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关键词：
特殊染色方法检测卡氏肺孢子虫(PC)，需技术人员有较高的识别虫体能力，虫体量较少时易漏诊。我们应用聚合酶链反应(PCR)检测PC虫体并探讨其可行性，评估其敏感性和特异性。
材料与方法
雌性清洁级SD大鼠60只，体重180～220 g，采用皮下注射可的松方法诱导PC肺炎。3～4个月后处死并解剖，支气管肺泡灌洗(BAL)法参照文献[1]。BAL液(BALF)行细菌及真菌培养，离心沉渣涂片行吉姆萨染色查找PC虫体。4%甲醛溶液固定肺脏，肉眼观察无明显病变则两肺各取3块肺组织，若肉眼见明显异常改变则在病变处取材，同时另一侧取3块肺组织行病理学检查。
大鼠BALF共28份，其中单纯PC虫体阳性12份，PC阴性且无其它病原体8份，细菌培养阳性8份(包括大肠杆菌2份、肺炎杆菌2份、硝酸盐阴性杆菌2份、多形模仿菌1份、黄杆菌1份)。临床分离菌株制成107 cfu/ml菌液共10份(金黄色葡萄球菌2份、绿脓杆菌2份、白色念珠菌2份、熏烟色曲霉菌2份)。参照Wakefield方法设计[2] 的引物1：GATGGCTGTTTCCAAGCCCA，引物2：GTGTACGTTGCAAAGTACTG(中国科学院上海生物化学研究所癌基因研究室合成)。扩增346 bp产物(图1)。DNA扩增试剂盒，包括Taq DNA酶均由复旦大学复华生物技术中心生产。盐酸(Tris)饱和酚(pH 8.0)由上海医科大学药学院无机化学教研室合成。DNA分子量大小参照物(marker)由上海医科大学中山医院中心实验室酶切自制。
标本处理：取标本200 μl加入去离子水(d2 H2 O)200 μl，加入20 μl蛋白酶K，
M (marker)DNA标记；1 标准PC虫体，阳性对照；2 PC阳性BALF；3 PC阴性BALF
图1 聚合酶链方法扩增
346 bp50℃ 16小时，温浴消化。将pH 8.0 Tris饱和酚400 μl 加入标本中充分摇匀，离心2分钟(7 000 r/min)，吸出上清并加入氯仿与异戊醇混合液(24∶1)400 μl，充分混匀，离心2分钟后吸出上清液，向上清液中加入2～2.5倍体积无水乙醇及1/10体积的pH 4.6醋酸钠(3 mmol/L)，并置于-30℃冰箱中20分钟，冷冻离心15分钟(13 000 r/min)，弃酒精并干燥样本管，加入20 μl d2 H2 O置于-20℃溶解收集标本模板DNA备用。Taq DNA 0.5 μl、10×Buffer 2 μl、2 mmol dNTP 2μl、25 pmol/L引物1、引物2各0.5 μl、标本模板3 μl、d2 H2 O 11.5 μl，组成20 μl反应体系。变性94℃30秒，退火50℃30秒，延伸72℃45秒，共30个循环。每次行PCR反应以标准PC虫体(美国康州大学医学院内科Edward教授赠)作阳性对照，常规生理盐水(NS)作阴性对照。扩增产物加入1.5%琼脂糖二乙胺凝胶中电泳，EB染色紫外线灯下观察与maker对照，确定扩增产物片段大小。
结果
PCR检测PC敏感性：(1)将含1.6×1011 个/L PC的BALF，分别按10浓度倍比稀释至终浓度1.6×1010 个/L、1.6×109 个/L、1.6×108 个/L、1.6×107 个/L、1.6×106 个/L、1.6×105 个/L、1.6×104 个/L，各取上述PC BALF液200 μl作为制备PC虫体DNA模板的样本，分别含PC3.2×109 个/L、3.2×108 个/L、3.2×107 个/L、3.2×106 个/L、3.2×105 个/L、3.2×104 个/L、3.2×103 个/L，结果显示PCR能检测到的PC最低浓度为3.2×104 个/L。(2)BALF涂片阳性12份PCR全为阳性，BALF涂片阴性、病理切片阳性2例PCR全为阳性，BALF涂片和病理切片均阴性，1例PCR阳性。重复检查肺病理切片发现右上肺肺泡腔内可见散在少许PC虫体。
PCR检测特异性：普通细菌肺炎BALF、临床标本分离的10株菌株，检测结果均为阴性。
讨论
我们的研究显示应用PCR方法检测PC具有很高的敏感性。我们将标准PC虫体及NS作为每次PCR反应的阳性、阴性对照，同时与常见细菌、真菌等比较，结果15份BALF标本所扩增346 bp产物，与标准PC虫株阳性对照结果完全相符，且与常见细菌、真菌均无非特异性交叉反应，表明其检测PC虫体具有高特异性。我们认为PC这种特殊的原虫，其DNA的核苷酸序列与肺部感染常见病原体无同源性，另外每次PCR反应过程严格执行防污染规程，设立阳性、阴性对照也是保证PCR检测PC高特异性必不可少的，结果从一个侧面说明PCR过渡到临床PC肺炎诊断是可行的。
参考文献：
1 瞿介明，何礼贤，李锡莹.支气管肺泡灌洗液中的卡氏肺孢子虫纯化技术.上海医科大学学报，1998，25：125.
2 Wakefield AE, Miller RF, Guiver LA, et al. Oropharyngeal samples for detection of pneumocystis carinii by DNA amplification. Quarterly J Med, 1993, 86:401-406.
收稿：1998-12-18 修回：1999-01-22
, http://www.100md.com