深圳市食品中单核细胞增生性李斯特菌的污染状况调查
摘要:目的 了解深圳市食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的污染状况，并评价不同方法的检测效果。 方法 分别用传统分离培养方法和荧光PCR方法进行分离培养及检出鉴定。 结果 从178份样品中检出3份(株)单核细胞增生性李斯特氏菌，检出率为1.68%。 结论 深圳市食品中存在单核细胞增生性李斯特氏菌污染的危险，需加强食品中单核细胞增生性李斯特氏菌监测。用传统方法结合荧光PCR方法能提高单核细胞增生性李斯特氏菌的检出率和准确性。
关键词:单核细胞增生性李斯特氏菌;污染;调查
Investigation of the contamination status of food with Listeria monocytogenes in Shenzhen City.
WUPing-fang，HE Lian-hua，WANG Bing，et al.(Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China)
Abstract:Objective To investigate the infectious status of Listeria monocytogenes in food in Shenzhen. Methods The tra-ditional method and the real-time PCR were used for isolation and determination of the baoteria. Results 178samples were de-tected by the two methods and Listeria monocytogeneswas isolated.The positive rate is1.68%. Conclusion There is contami-nation of food with L.monocytgeneswas existed in food in Shenzhen City.It should be supervised in Shenzhen.Furthermore，If tradi-tional method and read-time PCR were combined together the detectable rate and accuracy can be enhanced.
Key words:Listeria monocytogenes;Containmination;Investigation
国际公认的李斯特氏菌属共有7种菌种，其中只有单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytgenes下简称单增李斯特氏菌)是一种重要的人畜共患病病原菌，它能引起败血症、脑膜炎以及孕妇流产等，病死率高达30%，20世纪90年代WTO将其列为食源性四大致病菌之一。自1926年首次报道李斯特氏病以来，美国和西欧等许多发达国家因食物引起的单增李斯特氏菌食物中毒爆发日益增多，国内也有单增李斯特病的报道。为了了解深圳市食品中单增李斯特氏菌的污染情况，预防单增李斯特氏菌的食物中毒的发生和流行，于2004年3～8月分别在深圳市采集生(冻)肉类、冻禽类、水产品、奶制品及冰淇淋等样品178份进行检测，兹报告如下。
1 材料与方法
1.1 样品来源及数量 深圳东门肉菜市场、深圳市东门百佳超市、深圳市光明农场晨光牛奶厂、深圳市食品进出口检疫局蛇口分局、市各商场及食品厂家送中心检验样品共178份，其中生肉类62份、冻禽类45份、冻肉15份、生奶40份、其它16份(海产品5份，冰淇淋4份，冻饺汤圆类7份)。采样后每份单独分装，8h内送达实验室增菌培养或-20℃保存待测。
1.2 培养基及试剂 李斯特增菌肉汤基础、改良李斯特选择性平板(MMA)、SIM琼脂、三糖铁琼脂均由北京陆桥技术有限公司提供;全血平板由深圳市国赛提供;Fraser肉汤、PALCAM琼脂由德国MERCK公司提供;API李斯特氏菌鉴定纸条由法国梅里埃公司提供;PTB平板由本实验室配制。探针李斯特试剂盒和Taq E由大连宝公司提供。
1.3 仪器及设备 30℃恒温培养箱;37℃恒温培养箱;无菌操作台;电子称(610g-0.01g);荧光PCR仪(美国BIO-RAD出品)。
1.4 方法
1.4.1 国标法 取10g样品，剪碎置于50ml LB130℃一次增菌24h后取0.5ml增菌液转于LB230℃二次24h后划MMA平板，30℃培养48h后挑5～6个兰色可疑菌落穿种于三糖铁琼脂以及SIM琼脂，动力实验成伞状、三糖铁上下层产酸不产硫化氢得继续做生化实验。
l.4.2 PTB法 一次增菌、二次增菌同国标法，二次增菌后划PTB琼脂，室温培养48h后挑5～6个黑色湿润丰满(1.2～1.5mm)的可疑菌落，后同国标法。
1.4.3 Fraser肉汤培养法 一次增菌同国标，增菌后取1ml增菌液转于Fraser肉汤(5ml/管)，30℃培养24h，增菌液变黑者划按PALCAM平板，(不变黑者再观察24h，如仍不变色则做阴性处理)37℃培养48h，挑5～6个细小灰白，中间黑色点(时间长中间有凹陷)的可疑菌落，后同国标法。
1.4.4 荧光PCR法 引物、探针自行设计，荧光素由上海生工合成并标记，将一次增菌液1ml离心去上清液，沉淀加100μl无菌蒸馏水悬浮，或从传统方法培养基平板上挑可疑菌落于100μl蒸馏水中悬浮，100℃煮沸5min，取上清液5μl做模板，在荧光PCR仪上扩增，52℃退火时检测荧光。
2 结果
用传统方法结合荧光PCR法对178份食品样品进行单增李斯特氏菌检测，结果见表1。
表1 不同方法检测各类食品中单增李斯特氏菌的结果(略)
3 讨论
调查结果表明，李斯特氏菌的分布极为广泛，包括肉类及肉制品、禽类、水产品等都可能成为污染源。据文献报导，菌种的分布与地域有关，国外食品中单增李斯特氏菌的污染率达5%～30%，单增李斯特氏菌的病死率高达30%～70%，另据美国CDC的Claire等人估计美国每年大约有1600例单增李斯特氏菌病病人，其中400人死亡 [1] 。我国云南省某县1997年曾发生一起李斯特氏菌病暴发流行的报导 [2] 。目前，我国也加强了食品中单增李斯特氏菌的污染调查，国内报道的单增李斯特氏菌的检出率在0.72%～6.4%之间，如福建检出率为7.45%;江苏、北京检出率为2.96% [3] 。最近广东省的检出率为1.5% [4] 。这表明我国单增李斯特氏菌的污染比较轻微，这可能是我国现在还未出现单增李斯特氏菌病大面积爆发的原因。但是仍然不能忽视此菌的检测。
本研究结果表明，178份食品样品中，冻品，特别是冻肉的李斯特氏菌分离率最高，16份冻肉，用Fraser法检出15份李斯特氏菌，阳性率为93.75%，其中分出1株单增李斯特氏菌;其次是冻禽肉，45份冻禽肉 中，检出40份李斯特氏菌，阳性率为88.88%，从中亦分出1株单增李斯特氏菌;均为进口食品。应引起关注。其它食品16份，检出李斯特氏菌6份，检出率为37.50%，从中亦分出1株单增李斯特氏菌。178份食品样品中检出3株单增李斯特氏菌，检出率为1.68%，本文研究结果表明深圳市食品中单增李斯特氏菌的污染程度低于国外，检出率也低于国内报导的某些省市。由于检出的2株单增李斯特氏菌均为进口冻肉食品，加之李斯特氏菌具有耐冷，耐高渗溶液的性质，我们可以重点监测进口食品以及冻肉类食物，预防单增李斯特氏菌食物中毒以及单增李斯特氏菌爆发流行。
另外，在检出的3株单增李斯特氏菌中有1株是从本地样品中检出，为速冻饺子类，这类带生肉馅的食品经加工冷冻后成批发给超市商场和酒店，易造成污染和传播，应引起重视。在奶产品中均未检出李斯特氏菌，这与企业严格消毒效果好有关。
在单增李斯特氏菌的日常检验中，传统分离方法不仅耗费时间长，检验步骤烦琐，而且特异性不强，这就增加了检验的难度。荧光定量PCR既有传统PCR的特异性好，灵敏度高，时间短的优点 [5] ，又可以结合荧光探针，在荧光PCR仪上显示结果，方便快捷，可以在1～2h内得出初筛结果，为实验室检验带来极大的方便。实验中我们对单增李斯特氏菌溶血素的特异核酸片段进行扩增，在对3份样品API检测为单增李斯特氏菌的菌株做荧光PCR与API试验结果一致，证明荧光PCR检验结果比较可信，可以作为样品初筛的手段。但结果显示，单一种方法都无法非常准确地检出单增李斯特氏菌，要结合以上各方法的优点，先对增菌液做荧光PCR试验进行初筛，荧光PCR结果阳性者再作分离培养、三糖铁及动力试验，同时划血平板观察溶血现象，阳性者可直接API纸条进行测试。这样可以节省时间，争取尽快得出正确的检验结果。
参考文献:
[1]王豫林，安永群.食品中李斯特菌污染的调查报告[J].中国食品卫生杂志.1994，6(2):39～41.
[2]肖义泽，任丽娟，王金玉，等.云南省首次动物性李斯特菌病暴发的流行病学调查[J].中华流行病学杂志.2000，21(3):236.
[3]吴蜀豫，李迎惠，冉陆.中国2001年11省(市)食品中李斯特菌污染状况的主动监测[J].中华流行病学杂志.2003，24(8):657～659.
[4]宋曼丹，倪汉忠，杨冰，等.广东省食品中单核增生性李斯特氏菌污染状况调查[J].中国卫生检验杂志.2004，14(1):81～86.
[5]张蓓，沈立松.实时荧光定量PCR的研究进展及其应用[J].国外医学，生物化学与检验分册.2003，24(6):327～328.
作者单位:深圳市疾病预防控制中心，广东深圳 518020., http://www.100md.com(吴平芳 贺连华 王冰 石晓路 扈庆华)
关键词:单核细胞增生性李斯特氏菌;污染;调查
Investigation of the contamination status of food with Listeria monocytogenes in Shenzhen City.
WUPing-fang，HE Lian-hua，WANG Bing，et al.(Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China)
Abstract:Objective To investigate the infectious status of Listeria monocytogenes in food in Shenzhen. Methods The tra-ditional method and the real-time PCR were used for isolation and determination of the baoteria. Results 178samples were de-tected by the two methods and Listeria monocytogeneswas isolated.The positive rate is1.68%. Conclusion There is contami-nation of food with L.monocytgeneswas existed in food in Shenzhen City.It should be supervised in Shenzhen.Furthermore，If tradi-tional method and read-time PCR were combined together the detectable rate and accuracy can be enhanced.
Key words:Listeria monocytogenes;Containmination;Investigation
国际公认的李斯特氏菌属共有7种菌种，其中只有单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytgenes下简称单增李斯特氏菌)是一种重要的人畜共患病病原菌，它能引起败血症、脑膜炎以及孕妇流产等，病死率高达30%，20世纪90年代WTO将其列为食源性四大致病菌之一。自1926年首次报道李斯特氏病以来，美国和西欧等许多发达国家因食物引起的单增李斯特氏菌食物中毒爆发日益增多，国内也有单增李斯特病的报道。为了了解深圳市食品中单增李斯特氏菌的污染情况，预防单增李斯特氏菌的食物中毒的发生和流行，于2004年3～8月分别在深圳市采集生(冻)肉类、冻禽类、水产品、奶制品及冰淇淋等样品178份进行检测，兹报告如下。
1 材料与方法
1.1 样品来源及数量 深圳东门肉菜市场、深圳市东门百佳超市、深圳市光明农场晨光牛奶厂、深圳市食品进出口检疫局蛇口分局、市各商场及食品厂家送中心检验样品共178份，其中生肉类62份、冻禽类45份、冻肉15份、生奶40份、其它16份(海产品5份，冰淇淋4份，冻饺汤圆类7份)。采样后每份单独分装，8h内送达实验室增菌培养或-20℃保存待测。
1.2 培养基及试剂 李斯特增菌肉汤基础、改良李斯特选择性平板(MMA)、SIM琼脂、三糖铁琼脂均由北京陆桥技术有限公司提供;全血平板由深圳市国赛提供;Fraser肉汤、PALCAM琼脂由德国MERCK公司提供;API李斯特氏菌鉴定纸条由法国梅里埃公司提供;PTB平板由本实验室配制。探针李斯特试剂盒和Taq E由大连宝公司提供。
1.3 仪器及设备 30℃恒温培养箱;37℃恒温培养箱;无菌操作台;电子称(610g-0.01g);荧光PCR仪(美国BIO-RAD出品)。
1.4 方法
1.4.1 国标法 取10g样品，剪碎置于50ml LB130℃一次增菌24h后取0.5ml增菌液转于LB230℃二次24h后划MMA平板，30℃培养48h后挑5～6个兰色可疑菌落穿种于三糖铁琼脂以及SIM琼脂，动力实验成伞状、三糖铁上下层产酸不产硫化氢得继续做生化实验。
l.4.2 PTB法 一次增菌、二次增菌同国标法，二次增菌后划PTB琼脂，室温培养48h后挑5～6个黑色湿润丰满(1.2～1.5mm)的可疑菌落，后同国标法。
1.4.3 Fraser肉汤培养法 一次增菌同国标，增菌后取1ml增菌液转于Fraser肉汤(5ml/管)，30℃培养24h，增菌液变黑者划按PALCAM平板，(不变黑者再观察24h，如仍不变色则做阴性处理)37℃培养48h，挑5～6个细小灰白，中间黑色点(时间长中间有凹陷)的可疑菌落，后同国标法。
1.4.4 荧光PCR法 引物、探针自行设计，荧光素由上海生工合成并标记，将一次增菌液1ml离心去上清液，沉淀加100μl无菌蒸馏水悬浮，或从传统方法培养基平板上挑可疑菌落于100μl蒸馏水中悬浮，100℃煮沸5min，取上清液5μl做模板，在荧光PCR仪上扩增，52℃退火时检测荧光。
2 结果
用传统方法结合荧光PCR法对178份食品样品进行单增李斯特氏菌检测，结果见表1。
表1 不同方法检测各类食品中单增李斯特氏菌的结果(略)
3 讨论
调查结果表明，李斯特氏菌的分布极为广泛，包括肉类及肉制品、禽类、水产品等都可能成为污染源。据文献报导，菌种的分布与地域有关，国外食品中单增李斯特氏菌的污染率达5%～30%，单增李斯特氏菌的病死率高达30%～70%，另据美国CDC的Claire等人估计美国每年大约有1600例单增李斯特氏菌病病人，其中400人死亡 [1] 。我国云南省某县1997年曾发生一起李斯特氏菌病暴发流行的报导 [2] 。目前，我国也加强了食品中单增李斯特氏菌的污染调查，国内报道的单增李斯特氏菌的检出率在0.72%～6.4%之间，如福建检出率为7.45%;江苏、北京检出率为2.96% [3] 。最近广东省的检出率为1.5% [4] 。这表明我国单增李斯特氏菌的污染比较轻微，这可能是我国现在还未出现单增李斯特氏菌病大面积爆发的原因。但是仍然不能忽视此菌的检测。
本研究结果表明，178份食品样品中，冻品，特别是冻肉的李斯特氏菌分离率最高，16份冻肉，用Fraser法检出15份李斯特氏菌，阳性率为93.75%，其中分出1株单增李斯特氏菌;其次是冻禽肉，45份冻禽肉 中，检出40份李斯特氏菌，阳性率为88.88%，从中亦分出1株单增李斯特氏菌;均为进口食品。应引起关注。其它食品16份，检出李斯特氏菌6份，检出率为37.50%，从中亦分出1株单增李斯特氏菌。178份食品样品中检出3株单增李斯特氏菌，检出率为1.68%，本文研究结果表明深圳市食品中单增李斯特氏菌的污染程度低于国外，检出率也低于国内报导的某些省市。由于检出的2株单增李斯特氏菌均为进口冻肉食品，加之李斯特氏菌具有耐冷，耐高渗溶液的性质，我们可以重点监测进口食品以及冻肉类食物，预防单增李斯特氏菌食物中毒以及单增李斯特氏菌爆发流行。
另外，在检出的3株单增李斯特氏菌中有1株是从本地样品中检出，为速冻饺子类，这类带生肉馅的食品经加工冷冻后成批发给超市商场和酒店，易造成污染和传播，应引起重视。在奶产品中均未检出李斯特氏菌，这与企业严格消毒效果好有关。
在单增李斯特氏菌的日常检验中，传统分离方法不仅耗费时间长，检验步骤烦琐，而且特异性不强，这就增加了检验的难度。荧光定量PCR既有传统PCR的特异性好，灵敏度高，时间短的优点 [5] ，又可以结合荧光探针，在荧光PCR仪上显示结果，方便快捷，可以在1～2h内得出初筛结果，为实验室检验带来极大的方便。实验中我们对单增李斯特氏菌溶血素的特异核酸片段进行扩增，在对3份样品API检测为单增李斯特氏菌的菌株做荧光PCR与API试验结果一致，证明荧光PCR检验结果比较可信，可以作为样品初筛的手段。但结果显示，单一种方法都无法非常准确地检出单增李斯特氏菌，要结合以上各方法的优点，先对增菌液做荧光PCR试验进行初筛，荧光PCR结果阳性者再作分离培养、三糖铁及动力试验，同时划血平板观察溶血现象，阳性者可直接API纸条进行测试。这样可以节省时间，争取尽快得出正确的检验结果。
参考文献:
[1]王豫林，安永群.食品中李斯特菌污染的调查报告[J].中国食品卫生杂志.1994，6(2):39～41.
[2]肖义泽，任丽娟，王金玉，等.云南省首次动物性李斯特菌病暴发的流行病学调查[J].中华流行病学杂志.2000，21(3):236.
[3]吴蜀豫，李迎惠，冉陆.中国2001年11省(市)食品中李斯特菌污染状况的主动监测[J].中华流行病学杂志.2003，24(8):657～659.
[4]宋曼丹，倪汉忠，杨冰，等.广东省食品中单核增生性李斯特氏菌污染状况调查[J].中国卫生检验杂志.2004，14(1):81～86.
[5]张蓓，沈立松.实时荧光定量PCR的研究进展及其应用[J].国外医学，生物化学与检验分册.2003，24(6):327～328.
作者单位:深圳市疾病预防控制中心，广东深圳 518020., http://www.100md.com(吴平芳 贺连华 王冰 石晓路 扈庆华)