关键词：结肠直肠肿瘤；淋巴结；聚合酶链反应；肿瘤转移
【摘要】目的探讨提高结直肠癌区域淋巴结阳性检出率的方法及其意义。方法分别采用淋巴结分离液查找区域淋巴结和应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增角蛋白19(K19)，对25例结直肠癌患者242个区域淋巴结进行重新分析和检测。结果13例结直肠癌患者区域淋巴结经淋巴结分离液处理，查找淋巴结数量由124个增至147个；12例结直肠癌患者84个病理检查未发现转移的淋巴结中经RT-PCR检测有8个存在微转移。结论利用淋巴结分离液可检出更多的结直肠癌区域淋巴结；RT-PCR方法是发现淋巴结微转移灶的一种敏感方法。两者结合可准确对结直肠癌患者进行分期，判断预后，指导治疗。
Clinical study on regionallymph nodes of colorectal carcinoma
LIU Lianjie, MENG Ronggui, XU Qizuo, et al.
Department of Colorectal Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University,Shanghai 200433, China
【 Abstract】 Objective To explore the metastases in regionallymph nodes of colorectal carcinoma and its clinical significance. Methods Fat clearancemethod was used to detect regional lymph nodes in colorectal cancer and reversetranscriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect the expression of keratin19(K19) mRNA in regional lymph nodes of 25 cases with colorectal carcinoma. 242 lymphnodes in all were reanalyzed. Results The detecting numbers of lymph nodes increased from124 by routine method to 147 by fat clearance method in 13 cases of colorectal cancer.Among 84 negative lymph nodes in 12 cases of colorectal carcinoma, 8 lymph nodes werepositive for expression of K19 mRNA by RT-PCR which meant micrometastases. ConclusionsMore regional lymph nodes can be found by fat clearance method and the K19 mRNA RT-PCRmethod can detect micrometastases of regional lymph nodes sensitively. These two methodsare useful to provide accurate stage for colorectal carcinoma patients and information forprognosis and adjuvant therapy.
【 Key words】 Colorectal neoplasm; Lymph node; Polymerasechain reaction; Neoplasm metastasis
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，根治术后复发、转移率高达50%左右。转移、微转移是结直肠癌根治术后不能根治的主要原因[1,2] 。准确了解有无转移、微转移对临床诊断、治疗、预后判断具有重大意义。本文采用淋巴结分离液查找淋巴结和应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测了25例结直肠癌区域淋巴结，发现前者可协助寻找更多的淋巴结，后者是诊断淋巴结微转移的一种敏感方法。
材料与方法
一、一般资料
选择结直肠癌根治术切除的肿瘤标本25例。术前均经纤维结肠镜及病理活检证实为腺癌。男14例，女11例。年龄26～78岁。高分化腺癌9例，中分化腺癌13例，黏液腺癌3例。13例为已经过常规病理检查后的标本，通过淋巴结分离液[3] 进行处理并再次检取淋巴结，检出的淋巴结进行病理检查。12例肿瘤标本为新鲜标本，肿瘤切除后立即取区域淋巴结及部分肿瘤组织，PBS液清洗后淋巴结取一半液氮储存，另一半编号送常规病理。
二、方法
1.cDNA第一链合成：采用组织总RNA抽提试剂盒(华顺生物试剂公司)，淋巴结清洗后取50g组织研磨后加裂解液裂解，氯仿抽提，吸附柱吸附洗脱。总RNA溶解于50μl液体中，42℃孵育60min反转录合成cDNA。
2.PCR扩增：选择扩增角蛋白19(K19)引物及内参照基因引物[1] 。引物由中国科学院上海生物化学细胞所合成。
K19：K1AGGTFFATTCCGCTCCGGGCA
K2ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA
内参引物：R1CACTGTGTTGGCGATCAGGT
R2TCATCACCATTGGCAATGCT
反应体系为30μl，包括cDNA5μl，K1、K2、R1、R2各1μl，dNPT浓度为500μmol/L，DNA聚合酶1U。按95℃45s、55℃40s、72℃55s扩增32循环，最后72℃延伸3min。2%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察结果。K19mRNA扩增片断为460bp，内参引物为154bp。
结果
一、淋巴结检出情况
13例结直肠癌患者区域淋巴结，原病理查找淋巴结数量为124个，存在转移31个。如按此结果，8例为DukesB期，5例为DukesC期。经淋巴结分离液处理再次检出23个淋巴结，其中7个存在转移。2例原为DukesB期的标本中分别查找到1个、2个转移淋巴结，其实应属DukesC期。
二、K19mRNA表达情况
在12例肠癌组织表达均为阳性。4例良性结直肠疾病共取21个淋巴结，表达均为阴性，内参基因表达阳性，排除RNA降解。12例结直肠癌患者共取材95个淋巴结。其中11个淋巴结组织学检查存在转移，K19mRNA表达均为阳性。84个淋巴结组织学检查为阴性，RT-PCR检测其中8个淋巴结K19mRNA表达阳性，表明存在癌的微转移灶。组织学检查漏诊的转移淋巴结为9.5%(8/84)，被K19mRNART-PCR检测所检出。
三、结直肠癌Dukes分期的升级
25例结直肠癌患者如按常规组织学检查进行Dukes分期，DukesB期患者为16例，DukesC期患者9例。经淋巴结分离液处理和RT-PCR检测微转移，4例Dukes分期由B期升为C期。DukesC期患者中有7例经处理和检测发现更多区域淋巴结转移。
讨论
淋巴结的转移与否对病情判断、估计预后和辅助治疗有重要价值。临床上常采用各种特殊方法去除标本脂肪组织，增加淋巴结检出数量[3] ，这对DukesB期患者尤其有意义。国际胃肠组织认为每位患者至少应检查12个区域淋巴结。Scott等[4] 对377例结直肠癌患者区域淋巴结进行研究，表明淋巴结数量与患者预后明显相关，DukesB期患者淋巴结少于6个则预后明显变差。漏检可能是常见原因之一，但有研究表明可能与肿瘤恶性程度高和机体免疫反应差有关。
对微转移的研究更是近期研究热点。连续切片是最早用于检测淋巴结微转移的一种简便方法，免疫组织化学、免疫荧光和放射免疫检测具有重要应用价值。RT-PCR是目前较为敏感的检测方法，可准确检测到1ml血液或1g组织中的1个肿瘤细胞[1] 。CK19是常见的角蛋白之一，它非常局限在胃肠上皮细胞，几乎所有结直肠癌都明显表达且在侵袭、转移、扩散到其它组织器官时始终保持稳定[2,5] 。正常淋巴组织中不表达。结直肠癌的区域淋巴结表达阳性表示存在转移。通过检测CK8、CK19、CK20mRNA的表达可监测结直肠癌淋巴结、血循环、骨髓的微转移[1,2] 。
本研究表明，按常规病理进行Dukes分期欠准确。利用淋巴结分离液可检出更多的结直肠癌区域淋巴结；RT-PCR方法是发现微转移灶的一种敏感方法。两者结合明显提高了区域淋巴结的检出数量和微转移诊断率，可更准确地对结直肠癌患者进行分期，使部分肠癌患者分期升级，有助于术后的辅助治疗和预后判断。
参 考 文 献
1.Raj GV, Moreno JG, Gomella LG. Utilization of polymerase chainreaction technology in the detection of solid tumors. Cancer, 1998,82:1419-1442.
2.Dorudi S, Kinrade E, Marshall NC, et al. Genetic detection of lymph node micrometastasesin patients with colorectal cancer. Br J Surg, 1998, 85:98-100.
3.Scott KW, Grace RH. Detection of lymph node metastases in colorectal carcinoma beforeand after fat clearance. Br J Surg, 1989, 76:1165-1167.
4.Caplin S, Cerottini JP, Bosman FT, et al. For patients with Dukes′ B(TNM stage Ⅱ )colorectal carcinoma, examination of six or fewer lymph nodes is related to poorprognosis. Cancer， 1998， 83:666-672.
5.Noguchi S, Aihara T, Motomura K, et al. Detection of breast cancer micrometastases inaxillary lymph nodes by means of reverse transcriptase-poly-merase chain reaction:comparison between MUC1 mRNA and keratin 19 mRNA amplification. Am J Pathol, 1996,148:649-656.
(收稿日期：2000-01-26 ), 百拇医药