关键词：载脂蛋白E；基因型；多聚酶链反应；限制性片段长度多态性
【摘要 】 目的 建立载脂蛋白 E基因型分型聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性方法。方法 用特异的探针对氨基酸 112和 158多形基因区基因组的 DNA扩增，产物用 HhaⅠ酶消化，其片段在 4%琼脂糖凝胶分离。结果 经消化的载脂蛋白 E片段在琼脂糖上，ε 2 /ε 2 为 91、 83、 38 bp，ε 3 /ε 3 为 91、 48、 38 bp，ε 4 /ε 4 为 72、 48、 38 bp，ε 2 /ε 3 为 91、 83、 48、 38 bp，ε 2 /ε 4 为 91、 83、 72、 48、 38 bp，ε 3 /ε 4 为 91、 72、 48、 38 bp。 300名献血员其载脂蛋白 E基因分布频率分别为ε 2 /ε 2 0%，ε 3 /ε 3 74%，ε 4 /ε 4 0%，ε 2 /ε 3 16%，ε 2 /ε 4 2%，ε 3 /ε 4 8%。结论 以聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性方法进行载脂蛋白 E基因型分型，具有清晰、简便、快速等优点。
Human apolipoprotein ε 2 /ε 3 /ε 4 genotype determined Gu Guiling, Wang Qun, Guo Hengchang, Bo Li Bioengineering CO.Biomolecular Lab, Shanghai 200233
【 Abstract 】 Objective To establish a polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay of apolipoprotein E (apo E) genotype ε 2 , ε 3 and ε 4 . Methods Genomic DNA was amplified with specific primers that included the polymorphic region of amino acid 112 and 158. Digestion of the product with Hha I resulted in unique fragments that were separated on agarose.Results The digested apo E fragments on agarose were ε 2 /ε 2 : 91, 83, and 38 bp; ε 3 /ε 3 : 91, 48 and 38 bp; ε 4 /ε 4 : 72, 48 and 38 bp; ε 2 /ε 3 : 91, 83, 48, and 38 bp; ε 2 /ε 4 : 91, 83, 72, 48 and 38 bp; ε 3 /ε 4 : 91, 72, 48 and 38 bp. The relative frequencies of the ε 2 /ε 2 , ε 3 /ε 3 , ε 4 /ε 4 , ε 2 /ε 3 , ε 2 /ε 4 , ε 3 /ε 4 were 0, 74, 0, 16, 2 and 8 respectively in 300 healthy donors.Conclusions The PCR-RFLP assay of human apo E genotype on agarose possesses such advantages as simplicity and rapidity.
【 Key words 】 Apolipoprotein E Genotype Polymerase chain reaction Restriction frament length polymorphism
载脂蛋白 E(apo E)是调节含载脂蛋白 B代谢的重要因素之一。 apoE基因位于第 19号染色体上并与载脂蛋白 C-Ⅰ、 C-Ⅱ共同形成基因簇[ 1] 。 1980年 Utermann[ 2] 首次报道血清经超速离心后，密度< 1.006 kg/L的部分用等电聚焦电泳分离，发现 apoE存在 3种异构体，即 E2、 E3、 E4。用等电聚焦电泳分析 apoE的异构体，首先要通过超速离心，将极低密度脂蛋白分离，然后再作等电聚焦电泳分析。此方法血清需要量多，耗时，判读结果也不清楚。 1990年 Hixson等[ 3， 4] 发现， apoE 3种异构体 E2、 E3、 E4分别由 apo E 3个等位基因ε 2 、ε 3 、ε 4 所决定。对 apoE分型以聚合酶链反应，限制性片段长度多态性 (简称 PCR-RFLP)方法为主，以聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分析结果。
近年来我们根据文献[ 3～ 6]，结合一般实验室具备的条件，用高浓度的琼脂糖凝胶分析 PCR-RFLP产物，使方法大为简化。本方法的建立对从分子水平阐明 apoE基因多态与疾病的关系，对相关疾病的预防及早期治疗有较重大意义。现报道如下。
材料与方法
一、血液标本处理
取抗凝血或全血 200 μ l，置于 1.5 ml eppendorf管中。加入裂解液 A(1% Triton X-100 0.5 ml, 20 mmol/L Tris-HCl pH7.6, 0.5 ml水至 50 ml)1 ml，混匀，经 10 000 r/min离心 5分钟，弃去上清，重复上述过程 1至 2次，直至上层液变清。沉淀中加入裂解液 B(500 mmol/L EDTA 1 ml， 20% SDS 5 ml， 2 mol/L Tris-HCl 250 μ l， NaCl 0.4387 g，水至 50 ml)150 μ l和蛋白酶 K(25 mg/μ l)3 μ l，置 37℃过夜。次日，加入饱和蒸馏酚和氯仿异戊醇 (24∶ 1)混合液各 75 μ l，充分混匀 2～ 3分钟，经 10 000 r/min离心 3分钟，吸上清液移入另一 1.5 ml eppendorf管中。加入 2倍体积无水乙醇和 3 mol/L醋酸钠 6 μ l，混匀，于室温放置 5分钟，再于 -20℃放置 20分钟。以 12 000 r/min转速离心 20分钟后，小心弃上清，加入 70%乙醇 200 μ l洗涤 1次， 12 000 r/min离心 15分钟，小心弃上清液并吹干。在沉淀中加 20 μ l TE(Tris 1 mol/L， EDTA 0.1 mmol/L， pH 7.6)，置 4℃备用。
二、 PCR扩增
在 0.5 ml eppendorf管中，依次加入 PCR反应液 20 μ l，超纯水 23 μ l， Taq酶 (Promaga)2 μ l， DNA样品 5 μ l，经 4 000 r/min离心 1分钟。再加入石蜡油 30 μ l，离心 1分钟，置 Perkin-Elmer Cetus 480热循环仪上扩增，条件为 95℃ 2分钟， 94℃ 30秒， 60℃ 30 秒， 72℃ 40秒，共 35个循环；最后 72℃延长 2分钟。所用引物序列： 5′ ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTA-CAC3′ 5′ TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA3′[ 3] ，由本室使用 Biosystems 380 A型 DNA合成仪合成。
取产物 5～ 8 μ l在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳，正常应有单一 246 pb条带，且无非特异条带。
三、 RFLP检测
吸取已鉴定的 PCR扩增产物移入另一 0.5 ml eppendorf管中，加入 HhaⅠ酶 (10 U/μ l)0.5 μ l充分摇匀，待离心片刻，置 P-E Cetus 480， 37℃ 6小时以上。次日，轻掀开管盖，并吸出全部 PCR扩增产物，加入溴酚蓝蔗糖溶液 (0.25%/40%)2 μ l，于 4%琼脂糖 (Sigma公司 )凝胶上电泳 1.5小时 (100 V)。电泳毕，在紫外灯下观察并记录结果。
琼脂糖凝胶配置：取琼脂糖 1.6 g加 TAE(Tris 4.84 g， NaEDTA. 2H2 O 0.744 g，冰乙酸 1.14 ml)缓冲液 40 ml，在 100℃水浴溶解，动作须轻缓，防止产生气泡。待完全溶解并冷却至 65℃再浇板，凝胶凝固后放入含 EB(溴化乙啶 0.5 μ g/ml)溶液的 TAE缓冲液中浸泡 30分钟 (EB30 μ l/TAE 500 ml)。
四、结果判读：将照片结果与附表对照，做出分型结果。
附表 不同 apoE基因片段电泳分离结果
| bp | ε 2 /ε 2 | ε 3 /ε 3 | ε 4 /ε 4 | ε 2 /ε 3 | ε 2 /ε 4 | ε 3 /ε 4 |
| 91bp | — | — | — | — | — | |
| 83bp | — | — | — | |||
| 72bp | — | — | — | |||
| 48bp | — | — | — | — | — | |
| 38bp | — | — | — | — | — | — |
| 35bp | — | — | — | — | — |
结果
一、 apo E DNA的 PCR扩增结果
图 1为经 PCR扩增后，其产物在 1.5%琼脂糖凝胶电泳的结果。所有样品在 246 bp都有一条明显的条带，没有非特异性的条带出现。
二、 apo E基因型检测图谱
PCR扩增产物经 HhaⅠ酶切后，于 4%琼脂糖凝胶电泳，图 2显示经电泳分离后，不同 apo E基因型的片断。
ε 2 /ε 2 为 91、 83、 38 bp；ε 3 /ε 3 为 91、 48、 38 bp；ε 4 /ε 4 为 72、 48、 38 bp；ε 2 /ε 3 为 91、 83、 48、 38 bp；ε 2 /ε 4 为 91、 83、 72、 48、 38 bp；ε 3 /ε 4 为 91、 72、 48、 38 bp。
三、 300名正常人 apoE基因型频率分布
我们用本法检测 300名健康献血员，其 apo E基因频率如图 3。
图 1 apoE DNA PCR扩增结果 |
图 2 经电泳分离后不同 apoE基因片段
图 3 300例正常人 apoE基因分布频率
讨论
apoE基因位于 19号染色体， apoE的遗传多态主要由位于同一基因位点上的 3个等位基因 (ε 2 、ε 3 、ε 4 )所控制，分别编码血浆中 3种异构体，构成 6种不同的基因型， 3种纯合子 (ε 2 /ε 2 、ε 3 /ε 3 、ε 4 /ε 4 )， 3种杂合子 (ε 2 /ε 3 、ε 2 /ε 4 、ε 3 /ε 4 )。血浆表现型以等显型形式遗传为 E2/E2， E3/E3， E4/E4， E2/E3， E3/E4。
apoE多态性的分子基础是 112位点上半胱氨酸 TGC(Cys)和 158位点上精氨酸 CGC(Arg)的互换，其 DNA序列分别是 TGC(Cys)和 CGC(Arg)， apoE2均为 Cys[ (G)TGC]，而 apo E3 112位是 Cys[ (G)]， 158位是 Arg[ (G)CGC]， apoE4中二点为 Arg[ (G)CGC]。由于限制性内切酶 HhaⅠ特异性地识别 GCGC序列，故 HhaⅠ酶可以识别 Arg位点 DNA序列 (前面也有一个 G)，而不能识别 Cys位点 DNA序列 (前面也有一个 G)。 apoE基因 PCR-RFLP原理为用特异性引物扩增，包括 2位点 DNA序列，扩增产物 (246 bp)进一步用 HhaⅠ酶切，由于ε 2 、ε 3 、ε 4 的 2位点 GCGC(Cys)-GTGC(Arg)差异，产生不同的限制性片断长度多态性ε 2 、ε 3 、ε 4 ，并分别产生如图 3所示片段，由此产生 6种不同的电泳图谱。
应用聚丙烯酰胺分离经 HhaⅠ酶消化的片段，虽然分辨效果好，但是试剂毒性大，制备凝胶过程复杂。
分离 DNA片断时，由于其分子量小 (40～ 100 bp)，应用普通琼脂糖分离效果不佳。而应用 Sigma公司的琼脂糖，配置为 4%的浓度，酶切后的 PCR产物片段分辨甚佳。
我们所检测的 300名健康人，其中以ε 3 /ε 3 百分比最高，占 74%，其次是ε 2 /ε 3 ，占 16%。
操作时注意事项： (1)为获得满意的酶切效果，扩增时 DNA的浓度和加入 HhaⅠ酶的浓度有关，一般以 5 U为佳。 (2)试剂应置 -20℃冷藏，部分试剂如裂解液，低温下有沉淀，用时要充分摇匀。 (3)所有试剂在启盖前均需离心，以免手套或移液器污染。 (4)DNA模板在 PCR反应操作中应最后加入，其结果在拍照后须仔细比较各条带强弱及有关否。 (5)样品处理须避免交叉污染，反应过程所用的塑料制品均应灭菌； PCR产物电泳如有非特异性产物不能作酶切。 (6)标本处理时，以酒精沉淀 DNA，由于量甚少，可能黏附管壁。 (7)用 TE溶解时应谨慎操作，以免 DNA丢失。
本方法的建立对研究人的 apoE基因以及 apoE基因型在脂肪代谢中的作用与疾病的关系，提供了一个有效的手段，为当前最简易的 apoE基因分型方法之一。
参考文献
1Lusis AJ, Heinzmann C, Mohandas T, et al. Regional mapping of human chromosome 19 organization of genes for plasma lipid transport (apo C1,C2,-E and LDL-R) and the genes C3, PEPD and GP1. Proc Natl Acad Sci, 1986,83： 3929-3933.
2Utermann G, Kindermann L, Steinmetz A, et al. Apolipoprotein E phenotypes and hyperlipidemia. Hum Genet, 1984,65： 232-236.
3Hixson JE, Vernier DT. Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaⅠ . J Lip Res, 1990,31： 545-548.
4Kontula K, Aalto-setala K, Syvanen AC, et al. Apolipoprotein E polymorphism determined by restriction enzyme analysis of DNA amplified by polymerase chain reaction: Convnient altermative to phenotyping by isoelectric focusing. Clin Chem, 1990,36： 2087-2092.
5Houlston R S, Wenham PR, Humphries SE. Detection of apolipoprotein E polymorphisms using PCR/ASO probes and southern transfer: application for routine use. Clin Chim Acta, 1990,189： 153-157.
6Rousseaux S, Guerber F, Hadjan AJ, et al. Le polymorphsime de lapolipoproteine E: interet, determination simple par PCR. Rev francaise des Lab, 1992,244,89-97.
(收稿： 1997-10-19 修回： 1998-03-23)
, http://www.100md.com