拉米夫定治疗活动性肝硬化3年的疗效观察
摘要:目的 观察乙型肝炎后活动性肝硬化患者拉米夫定3年长程治疗的疗效及探讨发生YMDD变异后出现肝脏损害的治疗对策。 方法 27例活动性肝硬化患者，口服拉米夫定100mg/d，连服36个月，观察治疗前后的临床症状、体征、生化指标、病毒学改变以及在治疗过程中发生YMDD变异出现肝功能损害等情况及处理。 结果 治疗36个月有23例(85.2%)患者肝功能好转或恢复正常，病情稳定，生活质量改善，Child-pugh评分下降≤A级;27例服用拉米夫定1年、2年和3年HBV DNA阴转率分别为88.9%、77.8%和66.7%;有6例发生YMDD变异，其中3例发生YMDD变异后出现肝功能损害加重，予拉米夫定联合膦甲酸钠治疗，肝功能均恢复正常，且2例HBV DNA转阴，病情缓解稳定。 结论 对有活跃病毒复制的乙型肝炎后活动性肝硬化病人，早期长程拉米夫定抗病毒治疗可改善肝功能，阻止或延缓肝硬化病情进展，提高生活质量，对在治疗过程中，发生YMDD变异出现肝功能损害加重，可选用膦甲酸钠联合拉米夫定抗病毒治疗。
关键词:慢性乙型肝炎;肝硬化;治疗学;拉米夫定;YMDD变异
Observation on the therapeutic effect of lamivudine on active cirrhosis of chronic hepatitis B patients three years after treatment.
QIU Ping，JIA Jie，XIAO Fu-rong，et al.
(Hainan Provincial People's Hospital，Haikou570311，Hainan，P.R.China)
Abstract:Objective To study the therapy effect of long term for3years with lamivudine treatment on active cirrhosis following chronic hepatitis B，and explore the management for liver damage after the YMDD mutations of hepatitis B virus during lamivudine treatment for active cirrhosis. Methods 27patients received lamivudine100mg orally everyday for36months.The changes were observed，including clinical symptoms and signs，aminotransferase，virology indexes，and the abnormalities after the YMDD muta-tions，then further to find out plans for the latter. Results ①After lamivudine treatment，there were23patients(85.2%)whose situation stabilized，life quality improved，Child-pugh score declined，and liver function turned better;②27patients were treated with lamivudine，88.9%(24/27)HBV DNA for one year，77.8%(21/27)HBV DNA for two years and66.7%(18/27)HBV DNA for three years were negative respectively.③YMDD mutation occurred in6out of the27patients.④Three patients had severe liver injury after the YMDD mutations，were treated with Lamivudine and foscarnet，whose liver function improved and two patients HBV DNA were converted negative. Conclusion Long term treatment with lamivudine for active cirrhosis following chronic hepatitis B could improve liver function and life quality，and prevent exacerbation.It is advisable to use foscarnet and Lamivndine for hepatitis B relapsing after the YMDD mutations during lamivndine treetment.
Key words:Chronic hepatitis B;Liver cirrhosis;Therapeutics;Lamivudine;YMDD mutation
伴有病毒复制活跃的肝炎后肝硬化，病情易迅速发展，可发生肝功能衰竭死亡，因此，治疗的关键是抗病毒治疗。拉米夫定是目前公认服用方便、不良反应少的较有效的抗乙型肝炎病毒(HBV)新一代核苷类似物。本研究目的是评价拉米夫定治疗活动性肝硬化病人3年的临床疗效，现报道如下。
1 资料及方法
1.1 病例选择 27例均为1999年10月～2004年10月门诊和住院患者，根据临床表现，实验室检查，影像学检查诊断为活动性肝硬化，诊断符合2000年9月西安会议病毒性肝硬化诊断标准;全部患者均为Child-pugh B级，HBsAg阳性，HBeAg阳性或HBeAg阴性，但HBV DNA定量检测≥10 5 拷贝/ml;男24例，女3例，年龄26～60岁。
1.2 治疗方法 27例患者均接受相同的综合治疗，口服拉米夫定100mg/d，连续36个月。
1.3 观察项目及方法 用药前后记录患者症状、体征，并检测肝功能、血清HBVM及HBV-DNA，每三个月一次。乙肝病毒抗原抗体五项采用ELISA方法检测，试剂由上海静华试剂公司提供。HBV DNA采用定量荧光PCR方法检测，试剂由中山医科大学安达公司提供。
1.4 mPCR-RFLP法测定YMDD变异 采用孙剑等 [1] 设计的针对HBV DNA聚合酶区的引物对:P 24 (5′-TTC CCC CAC TGT CTG TCT GGC TTT CAG TCA T-3′，nt712～738)与P 29 (5′-ATA CCC AAA CAC AAA AGA AAA-3′，nt827～807)。其中P 24 为错配引物，其3′端第3位碱基由原来的T改为C，以期在野生株PCR产物中引进Nde I酶切位点CA*TATG(美国Promega公司产品);而YIDD和YVDD突变株nt739～741位的核苷酸序列分别是ATT和GTG，故不能被Nde I酶切。参照文献 [2] 的条件进行PCR扩增。将7μl PCR扩增产物经Nde I酶37℃酶切3h，由于野生株被Nde I酶切成89bp和26bp两个片段，可通过8%的聚丙烯酰胺胶电泳区分野生株和突变株。对电泳后的凝胶摄像，分析判断结果，并通过荧光条带的强弱分析YMDD混合株比例。
2 结果
2.1 27例患者经用拉米夫定治疗后一年，有24例由活动性肝硬化好转为静止性肝硬化，Child-pugh评分明显减少，由B级改善为≤A级有22例，恢复日常工作者8例，临床表现明显改善。用拉米夫定治疗2、3年，患者肝硬化活动基本控制，病情稳定，27例Child-pugh评分≤A级，其中23例恢复日常工作(见表1)。肝功能明显好转，谷丙转氨酶、总胆红素下降，血清白蛋白升高(见表2)。表1 乙型肝炎肝硬化患者治疗前后临床表现及Child-pugh评分比较(略)表2 乙型肝炎肝硬化患者治疗前后肝功能情况比较(略)
2.2 27例患者拉米夫定治疗12个月HBeAg阴转13例，HBeAg/HBeAb转换5例，HBV DNA转阴24例;治疗24个月及36个月，HBeAg阴转分别为12例、18例，HBeAg/HBeAb转换分别为11例、12例，HBV DNA阴转分别为21例、18例。
2.3 27例中有6例在治疗过程中发生病毒YMDD变异，其中3例发生YMDD变异后出现肝功能损害加重并出现黄疸，在积极护肝等综合措施治疗基础上，加用膦甲酸钠(可耐，正大天晴药业产品)3.0g于5%葡萄糖液250ml中，每天静滴一次，疗程30d，同时继续服用拉米夫定，经治疗一个月1例患者HBV DNA水平明显下降，(治疗前HBV DNA3.2×10 8 拷贝/ml，治疗后HBV DNA5.6×10 6 拷贝/ml)，2例HBV DNA转阴，用PCR与限制性片段长度多态性分析检测YMDD变异株为阴性;3例肝功能明显好转，治疗2个月均肝功能恢复正常出院。
3 讨论
肝炎后肝硬化病人，如果病毒活跃复制，可加速病情进一步发展，肝脏炎症坏死加重，发展成重型肝炎，因此，及时抗病毒治疗是延缓和阻止肝硬化进展的重要手段。拉米夫定是一种口服的核苷类似物抗病毒药，通过竞争性抑制HBV DNA聚合酶参与新的HBV DNA链合成过程以终止新链合成，有效抑制HBV复制，减少血液和肝脏内病毒载量，从而减轻肝脏炎症、坏死和纤维化，延缓疾病进程，改善肝组织学，阻止肝纤维化的发展，提高病人生存质量 [3] 。Liaw等研究结果显示，对于有明显肝纤维化或肝硬化病人经拉米夫定治疗后(中位数时间32.4个月)，出现病情进展(达到临床终点)者8%，明显低于安慰剂对照组(18%) [4] ，说明拉米夫定治疗可延缓肝硬化病情进展，特别是在早期肝硬化的病人效果更好。本研究27例患者经拉米夫定治疗3年后，肝功能恢复及症状体征明显改善，肝硬化Child-pugh评分由治疗前为B级(10.5±0.4)，降为≤A级(5.3±0.4)，病情稳定及恢
复工作者达85.2%(23/27);27例服用拉米夫定1年HBV DNA阴转88.9%(24/27)，2年HBV DNA阴转77.8%(21/27)，3年HBV DNA阴转66.7%(18/27)。结果提示对有活跃病毒复制的乙型肝炎后肝硬化病人，在综合治疗基础上，加用拉米夫定抗病毒治疗，可延缓肝硬化病情进展，提高患者生存质量，在肝硬化的早、中期予积极用拉米夫定治疗，可以及早阻止病情进展，获更佳疗效。
27例在用拉米夫定治疗中6例出现病毒YMDD变异，其中3例在发生YMDD变异后出现肝功能损害，在予服用拉米夫定基础上联合膦甲酸钠抗病毒治疗，3例均肝功能恢复正常，病情稳定。建议在长期服用拉米夫定治疗肝硬化的过程中，发生YMDD变异并出现病情加重，可在综合治疗基础上，继续服用拉米夫定，并且选用其他的抗病毒药物联合治疗，至致病情控制。膦甲酸钠为非核苷类广谱抗病毒药物，可直接作用于核酸聚合酶的焦磷酸结合部位，抑制DNA病毒的DNA聚合酶和RNA病毒的RNA聚合酶，能抑制多种DNA和RNA病毒，尤其可迅速抑制乙型肝炎病毒复制 [5] 。本组资料显示，3例发生YMDD变异患者经加用膦甲酸钠一个月后，HBV DNA2例转阴，1例水平下降，提示膦甲酸钠对乙型肝炎病毒YMDD变异株，有抑制其复制作用，因病例数少还需进一步探讨。
参考文献:
1]孙剑，侯金林，王战会，等.拉米夫定乙肝病毒变异株人工构建及其限制性片段长度多态性分析[J].第一军医大学学报，1999，19:489～492.
[2]Allen MI，Gauthier J，DesLauriers M，et al.Two sensitive PCR-based methods for detection of hepatitis B virus variants associated with reduced susceptibility to lamivudine[J].J clin Microbiol，1999，37:3338～3347.
[3]姚光弼.正确认识和评价拉米夫定在治疗慢性乙型肝炎中的地位[J].肝脏，2002，7:73～74.
[4] Liaw YF，Sung JJY，Chow WC，et al.Effects of lamivudine on disease progression and development of liver cancer in advanced chronic hepatitis B:a prospective double-blined placebo-controlled clinical trial[J].Hepatology，2003，38(suppl)1:262A.
[5]邱平，贾杰，陈所贤，等.膦甲酸钠治疗重症肝炎疗效观察[J].中国热带医学，2001，1(2):124～125.
基金项目:海南省卫生厅科研基金资助(琼卫2002-57号)
作者单位:海南省人民医院，海南海口 570311.
作者简介:邱平(1964～)，女，汉族，副主任医师，主要从事传染病防治研究.
收稿日期:2005-03-16, 百拇医药(邱平，贾杰，肖芙蓉，林锋，陈所贤，吴彪)
关键词:慢性乙型肝炎;肝硬化;治疗学;拉米夫定;YMDD变异
Observation on the therapeutic effect of lamivudine on active cirrhosis of chronic hepatitis B patients three years after treatment.
QIU Ping，JIA Jie，XIAO Fu-rong，et al.
(Hainan Provincial People's Hospital，Haikou570311，Hainan，P.R.China)
Abstract:Objective To study the therapy effect of long term for3years with lamivudine treatment on active cirrhosis following chronic hepatitis B，and explore the management for liver damage after the YMDD mutations of hepatitis B virus during lamivudine treatment for active cirrhosis. Methods 27patients received lamivudine100mg orally everyday for36months.The changes were observed，including clinical symptoms and signs，aminotransferase，virology indexes，and the abnormalities after the YMDD muta-tions，then further to find out plans for the latter. Results ①After lamivudine treatment，there were23patients(85.2%)whose situation stabilized，life quality improved，Child-pugh score declined，and liver function turned better;②27patients were treated with lamivudine，88.9%(24/27)HBV DNA for one year，77.8%(21/27)HBV DNA for two years and66.7%(18/27)HBV DNA for three years were negative respectively.③YMDD mutation occurred in6out of the27patients.④Three patients had severe liver injury after the YMDD mutations，were treated with Lamivudine and foscarnet，whose liver function improved and two patients HBV DNA were converted negative. Conclusion Long term treatment with lamivudine for active cirrhosis following chronic hepatitis B could improve liver function and life quality，and prevent exacerbation.It is advisable to use foscarnet and Lamivndine for hepatitis B relapsing after the YMDD mutations during lamivndine treetment.
Key words:Chronic hepatitis B;Liver cirrhosis;Therapeutics;Lamivudine;YMDD mutation
伴有病毒复制活跃的肝炎后肝硬化，病情易迅速发展，可发生肝功能衰竭死亡，因此，治疗的关键是抗病毒治疗。拉米夫定是目前公认服用方便、不良反应少的较有效的抗乙型肝炎病毒(HBV)新一代核苷类似物。本研究目的是评价拉米夫定治疗活动性肝硬化病人3年的临床疗效，现报道如下。
1 资料及方法
1.1 病例选择 27例均为1999年10月～2004年10月门诊和住院患者，根据临床表现，实验室检查，影像学检查诊断为活动性肝硬化，诊断符合2000年9月西安会议病毒性肝硬化诊断标准;全部患者均为Child-pugh B级，HBsAg阳性，HBeAg阳性或HBeAg阴性，但HBV DNA定量检测≥10 5 拷贝/ml;男24例，女3例，年龄26～60岁。
1.2 治疗方法 27例患者均接受相同的综合治疗，口服拉米夫定100mg/d，连续36个月。
1.3 观察项目及方法 用药前后记录患者症状、体征，并检测肝功能、血清HBVM及HBV-DNA，每三个月一次。乙肝病毒抗原抗体五项采用ELISA方法检测，试剂由上海静华试剂公司提供。HBV DNA采用定量荧光PCR方法检测，试剂由中山医科大学安达公司提供。
1.4 mPCR-RFLP法测定YMDD变异 采用孙剑等 [1] 设计的针对HBV DNA聚合酶区的引物对:P 24 (5′-TTC CCC CAC TGT CTG TCT GGC TTT CAG TCA T-3′，nt712～738)与P 29 (5′-ATA CCC AAA CAC AAA AGA AAA-3′，nt827～807)。其中P 24 为错配引物，其3′端第3位碱基由原来的T改为C，以期在野生株PCR产物中引进Nde I酶切位点CA*TATG(美国Promega公司产品);而YIDD和YVDD突变株nt739～741位的核苷酸序列分别是ATT和GTG，故不能被Nde I酶切。参照文献 [2] 的条件进行PCR扩增。将7μl PCR扩增产物经Nde I酶37℃酶切3h，由于野生株被Nde I酶切成89bp和26bp两个片段，可通过8%的聚丙烯酰胺胶电泳区分野生株和突变株。对电泳后的凝胶摄像，分析判断结果，并通过荧光条带的强弱分析YMDD混合株比例。
2 结果
2.1 27例患者经用拉米夫定治疗后一年，有24例由活动性肝硬化好转为静止性肝硬化，Child-pugh评分明显减少，由B级改善为≤A级有22例，恢复日常工作者8例，临床表现明显改善。用拉米夫定治疗2、3年，患者肝硬化活动基本控制，病情稳定，27例Child-pugh评分≤A级，其中23例恢复日常工作(见表1)。肝功能明显好转，谷丙转氨酶、总胆红素下降，血清白蛋白升高(见表2)。表1 乙型肝炎肝硬化患者治疗前后临床表现及Child-pugh评分比较(略)表2 乙型肝炎肝硬化患者治疗前后肝功能情况比较(略)
2.2 27例患者拉米夫定治疗12个月HBeAg阴转13例，HBeAg/HBeAb转换5例，HBV DNA转阴24例;治疗24个月及36个月，HBeAg阴转分别为12例、18例，HBeAg/HBeAb转换分别为11例、12例，HBV DNA阴转分别为21例、18例。
2.3 27例中有6例在治疗过程中发生病毒YMDD变异，其中3例发生YMDD变异后出现肝功能损害加重并出现黄疸，在积极护肝等综合措施治疗基础上，加用膦甲酸钠(可耐，正大天晴药业产品)3.0g于5%葡萄糖液250ml中，每天静滴一次，疗程30d，同时继续服用拉米夫定，经治疗一个月1例患者HBV DNA水平明显下降，(治疗前HBV DNA3.2×10 8 拷贝/ml，治疗后HBV DNA5.6×10 6 拷贝/ml)，2例HBV DNA转阴，用PCR与限制性片段长度多态性分析检测YMDD变异株为阴性;3例肝功能明显好转，治疗2个月均肝功能恢复正常出院。
3 讨论
肝炎后肝硬化病人，如果病毒活跃复制，可加速病情进一步发展，肝脏炎症坏死加重，发展成重型肝炎，因此，及时抗病毒治疗是延缓和阻止肝硬化进展的重要手段。拉米夫定是一种口服的核苷类似物抗病毒药，通过竞争性抑制HBV DNA聚合酶参与新的HBV DNA链合成过程以终止新链合成，有效抑制HBV复制，减少血液和肝脏内病毒载量，从而减轻肝脏炎症、坏死和纤维化，延缓疾病进程，改善肝组织学，阻止肝纤维化的发展，提高病人生存质量 [3] 。Liaw等研究结果显示，对于有明显肝纤维化或肝硬化病人经拉米夫定治疗后(中位数时间32.4个月)，出现病情进展(达到临床终点)者8%，明显低于安慰剂对照组(18%) [4] ，说明拉米夫定治疗可延缓肝硬化病情进展，特别是在早期肝硬化的病人效果更好。本研究27例患者经拉米夫定治疗3年后，肝功能恢复及症状体征明显改善，肝硬化Child-pugh评分由治疗前为B级(10.5±0.4)，降为≤A级(5.3±0.4)，病情稳定及恢
复工作者达85.2%(23/27);27例服用拉米夫定1年HBV DNA阴转88.9%(24/27)，2年HBV DNA阴转77.8%(21/27)，3年HBV DNA阴转66.7%(18/27)。结果提示对有活跃病毒复制的乙型肝炎后肝硬化病人，在综合治疗基础上，加用拉米夫定抗病毒治疗，可延缓肝硬化病情进展，提高患者生存质量，在肝硬化的早、中期予积极用拉米夫定治疗，可以及早阻止病情进展，获更佳疗效。
27例在用拉米夫定治疗中6例出现病毒YMDD变异，其中3例在发生YMDD变异后出现肝功能损害，在予服用拉米夫定基础上联合膦甲酸钠抗病毒治疗，3例均肝功能恢复正常，病情稳定。建议在长期服用拉米夫定治疗肝硬化的过程中，发生YMDD变异并出现病情加重，可在综合治疗基础上，继续服用拉米夫定，并且选用其他的抗病毒药物联合治疗，至致病情控制。膦甲酸钠为非核苷类广谱抗病毒药物，可直接作用于核酸聚合酶的焦磷酸结合部位，抑制DNA病毒的DNA聚合酶和RNA病毒的RNA聚合酶，能抑制多种DNA和RNA病毒，尤其可迅速抑制乙型肝炎病毒复制 [5] 。本组资料显示，3例发生YMDD变异患者经加用膦甲酸钠一个月后，HBV DNA2例转阴，1例水平下降，提示膦甲酸钠对乙型肝炎病毒YMDD变异株，有抑制其复制作用，因病例数少还需进一步探讨。
参考文献:
1]孙剑，侯金林，王战会，等.拉米夫定乙肝病毒变异株人工构建及其限制性片段长度多态性分析[J].第一军医大学学报，1999，19:489～492.
[2]Allen MI，Gauthier J，DesLauriers M，et al.Two sensitive PCR-based methods for detection of hepatitis B virus variants associated with reduced susceptibility to lamivudine[J].J clin Microbiol，1999，37:3338～3347.
[3]姚光弼.正确认识和评价拉米夫定在治疗慢性乙型肝炎中的地位[J].肝脏，2002，7:73～74.
[4] Liaw YF，Sung JJY，Chow WC，et al.Effects of lamivudine on disease progression and development of liver cancer in advanced chronic hepatitis B:a prospective double-blined placebo-controlled clinical trial[J].Hepatology，2003，38(suppl)1:262A.
[5]邱平，贾杰，陈所贤，等.膦甲酸钠治疗重症肝炎疗效观察[J].中国热带医学，2001，1(2):124～125.
基金项目:海南省卫生厅科研基金资助(琼卫2002-57号)
作者单位:海南省人民医院，海南海口 570311.
作者简介:邱平(1964～)，女，汉族，副主任医师，主要从事传染病防治研究.
收稿日期:2005-03-16, 百拇医药(邱平，贾杰，肖芙蓉，林锋，陈所贤，吴彪)