关键词：
摘要 报告8例儿童肝豆状核变性(HLD)患者P型ATP7B酶基因突变情况。应用PCR-SSCP方法检测第14外显子，运用限制性内切酶酶切和DNA直接序列分析技术检测第8外显子。结果8例患儿均未发现第14外显子泳动变位，4例发生第8外显子Arg778Leu纯合子突变，1例存在Arg778Leu杂合子突变。所有上述Arg778Leu突变均伴有第770位C→G多态。在8例患儿中受累染色体频率：纯合子(8/16)50%，杂合子(1/16)6.25%。表明第8外显子突变是儿童肝豆状核变性的突变热点。MspⅠ限制性内切酶酶切检测是一种简便、经济、快速的诊断方法。
Abstract Mutations in P type ATPase7B gene in 8 children with hepatolenticular degeneration disease ( HLD ) were reported.We used PCR-SSCP ( polymerase chain reaction single strand conformation polymorphism ) for detecting exon 14 ， used restricted endonuclease digestion and DNA direct sequencing to detect exon 8 ， and didn ’ t find abnormality of exon 14 in 8 patients.We identified one missence mutation in 5 patients from 4 unrelated HLD families.4 of them were homozygous for Arg778Leu.One is heterozygous for Arg778Leu.They all accompany one polymorphism ， C → G ( CTC → CTG ； Leu → Leu ) in 770 position.The mutating allele frequency is 50 %( 8 / 16 ) for homozygous and 6.25 %( 1 / 16 ) for heterozygous.The results suggested that Arg778Leu in exon 8 is the hot spot mutation in children with HLD.Restricted endonuclease digestion is simple ， fast and economic method.
Key words Hepatolenticular degeneration Gene mutatio Children
肝豆状核变性(HLD)是一种铜代谢异常的常染色体隐性遗传病。若能早期诊断并正确治疗，可获良好效果；若诊断过晚，则严重影响预后[1] 。因此，临床上急需能够早期诊断(包括症状前诊断)的方法，更为理想的是产前能诊断而避免患儿出生。现已知基因突变检测能够客观地区分患者和杂合子，做到早期诊断、症状前诊断或产前诊断。目前国内外尚未有对儿童HLD基因突变研究的专门报道。为此，我们观察了8例儿童HLD患者P型ATP7B酶基因突变情况，比较与成人基因突变的差别，并分析其与临床表现型的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象 8例均系本院儿科诊治的HLD患儿，来自山东省7个家庭，汉族，男4例、女4例，发病年龄7～14岁，肝型6例、肝神经型2例。HLD诊断标准：①排除其他原因的肝病和(或)神经系统异常。②角膜K-F环阳性。③血清铜氧化酶光密度减低。④血铜降低。⑤24小时尿铜定量升高。同时随机选取无血缘关系的20例(男8例、女12例)健康儿童作为正常对照。
1.2 方法 ①基因组DNA抽提：从4ml新鲜静脉血中(EDTA抗凝)分离白细胞，常规方法提取基因组DNA。②引物设计及目的基因片段的体外扩增：根据1995年Thomas文献设计引物(上海生工公司合成)[2] ，能特异性地扩增第8外显子和第14外显子及侧翼区域。③第14外显子PCR-SSCP：第14外显子PCR扩增产物为301bp，15μl扩增体系。分别在4℃和20℃时扩增，用竖式电泳仪(BioRad USA)500V分别电泳5小时和3小时。④第8外显子PCR后限制性内切酶消化：选用限制性内切酶Msp Ⅰ(Promega USA)识别CCGG。第778位点突变后CCGG→CTGG(Arg778Leu)或者CCGG→CAGG(Arg778Gln)。导致酶切位点丧失。正常人PCR产物经酶切后为256bp和40bp两个片段；杂合子为296bp、256bp、40bp三个片段；纯合子酶切位点消失，仅296bp。⑤第8外显子DNA直接序列分析：用5′端标记生物素引物扩增PCR产物，反应体系50μl用于DNA测序。2%低熔点琼脂糖凝胶(进口分装，中国医药上海化学试剂公司)100V，50分钟，EB染色(0.5μg/ml)，紫外灯下割胶，置于预称重的2ml Eppendoff管内。经QIA quick gel extraction kit纯化(Qiagen Inc.Germany)。纯化后的PCR产物30μl与链霉抗生物素蛋白(Streptavidin)包被的磁珠(Dynabeads M-280，Dynal Norway)25μl混合，室温下静置30分钟，磁场吸引去上清，用结合/清洗缓冲液(10mM Tris-HClpH7.5、1mM EDTA pH8.0、NaCl2.0M)，磁场离心去上清。用0.1MNaOH室温下静置10分钟，磁场吸引去上清，沉淀用0.1MNaOH、10mM Tris(0.1mol/LNaCl)、0.01M Tris液各洗1次，磁场吸引去上清。应用USB version2.0测序试剂盒(USB USA)，α32 P-dATP(20Ci/L，北京亚辉生物医学公司)。测序程序按试剂盒操作指南进行。
2 结果
2.1 14外显子PCR-SSCP分析 8例患儿经用两种PCR-SSCP分析(4℃和20℃，含10%甘油)未发现泳动变位。
2.2 第8外显子PCR产物行限制性内切酶分析 8例患儿中经用Msp Ⅰ(Promega USA)检出纯合子突变4例，杂合子1例。用酶切分析1例家系，证实其父母均为杂合子。
2.3 第8外显子DNA测序 证实第8外显子有2种突变，一为错义突变，一为多态。来自3个家系的4例患儿证实为Arg778Leu纯合子，另1无关家系的HLD患儿为Arg778Leu杂合子。碱基改变为2333C→T。所有上述碱基改变的患儿均伴有Leu→Leu(2310C→GCTC→CTG)多态，与酶切结果相一致。
2.4 基因突变与临床表现型的关系 在检出突变的患儿中，除1例肝神经性为Arg778Leu杂合子外，其余4例肝型患者为Arg778Leu纯合子，发病年龄为7～14岁。本研究显示：Arg778Leu突变患者纯合子突变频率50%(8/16)，杂合子受累染色体突变频率为6.25%(1/16)。
3 讨论
HLD发病率约为1/30000，杂合子频率约为1/90，不同民族和地区HLD基因突变热点不同，体现了复杂的遗传异质性。1993年，三个不同的实验室运用定位克隆策略发现HLD患者存在P型ATP7B酶基因突变，为HLD基因突变检测揭开了帷幕。至今，世界各地已报道了130余种突变。其中，欧美、澳大利亚等地第14外显子H1069Q为突变热点，欧美白人的突变热点分别为外显子14(28%)和外显子18(10%)。自1995年Thomas检测到两例香港HLD患者Arg778Leu后，1996年台湾报道第8外显子778位突变：Arg778Leu(18.1%)、Arg778Gln(9.0%)；日本报道Arg778Leu突变率12%；1998年南朝鲜学者报道Arg778Leu突变率37.5%；同年王柠报道第8外显子Arg778Leu和Arg778Gln突变率合计37.5%[3] 。以上证实第8外显子778点突变是东亚包括中国HLD基因突变热点之一。
国内外对于儿童肝豆状核变性基因突变情况尚未见专门研究，本研究针对儿童患者进行了检测。我们运用PCR-SSCP未测得第14外显子泳动变位。通过运用酶切及测序结果均证实第8外显子Arg778Leu突变为我们所检测样本的突变热点。PCR-SSCP是简便有效的检测突变技术，单链DNA在非变性丙烯酰胺凝胶中，迁移率与一级序列密切相关，估计SSCP对突变检出率受到温度、甘油浓度、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺浓度、缓冲液浓度等因素影响。运用两种或两种以上SSCP技术可提高突变检出率。我们运用4℃和20℃含10%甘油两种PCR-SSCP分析未发现第14外显子泳动变位，初步说明第14外显子点突变不是中国儿童HLD患者的基因突变热点。
运用限制性内切酶酶切技术筛查第8外显子，酶切结果准确、快速、简单，避免同位素污染。限制酶酶切可鉴别纯合子、杂合子、正常人。我们检出4例纯合子、1例杂合子，并分析1个家系证实其父母为杂合子。此技术所需设备简单，可用于临床筛查，但不能证实何种碱基突变，尚需测序证实。我们进行了DNA直接序列分析，结果在8例患儿中发现4例(来自3个不相关家系)发生第8外显子Arg778Leu纯合子突变，另1例Arg778Leu杂合子突变，证实与酶切结果相一致。DNA直接序列分析中，双链DNA中一条链被生物素酰化(上游引物的5′端)，其后这种一半被酰化的DNA结合于链霉抗生物素蛋白包被的磁珠。碱变性处理，使DNA链变性。通过磁场捕捉结合了生物素酰化DNA单链的磁珠，使之与另一条链分开。此单链可用作测序反应的模板。根据Sanger双脱氧法测序。本研究使用的DNA测序酶是DNA测序酶2.0版本(USB USA)，不会由于错误掺入而导致测序结果错误。
本文观察的8例HLD患儿，发病年龄较早，均有肝损害，其中半数患儿(4例)发现第8外显子存在纯合突变，突变率高达50%。此结果比我国成人HLD研究资料为高，可能表明第8外显子纯合突变者发病较早，肝损害发病率高。但由于本组观察病例较少，尚未发现与第8外显子突变检测阴性患者临床表现型的差异，亦未证实基因突变与临床疗效的关系，尚需进一步观察。
参考文献
1，李堂.大剂量硫酸锌与小剂量青霉胺联合治疗儿童肝豆状核变性长期随访.中华医学遗传学杂志，1999，16(1)：19～21.
2，Thomas GR，Forbes JR，Roberts EA，et al，The Wilson disease gene：spectrum of mutations and their consequences，Nat Genet，1995，9：210～217.
3，王柠.经DNA测序证实的肝豆状核变性基因突变热区的研究.中华神经科杂志，1998，31(5)：20～23.
( 2000-02-06 收稿) , http://www.100md.com