有一未知成分未能与鬼臼毒素分离(图1)。由DAD检测器测得该杂质在262 nm处有最大吸收，而鬼臼毒素在206和290 nm处有最大吸收，相对在265 nm处吸收较小，所以才有上述结果。为此，我们选择了不同类型和浓度的缓冲液及离子对试剂对该杂质和鬼臼毒素进行分离，但在酸性条件下，与甲醇的比例为50∶50时，结果与甲醇-水(50∶50)一样，甲醇比例降低时，该杂质峰反而与鬼臼毒素合并为1个峰。于是我们选择了0.1 mol.L-1的磷酸氢二钾(pH≈7.5) 缓冲液,当流动相中甲醇和0.1 mol.L-1的磷酸氢二钾缓冲液(pH≈7.5)的比例为50∶50时，这一未知成分与鬼臼毒素达到了完全分离，在此条件下，鬼臼毒素的出峰时间约为7.5 min，达到了快速分析的目的。
3.2 改用超声波法振荡抽提后，不仅简化了提取方法，大大地缩短了提取时间，而且也减少了由提取操作引入的误差，提高了鬼臼毒素的提取率。
3.3 由HPLC法测得山荷叶中鬼臼毒素的含量比文献[1]报道的要高，这可能与植物的产地、干燥程度、提取方法以及测定方法等有关。, http://www.100md.com
目的：建立高效液相色谱法分离和测定山荷叶中鬼臼毒素的方法。
方法：色谱柱 Whatman PartiShere C18，流动相 甲醇-0.1 mol.L-1磷酸氢二钾(50∶50)，检测波长290 nm。
结果：鬼臼毒素的线性范围 0.026～0.130 μg，r=0.9997，回收率为101.4%，RSD=1.2%。
结论：方法准确、快速、简便。可用于其它鬼臼类植物中鬼臼毒素的测定。
南方山荷叶(Diphylleia sinensis Li)为小檗科山荷叶属植物，分布于陕西、甘肃、四川、云南和湖北等省，主要用于治疗蛇咬伤、痈疖肿毒、跌打、风湿筋骨痛及气管炎等症[1]。其主要成分之一的鬼臼毒素为一系列人工合成的抗癌新药(如VP-16、VM-26等)的前体。对其成分的测定有比色法[2]和薄层色谱扫描法[3]，已有多篇论文报道了用HPLC法来测定小檗科桃儿七属和八角莲属植物中鬼臼毒素的含量[4～6]。我们也曾参照了上述方法来分离和检测鬼臼毒素，但发现山荷叶中的1个未知成分与鬼臼毒素部分重叠，未能完全分离，有关这种情况尚未见上述文献进行探讨。为此，我们对此进行了研究。最后得到了较满意的高效液相色谱流动相的组成，同时也考察了不同的溶剂和提取方法对鬼臼毒素含量测定的影响。
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1 仪器、试剂和药品
Hewlett-Packard 1100高效液相色谱仪, 四元梯度泵, DAD检测器, HP ChemStation化学工作站。甲醇(色谱纯),双蒸水,鬼臼毒素对照品(98%，Sigma公司), 生药购自湖北巴东，经江苏植物研究所邓懋彬教授鉴定为南方山荷叶(Diphylleia sinensis Li)。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱：Whatman PartiShere C18(125 mm×4.6 mm, 粒径5 μm)，流动相：甲醇-0.1 mol.L-1磷酸氢二钾(pH≈7.5)(50∶50)，流速：1.0 mL.min-1，检测波长：290 nm，柱温：25 ℃。
2.2 线性范围 精密称取鬼臼毒素对照品，用流动相稀释成浓度为2.6、5.2、7.8、10.4和13.0 μg.mL-1的溶液，分别进样10 μL(重复进样3次)，测得鬼臼毒素的平均峰面积分别为11.85、23.65、34.54、46.28和58.91，以对照品溶液浓度(μg.mL-1)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得一线性方程为：Y＝0.021+4.49 X r＝0.9994
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2.3 加样回收率试验 进行加样回收率试验，按含量测定项下操作，测得平均回收率为101.4 %，RSD为1.2 %，n=3。
2.4 精密度试验 取样品测定项下的溶液，按含量测定项下操作，重复进样6次，测得鬼臼毒素的峰面积，RSD为0.9 %。
2.5 溶剂及抽提方法的试验 分别采用不同的溶剂(甲醇、乙醇、丙酮和氯仿)及提取方法(索氏提取和超声波抽提)来测定鬼臼毒素的提取效果。其中以80%的甲醇水溶液，用超声波抽提所得到的溶液中鬼臼毒素的含量为最高，约比用乙醇回流8 h高出10%。另外比较了抽提时间的影响，发现用超声波抽提30 min和60 min基本上没有差别。所以，最后确定样品的提取方式为用80%的甲醇水溶液超声波振荡30 min。
2.6 样品测定 分别精密称取3份山荷叶根茎的粉末25 mg于25 mL的容量瓶中，加80%的甲醇水溶液适量，用超声波振荡30 min，溶液冷却至室温后，再用80%的甲醇水溶液稀释至刻度。摇匀后离心，取上清液10 μL，注入高效液相色谱仪，重复进样3次，测得鬼臼毒素的平均峰面积，以外标法测定其含量。测得山荷叶中鬼臼毒素的含量分别为7.4 %、7.5 %和7.8 %。
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3 讨论
3.1 流动相的选择 我们参照文献[4～8]，用甲醇-水(50∶50)作为流动相，但同时使用了206、265和290 nm 3个波长来检测，结果发现在206和290 nm处，鬼臼毒素表现为峰前延或有一肩峰，与文献报道的色谱图相似，而在265 nm，则明显有一未知成分未能与鬼臼毒素分离(图1)。由DAD检测器测得该杂质在262 nm处有最大吸收，而鬼臼毒素在206和290 nm处有最大吸收，相对在265 nm处吸收较小，所以才有上述结果。为此，我们选择了不同类型和浓度的缓冲液及离子对试剂对该杂质和鬼臼毒素进行分离，但在酸性条件下，与甲醇的比例为50∶50时，结果与甲醇-水(50∶50)一样，甲醇比例降低时，该杂质峰反而与鬼臼毒素合并为1个峰。于是我们选择了0.1 mol.L-1的磷酸氢二钾(pH≈7.5) 缓冲液,当流动相中甲醇和0.1 mol.L-1的磷酸氢二钾缓冲液(pH≈7.5)的比例为50∶50时，这一未知成分与鬼臼毒素达到了完全分离，在此条件下，鬼臼毒素的出峰时间约为7.5 min，达到了快速分析的目的。
3.2 改用超声波法振荡抽提后，不仅简化了提取方法，大大地缩短了提取时间，而且也减少了由提取操作引入的误差，提高了鬼臼毒素的提取率。
3.3 由HPLC法测得山荷叶中鬼臼毒素的含量比文献[1]报道的要高，这可能与植物的产地、干燥程度、提取方法以及测定方法等有关。, http://www.100md.com