关键词：糖尿病，实验性；血红蛋白类；糖基化终产物，高级；肾小球；免疫化学
【摘要】 目的 探讨糖尿病大鼠血红蛋白糖基化终末产物(Hb-AGE)与肾脏改变的关系。方法采用竞争性酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测44只12周和28周病程的链脲佐菌素(STZ)-糖尿病大鼠和14只正常对照大鼠的Hb-AGE含量，并测定尿蛋白/肌酐(Pr/Cr)比值及病程28周时的肾小球基底膜厚度(GBMT)。结果 随着病程的延长，Hb-AGE水平显著增高(P<0.01)，与血糖和HbA1c 呈显著性正相关，但与HbA1c 的关系更密切。Hb-AGE与肾小球组织AGE(GTE-AGE)含量呈显著性正相关(r=0.686 2,P<0.01)，二者与尿Pr/Cr比值和GBMT具显著相关性；胰岛素和氨基胍可降低Hb-AGE水平，减少尿蛋白，阻止基底膜增厚。结论 Hb-AGE可作为AGE循环标志物，反映慢性高血糖和肾小球AGE含量，有助于了解糖尿病时的肾脏改变，其水平长期增高可能是糖尿病肾病的一个危险因素。
Relationship and significancebetween hemoglobin-advanced glycosylation end products and renalalterations in diabetic rats
RONG Jian,QIUHongxin,WANG Shuping
(Department of Endocrinology,Dapin Hospital Affiliated to the Third Military MedicalUniversity,Chongqing 400042)
【Abstract】 Objective ToStudy the relationship between hemoglobin-advanced glycosylation end products (Hb-AGE) andrenal alterations in diabetes. Methods Hb-AGE levels in streptozotocin-induced diabeticrats with different duration of diabetes (12-week and 28-week) were measured withcompetitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and urine protein/creatinine(Pr/Cr) ratio in all rats and glomerular basement membrance thickness (GBMT) in 28-week diabetic rats weredetermined. Results With increasing duration of diabetes, Hb-AGE was significantlyincreased (P<0.01), which was positively correlated with blood glucose concentration andHbA1c content, but more closely correlated with the latter. Hb-AGEsignificently positively correlated with glomerular tissue extracts-AGE (GTE-AGE) (r=0.686 2,P<0.01), and both of them were significantly related to urine protein/creatinine ratioand GBMT. Insulin and aminoguanidine reduced Hb-AGE levels, decreased urine protein andretarded basement membrane thickening. Conclusion Hb-AGE serves as a circulating markerfor AGE, reflecting chronic hyperglycaemia as well as glomerular AGE content, which may beuseful in understanding of diabetic nephropathy. Long-term eleoation of Hb-AGE seems arisk factor of diabetic nephropathy.
【Key words】 Diabetes mellitus, experimental; Hemoglobins;Glycosylation end products, advanced; Kidney glumerulus; Immunochemistry
糖尿病长期高血糖可促进组织非酶促糖基化反应，导致体内大量糖基化终末产物(AGE)形成〔1〕 。采用竞争性酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测体内血红蛋白-AGE(Hb-AGE)较为简便。Hb-AGE可作为AGE循环标志物，反映体内AGE含量，然而它与体内组织，尤其是肾小球组织中AGE含量的关系以及与肾脏结构和功能改变的关系尚未得到证实，本研究对此进行探讨。
材料和方法
一、主要试剂和仪器
链脲佐菌素(STZ)、胃蛋白酶、氨基胍、胶原蛋白酶(Ⅳ型)和标记碱性磷酸酶的抗兔IgG抗体均购自Sigma公司；蛋白酶K为德国Merck公司产品；羟脯氨酸购自上海化学试剂公司；酶标板购自四川仪器厂；其它仪器包括DG3022型酶联免疫检测仪和JEOL800E透射电镜。
二、方法
58只雄性Wistar大鼠，体重148～254 g〔(206±22)g〕，分为四组，腹腔注射STZ(65mg/kg体重，溶于0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液，pH 4.0)，对照组注射等容积的柠檬酸钠缓冲液。72小时后血糖大于17mmol/L诊断为糖尿病。正常对照组(C组)和胰岛素加氨基胍治疗组(DIA组)各7只，胰岛素治疗组(DI组)和糖尿病未治疗组(D组)各8只，喂养12周；C组和D组各7只，DI组6只及DIA组8只，喂养28周。DI组和DIA组每日皮下注射一次鱼精蛋白锌胰岛素2～6单位，血糖和HbA1c 水平基本相同，均高于C组，但又低于D组。氨基胍溶于饮水中，浓度为1.3g/L〔2〕 ，每日饮用。每两周检测一次血浆葡萄糖浓度(氧化酶法)和HbA1c 含量(亲和层析法)；每四周检测一次尿蛋白/肌酐(Pr/Cr)比值。大鼠自由饮水、摄食，混合饲料喂养，自然昼夜采光。
三、Hb-AGE的测定
按Makita方法分离提取血红蛋白(Hb)〔1〕 ，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量并稀释至100μg/ml，用于AGE检测。参照Makita方法用核糖核酸酶-AGE(RNase-AGE)作为免疫原制备抗AGE多克隆抗血清，建立竞争性ELISA法〔3〕 。抗血清与RNase-AGE 和牛血清白蛋白 (BSA)-AGE(BSA-AGE)结合，但不与BSA结合，滴度为1:2 000，55μg/ml BSA-AGE竞争抑制抗血清结合率50%。测定过程简述如下：100 μg/mlBSA-AGE(碳酸钠缓冲液,pH 9.6)加于酶标板上，每孔0.1 ml，进行包被。洗 涤后用 0.2ml 0.2 M PBS(含0.1% BSA，pH 7.4)进行封闭，洗涤后每孔加入50 μl竞争抗原(BSA-AGE或待测样品)，然后加入50μl 1:1 000的抗血清，洗涤后加入标记碱性磷酸酶的抗兔IgG抗体，最后每孔加入0.1ml 1mg/ml PNPP进行显色反应，30分钟后测定波长为405 nm的光密度(A)，计算B/B0 。B/B0 =(实验A值-无抗血清的背景A值)/(无竞争抗原的总A值-背景A值)。以BSA-AGE为AGE标准在半对数坐标纸上绘制标准曲线。AGE含量用AGE单位(AGE.U)表示，1AGE单位等于0.1 mg/ml BSA-AGE所含的AGE量，Hb-AGE测定单位为AGE.U/mg Hb。批内和批间变异系数分别为8.8%和17.6%。
四、肾小球组织提取物-AGE(GTE-AGE)的检测
采用Misra方法分离与制备肾小球〔4〕 ，使纯度>95%，活力>90%。肾小球制成匀浆，氯仿/甲醇(2:1，v/v)去除脂质，用0.5mol/L醋酸和1 mg/ml胃蛋白酶去除非胶原蛋白，再用0.1 mg/mlⅣ型胶原酶和0.1 mg/ml蛋白酶K消化处理，上清液即为肾小球组织提取物(GTE)，用于AGE含量检测(测定过程与Hb-AGE测定相同)。羟脯氨酸在胶原蛋白中的含量较恒定(约占总量的14%)，故可换算胶原蛋白含量。采用Edwards方法〔5〕 测定GTE中羟脯氨酸含量。测定单位为AGE.U/mg胶原蛋白(AGE.U/mgcoll)。批内及批间变异系数为5.2%和9.6%。采用Jensen法〔6〕 。在电镜下测量肾小球基底膜厚度(GBMT)，单位为nm。
五、统计学处理
结果以x±s表示。两组间检测值比较采用t检验，多组间采用q检验。相关分析采用直线相关分析和多元线性回归与相关分析。
结 果
一、不同时期各组大鼠Hb-AGE的比较(表1)
病程28周时Hb-AGE与病程12周时相比较，D组显著增高(P<0.01)，DI组、DIA组和C组差异无显著性。12周时，D组与DI组差异无显著性，两组显著高于C组和DIA组(P<0.01)，C组与DIA组之间差异无显著性。28周时，D组显著高于DI组(P<0.01)，二 组显著高于 C组和DIA组(P<0.01)，DIA组与C组差异仍无显著性。表明D组和DI组的Hb-AGE水平于12周时已明显增高，到28周时继续增高，D组增高更为明显；DIA组Hb-AGE水平到28周时仍无明显增加。
二、Hb-AGE与血糖的关系
直线相关分析显示Hb-AGE与血糖和HbA1c 均呈显著性正相关，相关系数(r值)分别为0.548 3(P<0.01)和0.592 6(P<0.01)；多元线性回归和相关分析显示Hb-AGE与血糖和HbA1c 的偏相关系数 分别为 0.214 9(P=0.108 4) 和 0.339 4(P=0.009 8)。表明Hb-AGE与HbA1c 关系更密切，Hb-AGE水平与慢性高血糖相关。
三、Hb-AGE与肾小球组织AGE的关系
表1 不同病程及分组之间Hb-AGE、GTE-AGE及肾脏改变的比较(x±s)
Tab 1 Comparision of Hb-AGE, GTE-AGE andrenal alteration among different groups with different durations of disease (x±s)
| Hb-AGE | GTE-AGE | Pr/Cr ratio | GBMT | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 组别 | (AGE.U/mg Hb) | <(AGE.U/mg coll) | <(mg/mmol) | <(nm) | <||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Group | < | < | < | < | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 正常对照组 | < | < | < | < | < | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Normal control | 5 | 3.85±0.40 | 1.17±0.06 | <12周 | 28周 | <12周 | 28周 | <12周 | 28周 | <28周 | <||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| < | 12-week | 28-week | 12-week | 28-week | 12-week | 28-week | 28-week | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| D组 | 9.32±1.55(8) | 16.98±4.97(7)△△ | 1.94±0.41(8) | 2.47±0.31(7)△△ | 177.3±41.4(8) | 286.35±37.29(7)△ | 191.00±14.64(7)△△ | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Group D | < | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 8.85±2.09(8)▲ | 10.60±4.47(6)▲ | 1.71±0.25(8)▲ | 1.96±0.57(6)▲ | 127.2±45.4(8) | 230.39±54.03(6)▲ | 177.00±13.43(6)▲ | <||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DI组 | < | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Group DI | 4.10±1.06(7) | 3.94±1.02(8) | 1.26±0.26(7) | 1.41±0.54(8) | 151.5±41.9(7) | 132.35±35.03(8) | 135.38±13.14(8) | <|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| < | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DIA组 | 3.09±0.56(7) | 4.03±1.22(7) | 1.06±0.50(7) | 1.13±0.28(7) | 159.3±47.6(7) | 120.39±38.39(7) | 141.71±3.35(7) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表2 病程28周时尿Pr/Cr比值及GBMT与各观察指标的简单和多元线性相关分系(28例)
Tab 2 Simple and multiple linearcorrelation analysis among urine Pr/Cr ratio, GBMT and related items at 28-week (n=28)
| 检测项目 | 血糖 | HbA1c | Hb-AGE | GTE-AGE | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Items | Blood glucose | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 尿Pr/Cr比值 | 0.548 0(<0.01) | 0.700 4(<0.01) | 0.793 2(<0.01) | 0.818 0(<0.01) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Urine Pr/Cr ratio | < | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.138 4(0.518 1) | 0.168 9(0.430 3) | 0.419 0(0.041 5) | 0.441 0(0.030 9)△ | <||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| GBMT | < | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Group DI | 4.10±1.06(7) | 3.94±1.02(8) | 1.26±0.26(7) | 1.41±0.54(8) | 151.5±41.9(7) | 132.35±35.03(8) | 135.38±13.14(8) | <0.463 6(0.013 0) | 0.609 4(<0.01) | 0.796 5(<0.01) | 0.843 4(<0.01) | <||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| < | < | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DIA组 | 3.09±0.56(7) | 4.03±1.22(7) | 1.06±0.50(7) | 1.13±0.28(7) | 159.3±47.6(7) | 120.39±38.39(7) | 141.71±3.35(7) | 0.310 8(0.139 4) | 0.229 4(0.280 9) | 0.586 1(0.002 6) | 0.625 5(0.001 1)△ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GTE-AGE含量在不同病程时期和不同分组之间的变化与Hb-AGE水 平变化是 相一致的(表1)；直线相关分析显示GTE-AGE与血糖、HbA1c 和Hb-AGE呈显著正相关，相关系数分别为0.571 3(P<0.01)、0.699 3(P<0.01) 和 0.686 2(P<0.01)；多元线性回归和相关分析显示GTE-AGE与血糖、HbA1c 和Hb-AGE 的偏相关系数分别 为0.165 8(P=0.165 8)、0.182 0(P=0.179 6)和0.486 1(P=0.000 1)。表明肾小球组织AGE含量直接与Hb-AGE水平相关。
四、Hb-AGE与GBMT和尿Pr/Cr的关系
病程12周时各组间的尿Pr/Cr差异无显著性。相关分析显示Hb-AGE与尿Pr/Cr相关无显著性(r=0.0664,P>0.05)；病程28周时D组尿Pr/Cr和GBMT显著高于DI组(P<0.05)，DI组显著高于DIA组(P<0.01)，而DIA组与C组差异无显著性(表1)。相关分析显示尿Pr/Cr和GBMT均与血糖、HbA1c 和Hb-AGE显著性正相关，但尿Pr/Cr和GBMT只与Hb-AGE的偏相关系数具有统计学意义，表明尿Pr/Cr和GBMT与Hb-AGE关系更密切；GTE-AGE与尿Pr/Cr和GBMT的关系与Hb-AGE是相一致的(表2)。
讨 论
糖尿病状态下大量形成的AGE可损伤肾小球，与糖尿病肾病的发生、发展有关〔1，7〕 ，因此AGE的监测就显得尤为重要。本研究参照Makita方法建立了竞争性ELISA法用以检测体内AGE含量，但临床上肾小球AGE的检测极其困难。Makita等对糖尿病大鼠动脉胶原组织进行酶消化处理后，直接采用ELISA法检测动脉胶原组织中AGE含量，发现病程32周时AGE含量增加一倍多〔3〕 。我们采用该法检测了病程28周的糖尿病大鼠肾小球胶原组织AGE含量，结果显示增加1.24倍；而此时血中Hb-AGE含量增加3.21倍，提示在Hb更容易形成AGE，其原因还不清楚，可能由于血清蛋白上形成具有反应活性的AGE更容易对循环中红细胞内Hb进行修饰，或在Hb上AGE有更快的形成和转换速度〔8〕 。
本研究发现随着病程延长，Hb-AGE与GTE-AGE均显著增加；氨基胍是AGE形成抑制剂〔1〕 ，它和胰岛素治疗可减少Hb-AGE和GTE-AGE形成，并且Hb-AGE与GTE-AGE呈显著性正相关，因此本研究认为Hb-AGE水平变化可反映GTE-AGE含量变化。结果也表明代谢控制可降低体内AGE含量，与氨基胍治疗有协同效应。胰岛素治疗与胰岛素加氨基胍治疗相比较，Hb-AGE水平差异很明显，表明了体内糖基化作用与氧化作用的联系；由于Hb-AGE形成的不可逆性及HbA1c 形成的可逆性，因此与HbA1c 相比较，Hb-AGE水平可能反映更长时期的血糖或代谢控制情况〔9〕 。
尿Pr/Cr与尿白蛋白排泌率呈正相关，并可反映24小时尿蛋白量〔10〕 。本研究发现病程12周时糖尿病大鼠尿Pr/Cr无显著变化。到病程28周时，糖尿病大鼠尿Pr/Cr显著增高，不仅如此，GBMT也显著增加，此时Hb-AGE水平进一步增高；代谢控制和氨基胍在减少Hb-AGE形成的同时也减缓了尿Pr/Cr升高及肾小球基底膜增厚。尿Pr/Cr及GBMT分别与血糖、HbA1c 和Hb-AGE呈正相关，由于后三者之间也存在相关性，可影响三者与肾脏改变的关系，因此本研究作了多因素分析，结果显示肾脏改变与Hb-AGE的偏相关系数具有统计学意义。表明长期Hb-AGE水平增高与尿蛋白增加、基底膜增厚和GTE-AGE含量有着更为密切的关系；也表明长期氨基胍治疗和有效的血糖控制能降低Hb-AGE和GTE-AGE水平。因此提示氨基胍或(和)胰岛素治疗对糖尿病肾病可能具有一定防治作用。
参 考 文 献
1，Vlassara H, Bucala R,Striker L. Pathogenic effects of advanced glycosylation: Biochemical, biologic, andclinical implications for diabetes and aging. Lab Invest, 1994,72:138-141.
2，Soulis-Liparota T, Cooper M, Papazoglou D, et al. Retardation by aminoguanidine ofdevelopment of albuminuria, mesangial expansion, and tissue fluorescence instreptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes, 1991,40:1328-1331.
3，Makita Z, Vlassara H, Creami A, et al. Immunochemical detection of advancedglycosylation end products. J Biol Chem, 1992,267:5133-5138.
4，Misra RP. Isolation of glomeruli from mammalian kidneys by graded sieving. Am J ClinPathol, 1972,58:135-139.
5，Edwards CA, O'brien WD. Modified assay for determination of hydroxyproline in a tissuehydrolyzate. Clin Chim Acta, 1980,104:161-167.
6，Jensen EB, Gundersen HJD, Osterby R. Determination of membrane thickness distributionfrom orthogonal intercepts. J Microsc, 1979,115:19-33.
7，Makita Z, Radoff S, Rayfield EJ, et al. Advanced glycosylation end products inpatients with diabetic nephropathy. N Engl J Med, 1991,325:836-842.
8，Makita Z, Vlassara H, Rayfield E, et al. Hemoglobin-AGE: a circulating marker ofadvanced glycosylation. Science, 1992,256:651-654.
9，Wolffenbuttel BRH, Giordano D, Founds HW, et al. Long-term assessment of glucosecontrol by haemoglobin-AGE measurement. Lancet, 1996,347:513-517.
10，汪恕萍， 唐纪平， 邱鸿鑫.糖尿病患者微量蛋白尿的检测及其意义. 新医学， 1989，20：466-471.
(收稿日期：1998-08-18 ) , http://www.100md.com