东亚钳蝎蝎毒抗肿瘤多肽对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用
【摘要】 目的 探讨东亚钳蝎蝎毒抗肿瘤多肽组分V对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。 方法 采用凝胶过滤层析结合离子交换层析法分离蝎毒抗肿瘤多肽组分V，然后对荷瘤小鼠腹腔注射抗肿瘤多肽V，同时设立对照组及阳性给药组，观察对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。 结果 蝎毒抗肿瘤多肽注射组小鼠的抑瘤率明显高于空白对照组，肿瘤生长速度相对缓慢(P<0.01)。与阳性给药组的结果差异无显著性。 结论 蝎毒抗肿瘤多肽V能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，有进一步开发为抗肿瘤新药的可能。
关键词 东亚钳蝎 抗肿瘤多肽 生长抑制 荷瘤小鼠
The inhibitory effect of anti-tumor peptide fraction V from
crew scorpion venom on murine tumor
Wei Zhengren，Chang Youquan，Huo Desheng
Pharmacological Dept.of Basic Medical School of Jilin University，130021.
【Abstract】 Objective To study the inhibitory effect of anti-tumor peptide fraction V from crew scorpion venom of buthus martensii Karsch on tumor bearing mice.Methods Gel chromatography cooperated with iron-ex-changed chromatography were applied to purified anti-tumor peptide fraction V(ATPV).The mice were treated with(ATPV)with various dose by i.p.compared with positive control and blank control group to observe the inhibition of tumor growth.Results The inhibitory ratios of S180tumor growth of experimental groups are higher than that of blank control significantly，and the relative grow speed is lower(P<0.01)，in addition，shows no difference compared with positive control group.Conclusion These results suggest that ATPV can inhibit tumor growth on mice.So，it could be develop a new potent drug applied in anti-tumor field.
Key words buthus martensii Karsch anti-tumor peptide inhibition of tumor growth tumor-bearing mice
东亚钳蝎是传统的名贵中药材之一，早在宋代全蝎就用于治疗惊厥、小儿惊风、癫痫等疾病。在中医治疗上，降血压、抗惊厥、免疫调节、抗肿瘤等方面的实践业已取得了很好的效果 [1～3] 。开发有效、相对毒副作用较小的抗肿瘤新药 [4] 一直是国内外科研人员追求的目标。本实验组近年来，一直从事蝎毒抗肿瘤多肽各组分的分离纯化及其药理活性等研究工作。蝎毒抗肿瘤多肽组分是从东亚钳蝎中分离的一组多肽类物质，目前初步估计成员有二十余种。大部分成员组分可通过多种机制对多种癌组织的生长具有明显的抑制作用，为了更好地研究蝎毒的抗肿瘤作用，笔者分离纯化了抗肿瘤组分V，为进一步阐明此组分的药理学活性，我们观察了其对S 180 荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用。
1 材料和方法
1.1 动物 本实验动物为昆明小鼠，由吉林大学实验动物部提供，体重18～22g，雌雄各半。
1.2 试剂与仪器 蝎毒粗毒:购自吉林通化东亚钳蝎养殖厂。CM-Sephadex-C-50，购自瑞典Pharmacia公司。Sephadex G-100，购自瑞典Pharmacia公司。环磷酰胺，购自美国Merck公司。余下试剂均为北京化工分析纯试剂。
1.3 方法
1.3.1 样品的预先处理 称取20mg蝎毒冻干粉粗品溶于3ml磷酸盐溶液中，4℃以15000rpm离心10min，取上清液。
1.3.2 Sephadex G-100柱层析 灌制Sephadex G-100凝胶柱，柱长110cm，直径为5cm，取蝎毒上清液上样，用pH7.4的0.1mol/L Na 2 HPO 4 ·NaH 2 PO 4 缓冲液按0.6ml/min的流速进行洗脱20h，同时用紫外跟踪检测，收集第3个峰，用聚乙二醇20000浓缩备用。
1.3.3 CM-Sephadex-C-50阴离子交换凝胶层析 灌制CM-Sephadex-C-50阴离子交换凝胶层析柱，柱长30cm，直径5cm。将上述蝎毒浓缩液溶于10ml0.005mol/L PB中，用PBS进行线性梯度洗脱，收集第5个峰，用Sephadax G10除盐后，冷冻干燥备用。
1.3.4 实验分组和给药 将引入的肿瘤小鼠饲养7d后，无菌切下瘤组织，接种于小鼠左后肢皮下，7d后挑选瘤体为200mm 3 左右的小鼠，按照小鼠的体重和瘤体积的大小分级后，随机分为5组，每组12只。(1)空白对照组:不做任何处理;(2)阳性给药组:腹腔注射环磷酰胺80mg/(kg·次);(3)高剂量组:腹腔注射蝎毒抗肿瘤多肽组分V0.08mg/(kg·次);(4)中剂量组:腹腔注射抗肿瘤多肽V0.05mg/(kg·次);(5)低剂量组:腹腔注射抗肿瘤多肽V0.02mg/(kg·次)。每天注射1次，连续7d。于末次给药24h后，处死小鼠，剥离肿瘤并称重，做数据处理和分析。
1.3.5 观察指标 抑瘤率=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%;肿瘤相对增长速度:即最后测量时肿瘤体积与给药前肿瘤初体积的比值。
1.3.6 统计学处理 实验重复2次，采用SPSS数据统计软件，做组间两均数比较的t检验。
2 结果
2.1 柱层析和离子交换层析的结果 蝎毒粗毒冻干粉预处理后经Sephadex G-100凝胶柱分离洗脱，在60～225号管依次可洗脱峰1～峰6(见层析图1)，根据后续的HPCE检测，峰3为目的峰，管号为121～142，回收体积为220ml。 蛋白总回收率为86.7%。
因Sephadex G-100凝胶过滤层析为粗分离，为得到更进一步的精细分离产物，我们采用CM-Sephadex-C-50阴离子交换凝胶层析法对目的峰3进行进一步的分离、纯化。纯化后在380号管前呈现7组峰(见层析图2)，根据后续分析型HPCE的检测判定结果，其中峰5为目的峰，即抗肿瘤多肽组分V，管号267～302，洗脱体积460ml，纯度94.5%，蛋白总回收率为73.2%。
图1 粗蝎毒的Sephadex G-100凝胶柱层析图谱略
图2 峰3的CM-Sephadex-C-50阴离子交换凝胶层析图谱略
2.2 各处理组对S 180 荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 见表1。
表1 抗肿瘤多肽对荷瘤小鼠抑瘤率的影响 略
从表1中可见，在各组对S 180 荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制影响上，抗肿瘤多肽V的高、中、低剂量组与空白对照组比较差异均有显著性，并且高剂量给药组的抑瘤率接近环磷酰胺组，粗毒给药组的效果介于低剂量给药组和中剂量给药组之间。结果显示不同剂量的抗肿瘤多肽V组具有抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长作用，且呈明显的剂量依赖性关系。
2.3 各处理组对瘤体积变化的影响 见表2。
从表2中可见，抗肿瘤多肽V的高、中、低剂量组均能在不同程度上控制肿瘤相对增长速度的变化，与空白对照组相比差异有显著性。其中高剂量给药组的结果接近环磷酰胺组，粗毒给药组的效果介于低剂量给药组和中剂量给药组之间。结果显示不同剂量的抗肿瘤多肽V组具有控制荷瘤小鼠肿瘤相对增长速度的药理学效应，且呈明显的剂量依赖性关系。
表2 抗肿瘤多肽V对荷瘤小鼠肿瘤相对增长速度的影响略
3 讨论
抗肿瘤多肽组分V是利用分子筛层析技术结合离子交换层析从粗蝎毒中分离出的抗肿瘤有效成分，以往的实验表明，粗毒能明显抑制H22带瘤小鼠肿瘤的生长，但同时小鼠也呈现强过敏反应，为了纯化蝎毒的粗毒，提高药效，减低毒副作用，本实验组通过对粗毒进行简单的预处理后，再利用分子筛层析结合离子交换层析两步法技术 [5，6] 简便地从粗毒中纯化出相对纯度较高的抗肿瘤组分V。我们对其进行了抗肿瘤作用的初步研究。实验中观察到，抗肿瘤多肽V能够明显抑制S 180 荷瘤小鼠肿瘤的生长，控制肿瘤生长的相对生长速度，实验中观察到，抗肿瘤组分V能够明显抑制S 180 的生长，高浓度时的抑瘤率达48.33%，接近环磷酰胺组的抑瘤率(51.71%)，高于分离前粗毒的抑瘤率(38.65%)，说明抗肿瘤组分V与粗毒比较是一种分离纯化度高、抑制肿瘤作用更加明显的有效成分。由于目前的抗肿瘤化疗药大部分都有较强的毒副作用，所以开发低毒性、强效的抗肿瘤新药已成为当务之急。下一步我们将从此组分的抗肿瘤作用机制研究入手探讨其靶向作用位点，进一步完善其基础理论的研究。
参考文献
1 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编，北京:人民卫生出版社，1990，53.
2 周新华.蝎毒生理活性的研究.沈阳药学报，1984，1(3):357-362.
3 Brone B，Tytgat J，Van Kerkhove E.Characterization of Na(+)currents in isolated dorsal unpaired median neurons of Locusta migratoria and ef-fect of the alpha-like scorpion toxin BmK M1.J Insect Physiol，2003 Feb，49(2):171-182.
4 Carter T，Sterling-Levis K，Ow K，Doughty L.Biodistributions of intact monoclonal antibodies and fragments of BLCA-38，a new prostate can-cer directed antibody.Cancer Immunol Immunother，2004Jun，53(6):533-542.Epub2004Jan13.
5 Wickramaratna JC，Fry BG，Loiacono RE.Isolation and characterization at cholinergic nicotinic receptors of a neurotoxin from the venom of the Acanthophis sp.Biochem Pharmacol，2004Jul15，68(2):383-394.
6 Lopez-Vera E，Heimer de la Cotera EP.A novel structural class of tox-ins:the methionine-rich peptides from the venoms.Toxicon，2004Mar15，43(4):365-374.
作者单位:130021吉林大学基础医学院药理学教研室(△ 免疫学教研室)
(收稿日期:2004-09-20) (编辑青 山), http://www.100md.com(魏征人 昌友权 霍德胜)
关键词 东亚钳蝎 抗肿瘤多肽 生长抑制 荷瘤小鼠
The inhibitory effect of anti-tumor peptide fraction V from
crew scorpion venom on murine tumor
Wei Zhengren，Chang Youquan，Huo Desheng
Pharmacological Dept.of Basic Medical School of Jilin University，130021.
【Abstract】 Objective To study the inhibitory effect of anti-tumor peptide fraction V from crew scorpion venom of buthus martensii Karsch on tumor bearing mice.Methods Gel chromatography cooperated with iron-ex-changed chromatography were applied to purified anti-tumor peptide fraction V(ATPV).The mice were treated with(ATPV)with various dose by i.p.compared with positive control and blank control group to observe the inhibition of tumor growth.Results The inhibitory ratios of S180tumor growth of experimental groups are higher than that of blank control significantly，and the relative grow speed is lower(P<0.01)，in addition，shows no difference compared with positive control group.Conclusion These results suggest that ATPV can inhibit tumor growth on mice.So，it could be develop a new potent drug applied in anti-tumor field.
Key words buthus martensii Karsch anti-tumor peptide inhibition of tumor growth tumor-bearing mice
东亚钳蝎是传统的名贵中药材之一，早在宋代全蝎就用于治疗惊厥、小儿惊风、癫痫等疾病。在中医治疗上，降血压、抗惊厥、免疫调节、抗肿瘤等方面的实践业已取得了很好的效果 [1～3] 。开发有效、相对毒副作用较小的抗肿瘤新药 [4] 一直是国内外科研人员追求的目标。本实验组近年来，一直从事蝎毒抗肿瘤多肽各组分的分离纯化及其药理活性等研究工作。蝎毒抗肿瘤多肽组分是从东亚钳蝎中分离的一组多肽类物质，目前初步估计成员有二十余种。大部分成员组分可通过多种机制对多种癌组织的生长具有明显的抑制作用，为了更好地研究蝎毒的抗肿瘤作用，笔者分离纯化了抗肿瘤组分V，为进一步阐明此组分的药理学活性，我们观察了其对S 180 荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用。
1 材料和方法
1.1 动物 本实验动物为昆明小鼠，由吉林大学实验动物部提供，体重18～22g，雌雄各半。
1.2 试剂与仪器 蝎毒粗毒:购自吉林通化东亚钳蝎养殖厂。CM-Sephadex-C-50，购自瑞典Pharmacia公司。Sephadex G-100，购自瑞典Pharmacia公司。环磷酰胺，购自美国Merck公司。余下试剂均为北京化工分析纯试剂。
1.3 方法
1.3.1 样品的预先处理 称取20mg蝎毒冻干粉粗品溶于3ml磷酸盐溶液中，4℃以15000rpm离心10min，取上清液。
1.3.2 Sephadex G-100柱层析 灌制Sephadex G-100凝胶柱，柱长110cm，直径为5cm，取蝎毒上清液上样，用pH7.4的0.1mol/L Na 2 HPO 4 ·NaH 2 PO 4 缓冲液按0.6ml/min的流速进行洗脱20h，同时用紫外跟踪检测，收集第3个峰，用聚乙二醇20000浓缩备用。
1.3.3 CM-Sephadex-C-50阴离子交换凝胶层析 灌制CM-Sephadex-C-50阴离子交换凝胶层析柱，柱长30cm，直径5cm。将上述蝎毒浓缩液溶于10ml0.005mol/L PB中，用PBS进行线性梯度洗脱，收集第5个峰，用Sephadax G10除盐后，冷冻干燥备用。
1.3.4 实验分组和给药 将引入的肿瘤小鼠饲养7d后，无菌切下瘤组织，接种于小鼠左后肢皮下，7d后挑选瘤体为200mm 3 左右的小鼠，按照小鼠的体重和瘤体积的大小分级后，随机分为5组，每组12只。(1)空白对照组:不做任何处理;(2)阳性给药组:腹腔注射环磷酰胺80mg/(kg·次);(3)高剂量组:腹腔注射蝎毒抗肿瘤多肽组分V0.08mg/(kg·次);(4)中剂量组:腹腔注射抗肿瘤多肽V0.05mg/(kg·次);(5)低剂量组:腹腔注射抗肿瘤多肽V0.02mg/(kg·次)。每天注射1次，连续7d。于末次给药24h后，处死小鼠，剥离肿瘤并称重，做数据处理和分析。
1.3.5 观察指标 抑瘤率=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%;肿瘤相对增长速度:即最后测量时肿瘤体积与给药前肿瘤初体积的比值。
1.3.6 统计学处理 实验重复2次，采用SPSS数据统计软件，做组间两均数比较的t检验。
2 结果
2.1 柱层析和离子交换层析的结果 蝎毒粗毒冻干粉预处理后经Sephadex G-100凝胶柱分离洗脱，在60～225号管依次可洗脱峰1～峰6(见层析图1)，根据后续的HPCE检测，峰3为目的峰，管号为121～142，回收体积为220ml。 蛋白总回收率为86.7%。
因Sephadex G-100凝胶过滤层析为粗分离，为得到更进一步的精细分离产物，我们采用CM-Sephadex-C-50阴离子交换凝胶层析法对目的峰3进行进一步的分离、纯化。纯化后在380号管前呈现7组峰(见层析图2)，根据后续分析型HPCE的检测判定结果，其中峰5为目的峰，即抗肿瘤多肽组分V，管号267～302，洗脱体积460ml，纯度94.5%，蛋白总回收率为73.2%。
图1 粗蝎毒的Sephadex G-100凝胶柱层析图谱略
图2 峰3的CM-Sephadex-C-50阴离子交换凝胶层析图谱略
2.2 各处理组对S 180 荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 见表1。
表1 抗肿瘤多肽对荷瘤小鼠抑瘤率的影响 略
从表1中可见，在各组对S 180 荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制影响上，抗肿瘤多肽V的高、中、低剂量组与空白对照组比较差异均有显著性，并且高剂量给药组的抑瘤率接近环磷酰胺组，粗毒给药组的效果介于低剂量给药组和中剂量给药组之间。结果显示不同剂量的抗肿瘤多肽V组具有抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长作用，且呈明显的剂量依赖性关系。
2.3 各处理组对瘤体积变化的影响 见表2。
从表2中可见，抗肿瘤多肽V的高、中、低剂量组均能在不同程度上控制肿瘤相对增长速度的变化，与空白对照组相比差异有显著性。其中高剂量给药组的结果接近环磷酰胺组，粗毒给药组的效果介于低剂量给药组和中剂量给药组之间。结果显示不同剂量的抗肿瘤多肽V组具有控制荷瘤小鼠肿瘤相对增长速度的药理学效应，且呈明显的剂量依赖性关系。
表2 抗肿瘤多肽V对荷瘤小鼠肿瘤相对增长速度的影响略
3 讨论
抗肿瘤多肽组分V是利用分子筛层析技术结合离子交换层析从粗蝎毒中分离出的抗肿瘤有效成分，以往的实验表明，粗毒能明显抑制H22带瘤小鼠肿瘤的生长，但同时小鼠也呈现强过敏反应，为了纯化蝎毒的粗毒，提高药效，减低毒副作用，本实验组通过对粗毒进行简单的预处理后，再利用分子筛层析结合离子交换层析两步法技术 [5，6] 简便地从粗毒中纯化出相对纯度较高的抗肿瘤组分V。我们对其进行了抗肿瘤作用的初步研究。实验中观察到，抗肿瘤多肽V能够明显抑制S 180 荷瘤小鼠肿瘤的生长，控制肿瘤生长的相对生长速度，实验中观察到，抗肿瘤组分V能够明显抑制S 180 的生长，高浓度时的抑瘤率达48.33%，接近环磷酰胺组的抑瘤率(51.71%)，高于分离前粗毒的抑瘤率(38.65%)，说明抗肿瘤组分V与粗毒比较是一种分离纯化度高、抑制肿瘤作用更加明显的有效成分。由于目前的抗肿瘤化疗药大部分都有较强的毒副作用，所以开发低毒性、强效的抗肿瘤新药已成为当务之急。下一步我们将从此组分的抗肿瘤作用机制研究入手探讨其靶向作用位点，进一步完善其基础理论的研究。
参考文献
1 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编，北京:人民卫生出版社，1990，53.
2 周新华.蝎毒生理活性的研究.沈阳药学报，1984，1(3):357-362.
3 Brone B，Tytgat J，Van Kerkhove E.Characterization of Na(+)currents in isolated dorsal unpaired median neurons of Locusta migratoria and ef-fect of the alpha-like scorpion toxin BmK M1.J Insect Physiol，2003 Feb，49(2):171-182.
4 Carter T，Sterling-Levis K，Ow K，Doughty L.Biodistributions of intact monoclonal antibodies and fragments of BLCA-38，a new prostate can-cer directed antibody.Cancer Immunol Immunother，2004Jun，53(6):533-542.Epub2004Jan13.
5 Wickramaratna JC，Fry BG，Loiacono RE.Isolation and characterization at cholinergic nicotinic receptors of a neurotoxin from the venom of the Acanthophis sp.Biochem Pharmacol，2004Jul15，68(2):383-394.
6 Lopez-Vera E，Heimer de la Cotera EP.A novel structural class of tox-ins:the methionine-rich peptides from the venoms.Toxicon，2004Mar15，43(4):365-374.
作者单位:130021吉林大学基础医学院药理学教研室(△ 免疫学教研室)
(收稿日期:2004-09-20) (编辑青 山), http://www.100md.com(魏征人 昌友权 霍德胜)