应用连锁分析方法对X连锁型视网膜色素变性进行基因诊断的研究

http://www.100md.com 《中华医学杂志》 1999年第1期

刘木根 魏勇 刘立 孙喜元 金磊 吴学军黄达啬 周久模 刘又鹗 褚仁远 柴建华 200433上海，复旦大学遗传学研究所人类基因组实验室(刘木根 魏勇 刘立 孙喜元 金磊 吴学军 黄达啬 柴建华)；华西医科大学第一医院眼科(周久模)；上海闸北区眼科医院(刘又鹗)；上海医科大学眼耳鼻喉医院眼科(褚仁远) 中华医学杂志 1999 0 79 1
关键词：视网膜炎，色素性；连锁；染色体；基因；诊断 期刊 zhyxzz 0 基础研究 fur -->

【摘要】 目的 探讨用连锁分析方法对X连锁型视网膜色素变性(RP)进行基因诊断的可行性。方法 选用RP3及RP2所在染色体区间，即Xp21.1～p11.23的10个微卫星染色体位标，对X连锁型RP家系进行了连锁分析，通过家系成员的单倍型分析，确定致病基因所在的染色体位置，进而判定欲检测个体是否携带该染色体区段。结果 确定4个X连锁隐性RP家系致病基因在RP3和RP2的染色体区间，对各家系中的年幼女性是否为携带者，年幼男性是否将会发展成为患者进行了基因诊断。结论 该方法可用于X连锁型RP疾病，也可用于其他X连锁或常染色体连锁的孟德尔遗传病。

Gene diagnosis of Xlinked retinitis pigmentosa by linkage analysis LIU Mugen, WEI Yong, LIU Li，etal, Human Genome Laboratory, Institute of Genetics, Fudan University, Shanghai 200433
【Abstract】 Objective Toestablish a gene diagnosis method for X linked retinitis pigmentosa (XLRP). Methods Ten microsatellite markers were selected from the region where theRP2 and RP3 gene may be located at Xp21.1～p11.23.Haplotype analysis for XLRP pedigrees was used to determine the chromosome region which isRP related and whether this region was carried by the individuals we want to detect. Results The young female who is the RP carrier or the young boy who is thepre-symptom RP patient could be determined this way in 4 XLRP family. Conclusion Haplotype analysis for XLRP Pedigrees is useful.
【Key words】 Retinitis pigmentosa Linkage Chromosomes Genes Diagnosis
(Natl Med J China, 1999, 79:54-56)

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一种常见的眼遗传病，具有高度的遗传异质性，包括常染色体显性遗传，常染色体隐性遗传，X连锁显性遗传，X连锁隐性遗传等遗传类
型^[1] ，目前已在不同染色体上发现20多个与RP相关的位点，并已克隆数个RP相关基因。在X染色体上发现了3个RP相关位点，即RP2、RP3与RP6^[2] ，其中RP3基因已被克隆^[3] 。由于X连锁隐性RP占全部RP患者总数的16%～33%^[4] ，是临床表现最严重的类型，且发病年龄早。因此对X连锁RP进行基因诊断,特别是对胎儿的产前诊断和女性携带者的检出具有非常重要的意义。我们根据RP的相关基因的连锁定位信息,选用相关位点周边的多态性DNA位标，采用连锁分析方法对有家族成员作遗传背景的4个X连锁RP家族进行了基因诊断。

对象与方法
一、家系资料
家系LZ采自四川省乐至，家系JG采自四川省剑阁,家系SH采自上海市，家系ZS采自江苏省(家系的命名按其主要成员所在地的汉语拼音简写。家系图见图1)。采血前进行详细的家系调查，对各家系成员收集详细的眼科临床资料(包括夜盲开始年龄，视力，视野和眼底改变等)，见表1。

家系中的代从上到下用罗马数字表示，同代间的顺序从左到右用阿拉伯数字表示，家系图旁沿着竖线排列的是该家系中选择的位标，染色体旁边的数字表示相应位标的单位体型。

图1 4个家系的单倍型分析结果

表1 4个RP家系中患者的临床情况

二、样品DNA制备及微卫星染色体位标的选择
取每位家系成员的静脉血5 ml,分离白细胞，采用琼脂糖包块法制备基因组总DNA^[5] 。选用10个卫星标记,它们在染色体上的次序为(cen)-DXS997-DXS1219-CYBB-DXS1068-DXS993-MAOB-DXS1055-DXS337-DXS1367-DXS1126-(tel)，依次编号为：A，B，C，…J。聚合酶链反应(PCR)引物序列如下:DXS997:5′-tggctttattttaagaggac-3′，5′-gttttcagtttcctgggt-3′；DXS1219:5′-ttaatgtttcanccaggtaaat-3′，5′-gatcactccaaaggatagattgt-3′;CYBB:5′-gaacctataatattgtgcttgcgcaca-3′，5′-gaggcacagcgtgatgacaactc-3′;DXS1068:5′-cccatctgagaacacgctg-3′，5′-cctctaaagcatagggtcca-3′；DXS993:5′-ggatcctgtttacagcctgt-3′,5′-ctacagagcagttcactggg-3′；MAOB:5′-atttggcctcatagagttag-3′，5′-gaagcatcgaagtta ggagt-3′；DXS1055:5′-atgggatacactgttctggg-3′，5′-ttaaacaatgcacaactggg-3′；DXS337:5′-tgcatcattcagctttcagg-3′，5′-gtgacagagtgagaccctgtc-3′；DXS1367:5′-caacatagcgagaccccgtc-3′，5′-tcttgcttttggcttaggtagc-3′,DXS1126:5′-ttctagaaaggtgcgtgtcgtctgg-3′,5′-gaccattcctctcaaacacaaacg-3′，(购自美国ResearchGenetics公司)。
三、PCR反应及各微卫星染色体位标单体型检测
PCR反应体系:20 mmol/L dNTPs,1.5 mmol/L Mg²⁺ ,0.5 μmol/L引物，1UTaq酶;PCR反应条件：94℃30秒,52 ℃～62℃30秒,72℃30秒,PCR反应均在PTC-100仪器上进行。
用6%的聚丙烯酰胺胶(丙烯酰胺：双甲叉丙烯酰胺=19：1,7 mol/L的尿素,0.5×TBE缓冲液,体积分数为0.04的四甲基乙二胺),55W恒功率,预电泳1小时,PCR产物经96℃变性后取5μl上样，电泳1～2小时。电泳完毕后，将聚丙烯酰胺胶在体积分数为0.1的冰醋酸固定20分钟,双蒸水清洗3次,每次2分钟,在染色液(0.001kg/L硝酸银和0.05%甲醛)中染色30分钟,双蒸水清洗10秒钟,在显色液(0.03kg/L碳酸钠,2 mg/L硫代硫酸钠)中显色，待出现清晰条带后加入体积分数为0.1的的冰醋酸固定5分钟,再用双蒸水清洗2分钟，直接读出各自DNA位标的单体型。

结果
将读出的各DNA位标的单体型按家系成员的关系排列：(1)JG家系中Ⅱ1和Ⅱ2是患者，对比Ⅰ1和Ⅱ1，发现染色体在位标J与位标Ⅰ之间有一交换，表明致病基因位于位标J的tel侧；对比Ⅰ1和Ⅱ2，发现在位标E与位标F之间有一交换,表明致病基因位于位标D的cen侧。即在JG家系中致病基因位于位标J与D之间。Ⅱ3和Ⅱ5是女性，由于Ⅱ3得到其母亲含该致病基因的染色体，所以为携带者；Ⅱ5得到的是另一X染色体，故为非携带者，其后代无论男女皆为正常。Ⅲ1得到Ⅱ3的含致病基因的X染色体，为RP患者；Ⅲ2现年11岁，得到的是另一正常X染色体，所以为正常个体。(2)LZ家系中，由Ⅰ2、Ⅱ1及Ⅱ2的单倍型可知，Ⅱ1和Ⅱ2得到Ⅰ2的含致病基因的染色体,为患者；Ⅱ3则得到另一正常X染色体,故应为正常，Ⅲ1现年4岁，今后亦不会发病。(3)ZS家系中，由Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅱ2及Ⅱ3的单倍型可知，该家系的致病基因位于位标G的tel侧，而根据Ⅱ4的单倍型可知，尽管产生Ⅱ4的过程中位标Ⅰ与J之间有一交换，但Ⅱ4从其母亲处不能得到致病RP基因，故不是携带者，其子Ⅲ1现年14岁，也属正常。(4)SH家系中，由Ⅰ1，Ⅱ1，Ⅱ2的单倍型可知，位标D与E之间有一交换，致病基因应位于位标E的tel侧。由Ⅱ3、Ⅲ1及Ⅲ2的单倍型可知，致病RP基因位于位标A的cen侧，故该RP基因定位于位标A与E之间。已知RPGR(RP3)位于位标C与D之间,Ⅲ3现年19岁，从其母亲得到的X染色体因已在位标A与C之间有一交换，不带有RP基因这一区段，所以Ⅲ3为非携带者。

讨论
微卫星标记是基因组中广泛存在的短片段重复序列，因其分布广泛且具有高度的多态性，而常被用来作为染色体上的位置标记进行遗传连锁分析，临床上用以进行基因诊断^[6] 。人X染色体微卫星标志的密度平均已达75Kb，因而为X染色体连锁遗传病的研究提供了便利条件。一般而言，对于已知突变并具有强烈的奠基者效应的遗传疾病，可用PCR单链构象多态分析法，片段长度多态性分析法或直接测序法进行基因诊断。而对于那些只有基因定位资料或其致病基因内部无明确的突变热点的遗传性疾病，只能使用连锁分析的方法进行基因诊断。这一方法适用于具有丰富遗传背景的家系中个体的症状前，产前和携带者的诊断。对于家系成员较少，遗传资料不完备或散发的单个患者则不能使用这一方法。
由于RP2基因还未克隆，尚无法对其基因本身进行检测；RP3基因(RPGR)虽已获克隆，但它有19个外显子，目前尚未发现突变热点，逐个外显子检测相当费时费力^[3，7] ，所以目前宜采用连锁分析方法对其进行基因诊断。我们对4个X连锁隐性RP家系进行了分析，首先确定致病基因的范围，确定家系中包含致病基因的单倍型，通过对家系中疾病位点所在的染色体区段在传递过程中的分离的检测，携带该染色体区段的个体将可以认定为症状前期病员，或致病基因的携带者。

本课题为国家“八六三”(86310210)及自然科学基金(39500080)资助项目

参考文献

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收稿：1998-01-19 修回：1998-08-10

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