一起流行性感冒疫情相关病原学调查
摘要：目的 检测流行性感冒疫情相关病原，为呼吸道感染性疾病爆发疫情中病原体的确定提供实验依据。 方法 采用PCR、免疫荧光及混合细胞培养法，对类似肺炎的呼吸道感染爆发疫情中的患者标本进行多种常见呼吸道病原体检测。 结果 8名患者的含漱液中检出6株肺炎支原体及2株甲3型流感病毒；血清IgM抗体检测，3份肺炎支原体IgM抗体阳性、5份甲型流感IgM抗体阳性。 结论 呼吸道感染性疾病，可能由多病原体引起，在进行病原学分析时应尽可能进行分类检测，以求证病原体的检验证据，为疾病诊治提供依据。
关键词：流行性感冒；流感病毒；肺炎支原体；爆发
中图分类号：R5117 文献标识码：A 文章编号：1009-9727(2005)02-198-02
Investigation of pathogens associated with an infection of epidemic influenza HU Feng-jiao, GAO Hong, ZHANG Zhu, et al (Department of Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315010, Zhejiang, P R China)
Abstract: Objective To detect the pathogen associated with an infection of epidemic influenza and provide experimental basis for determination of pathogens in outbreaks of respiratory tract infection Methods The methods of PCR,immunofluorescence and omnibuse cells culture were used for determinmation of several common pathogens in the samples collected during outbreaks of respiratory tract infection similar to pneumonia Results Six strains of Mycoplasma pneumonia and 2 strains of influenza A virus (H3N2) were detected from 8 samples Three samples were IgM antibody positive for Mycoplasma pneumonia and 5 IgM antibody positive for influenza A Conclusion The respiratory tract infections might result from a number of pathogens,differentiating determination be carried out for ascertaining the pathogens in order to provide basis for adopting control measures
Key words:Influenza; Mycoplasma pneumonia; Respiratory tract infection
呼吸道感染性疾病的爆发，疫情具发生快、传播迅速等特点。在疫情处理中能快速查明病原体，对疫情的及时控制和快速扑灭以及对患者及时正确的治疗都十分重要。2004年上半年，对宁波市区一家医院就诊的某学校8名学生因患类似肺炎的呼吸道感染的患者，采集含漱液及血液进行了病原学检测。结果在含漱液标本中检出肺炎支原体，同时也检出甲3型流感病毒。现将情况报告如下。
1 材料和方法
11 样品来源于宁波市第一医院发热门诊观察室及病房，分别用10ml生理盐水采集病人的含漱液，置冰盒内带回实验室供作肺炎支原体和衣原体核酸快速检测以及呼吸道病毒分离；同时抽取患者静脉血液3ml测定IgM抗体。
12 肺炎支原体及衣原体核酸检测剂购于上海宝生科技发展有限公司。用于分离病毒的MDCK(第36代)细胞及LLC(第312代)细胞由复旦大学公共卫生学院提供；HEP-2细胞由浙江省疾控中心病毒室提供。检测呼吸道病毒抗原的流感甲、乙型病毒和副流感病毒1～3型及呼吸道合胞病毒、腺病毒单克隆荧光抗体购自美国CHEMICON公司(LOT：23110017；Exp:2005，03)；IgM抗体检测的9种病原体联检试剂(军团菌、肺炎支原体、衣原体、Q热立克次氏体，流感甲、乙型和呼吸道合胞、副流感、腺病毒)购自西班牙VIRCELL公司的间接免疫荧光试剂(LOT：03M209，EXP：2004，11)。
13 PCR检测按操作说明书处理样品及配制反应体系。循环条件设置：预变性95℃ 5min，然后按94℃ 40s、55℃ 40s、72℃ 90s循环35次，最后72℃延长至3min。琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察到144bp的条带为肺炎支原体阳性、430bp的条带为肺炎衣原体阳性。
14 呼吸道病毒检测用的MDCK、HEP-2、LLC三株细胞分别在细胞瓶中长成单层后经EDTA-胰酶消化，分别对3株细胞悬液进行计数后制成15万/ml的细胞悬液，将3株细胞液等量混合种植于24孔塑料细胞培养板，在35℃、5%CO2条件下培养，形成单层后24～48h内使用。接种标本时先用无血清的MEM洗涤细胞面3次，每孔接种标本02ml，每份标本接种2孔，同时设细胞对照。接种后置35℃恒温摇床150rpm×60min，吸去接种物用无血清MEM洗涤细胞面2次，每孔加入无血清维持液1ml，于35℃、5%CO2中培养。次日起每日观察细胞病变，连续观察4d，出现细胞病变者先作流感病毒鉴定，若流感病毒阴性再作其它常见呼吸道病毒鉴定。4d后未出现病变者盲传一代，仍未出现病变及血凝者将细胞刮下，固定于玻片上，每份样品做7孔，分别滴加流感甲、乙型和副流感1、2、3型及呼吸道合胞病毒及腺病毒单克隆荧光抗体，于37℃ 1h，PBS漂洗后凉干封闭，荧光显微镜观察结果。
15 血清中9种病原体IgM抗体测定按试剂说明书进行操作。
2 结果
21 PCR检测结果 在8份患者标本中检出6份肺炎支原体阳性。8份样品均未检测到430bp的肺炎衣原体DNA片段。提示这8名患者有6名中感染肺炎支原体。
22 呼吸道病毒分离结果 在混合细胞培养中，8份患者标本有2份出现细胞病变，其培养物与豚鼠血球凝集而不凝集公鸡血球。经用诊断血清作血凝抑制试验鉴定结果为甲3型流感病毒。其余标本经2代培养仍未出现细胞病变，经单克隆荧光抗体检测结果除上述2份样品甲型流感阳性外，其余样品流感甲、乙型和副流感1、2、3型及呼吸道合胞病毒、腺病毒均为阴性。
23 血清IgM抗体测定结果 经9种病原体IgM抗体联检试剂的免疫荧光检测，8份标本中3份肺炎支原体IgM抗体阳性，5份甲型流感IgM抗体阳性。其余7种病原体的检测结果均为阴性。显示这些患者中近期有肺炎支原体及流感病毒的感染。
8份患者含漱液标本的PCR检测、流感病毒分离及血清标本IgM抗体免疫荧光检测主要结果见表1。
表1 8份患者标本的PCR、流感病毒分离及免疫荧光检测主要结果 (略)
注：其余均为阴性结果，未列入表中。
3 讨论
呼吸道感染的病原体较复杂，对爆发疫情的病原学调查往往不是每次均能查到病原体。在本文的调查结果中，以病原学、分子生物学及血清学三种方法证实了在本次疫情中有两种病原体同时存在。在同一起爆发疫情中检出两种均能引起爆发疫情的病原体较为少见。这对流行病学调查有着重要意义，提示有时一起爆发疫情也可以是由两种完全不同病原体引起或混合感染并发的传染病。流感病毒在流行中常合并其它呼吸道病原体感染，但一般均为个案性。两种病原体并发感染造成一个爆发疫情这为巧合。在当时对当地流感监测点的监测结果也显示，这一时期本市正好是甲3型流感的流行期，流行毒株与本次疫情中分离到的流感毒株型别完全一致。于本次含漱液标本中检出甲3型流感病毒且于大多数患者血清中亦检出其IgM抗体阳性说明当时校园内正在流行甲3型流感，同时在PCR检测中又有如此多的标本测到肺炎支原体DNA片段及血清中也检测出支原体的IgM抗体，说明当时恰好肺炎支原体也同时于其中流行，造成两个不同的传染病混合在同一校园内流行。可见在流感流行季节，不但有流感病毒的流行，其它呼吸道疾病也可同时流行[1，2]。
通常根据临床症状及经验怀疑为某种病原感染，选用适合该病原体生长的方法进行病原体培养分离。但呼吸道感染临床症状往往很相似，单针对某一病原体的培养往往得不到阳性结果。因为呼吸道感染常见的病毒有甲、乙型流感病毒，Ⅰ～Ⅲ型副流感病毒，呼吸道合胞病毒和腺病毒等，采用单一细胞分离可能对某些病毒不太敏感[3]。用MDCK、HEP-2、LLC混合细胞分离病毒，不仅可以分离到易于造成爆发流行的流感病毒，同时还可以分离到其它常见的呼吸道病毒，如副流感、呼吸道合胞及腺病毒等。配上单克隆荧光抗体既可以对培养物中常见的呼吸道病毒进行鉴定，又可早期对培养物进行上述病毒的快速检测。混合细胞培养再加上PCR检测肺炎支原体及衣原体方法使被检测的病原体范围扩大，检测速度也加快，提高了流行病学调查中应急反应的能力。因此，对群体性爆发疫情作病原调查时，应尽可能使用多种方法及手段进行多种病原体的检测，也不能因为查到了某种病原体就轻易地认定是该种病原体引起的爆发，而是还要结合有关因素考虑其它病原体并发感染的可能性，这样才能为爆发疫情的流行病学和病原学调查提供更完整准确的实验室依据。
参考文献：
[1] 段佩若，赵华，彭世勇北京甲3流感流行中合并其它呼吸道病毒感染的调查研究[J]免疫学杂志，2000，16：127～129
[2] Perrotta DM,Decker M,Glezen WP Acute respiratory disease hospitalizations as a measure of impact of epidemic influenza[J] Am J Epidemiol,1985,122:468～476
[3] 郭元吉，温乐英，王敏，等一种新的流感快速诊断方法[J]中华实验和临床病毒学杂志，2002，16：207～210, 百拇医药
关键词：流行性感冒；流感病毒；肺炎支原体；爆发
中图分类号：R5117 文献标识码：A 文章编号：1009-9727(2005)02-198-02
Investigation of pathogens associated with an infection of epidemic influenza HU Feng-jiao, GAO Hong, ZHANG Zhu, et al (Department of Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315010, Zhejiang, P R China)
Abstract: Objective To detect the pathogen associated with an infection of epidemic influenza and provide experimental basis for determination of pathogens in outbreaks of respiratory tract infection Methods The methods of PCR,immunofluorescence and omnibuse cells culture were used for determinmation of several common pathogens in the samples collected during outbreaks of respiratory tract infection similar to pneumonia Results Six strains of Mycoplasma pneumonia and 2 strains of influenza A virus (H3N2) were detected from 8 samples Three samples were IgM antibody positive for Mycoplasma pneumonia and 5 IgM antibody positive for influenza A Conclusion The respiratory tract infections might result from a number of pathogens,differentiating determination be carried out for ascertaining the pathogens in order to provide basis for adopting control measures
Key words:Influenza; Mycoplasma pneumonia; Respiratory tract infection
呼吸道感染性疾病的爆发，疫情具发生快、传播迅速等特点。在疫情处理中能快速查明病原体，对疫情的及时控制和快速扑灭以及对患者及时正确的治疗都十分重要。2004年上半年，对宁波市区一家医院就诊的某学校8名学生因患类似肺炎的呼吸道感染的患者，采集含漱液及血液进行了病原学检测。结果在含漱液标本中检出肺炎支原体，同时也检出甲3型流感病毒。现将情况报告如下。
1 材料和方法
11 样品来源于宁波市第一医院发热门诊观察室及病房，分别用10ml生理盐水采集病人的含漱液，置冰盒内带回实验室供作肺炎支原体和衣原体核酸快速检测以及呼吸道病毒分离；同时抽取患者静脉血液3ml测定IgM抗体。
12 肺炎支原体及衣原体核酸检测剂购于上海宝生科技发展有限公司。用于分离病毒的MDCK(第36代)细胞及LLC(第312代)细胞由复旦大学公共卫生学院提供；HEP-2细胞由浙江省疾控中心病毒室提供。检测呼吸道病毒抗原的流感甲、乙型病毒和副流感病毒1～3型及呼吸道合胞病毒、腺病毒单克隆荧光抗体购自美国CHEMICON公司(LOT：23110017；Exp:2005，03)；IgM抗体检测的9种病原体联检试剂(军团菌、肺炎支原体、衣原体、Q热立克次氏体，流感甲、乙型和呼吸道合胞、副流感、腺病毒)购自西班牙VIRCELL公司的间接免疫荧光试剂(LOT：03M209，EXP：2004，11)。
13 PCR检测按操作说明书处理样品及配制反应体系。循环条件设置：预变性95℃ 5min，然后按94℃ 40s、55℃ 40s、72℃ 90s循环35次，最后72℃延长至3min。琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察到144bp的条带为肺炎支原体阳性、430bp的条带为肺炎衣原体阳性。
14 呼吸道病毒检测用的MDCK、HEP-2、LLC三株细胞分别在细胞瓶中长成单层后经EDTA-胰酶消化，分别对3株细胞悬液进行计数后制成15万/ml的细胞悬液，将3株细胞液等量混合种植于24孔塑料细胞培养板，在35℃、5%CO2条件下培养，形成单层后24～48h内使用。接种标本时先用无血清的MEM洗涤细胞面3次，每孔接种标本02ml，每份标本接种2孔，同时设细胞对照。接种后置35℃恒温摇床150rpm×60min，吸去接种物用无血清MEM洗涤细胞面2次，每孔加入无血清维持液1ml，于35℃、5%CO2中培养。次日起每日观察细胞病变，连续观察4d，出现细胞病变者先作流感病毒鉴定，若流感病毒阴性再作其它常见呼吸道病毒鉴定。4d后未出现病变者盲传一代，仍未出现病变及血凝者将细胞刮下，固定于玻片上，每份样品做7孔，分别滴加流感甲、乙型和副流感1、2、3型及呼吸道合胞病毒及腺病毒单克隆荧光抗体，于37℃ 1h，PBS漂洗后凉干封闭，荧光显微镜观察结果。
15 血清中9种病原体IgM抗体测定按试剂说明书进行操作。
2 结果
21 PCR检测结果 在8份患者标本中检出6份肺炎支原体阳性。8份样品均未检测到430bp的肺炎衣原体DNA片段。提示这8名患者有6名中感染肺炎支原体。
22 呼吸道病毒分离结果 在混合细胞培养中，8份患者标本有2份出现细胞病变，其培养物与豚鼠血球凝集而不凝集公鸡血球。经用诊断血清作血凝抑制试验鉴定结果为甲3型流感病毒。其余标本经2代培养仍未出现细胞病变，经单克隆荧光抗体检测结果除上述2份样品甲型流感阳性外，其余样品流感甲、乙型和副流感1、2、3型及呼吸道合胞病毒、腺病毒均为阴性。
23 血清IgM抗体测定结果 经9种病原体IgM抗体联检试剂的免疫荧光检测，8份标本中3份肺炎支原体IgM抗体阳性，5份甲型流感IgM抗体阳性。其余7种病原体的检测结果均为阴性。显示这些患者中近期有肺炎支原体及流感病毒的感染。
8份患者含漱液标本的PCR检测、流感病毒分离及血清标本IgM抗体免疫荧光检测主要结果见表1。
表1 8份患者标本的PCR、流感病毒分离及免疫荧光检测主要结果 (略)
注：其余均为阴性结果，未列入表中。
3 讨论
呼吸道感染的病原体较复杂，对爆发疫情的病原学调查往往不是每次均能查到病原体。在本文的调查结果中，以病原学、分子生物学及血清学三种方法证实了在本次疫情中有两种病原体同时存在。在同一起爆发疫情中检出两种均能引起爆发疫情的病原体较为少见。这对流行病学调查有着重要意义，提示有时一起爆发疫情也可以是由两种完全不同病原体引起或混合感染并发的传染病。流感病毒在流行中常合并其它呼吸道病原体感染，但一般均为个案性。两种病原体并发感染造成一个爆发疫情这为巧合。在当时对当地流感监测点的监测结果也显示，这一时期本市正好是甲3型流感的流行期，流行毒株与本次疫情中分离到的流感毒株型别完全一致。于本次含漱液标本中检出甲3型流感病毒且于大多数患者血清中亦检出其IgM抗体阳性说明当时校园内正在流行甲3型流感，同时在PCR检测中又有如此多的标本测到肺炎支原体DNA片段及血清中也检测出支原体的IgM抗体，说明当时恰好肺炎支原体也同时于其中流行，造成两个不同的传染病混合在同一校园内流行。可见在流感流行季节，不但有流感病毒的流行，其它呼吸道疾病也可同时流行[1，2]。
通常根据临床症状及经验怀疑为某种病原感染，选用适合该病原体生长的方法进行病原体培养分离。但呼吸道感染临床症状往往很相似，单针对某一病原体的培养往往得不到阳性结果。因为呼吸道感染常见的病毒有甲、乙型流感病毒，Ⅰ～Ⅲ型副流感病毒，呼吸道合胞病毒和腺病毒等，采用单一细胞分离可能对某些病毒不太敏感[3]。用MDCK、HEP-2、LLC混合细胞分离病毒，不仅可以分离到易于造成爆发流行的流感病毒，同时还可以分离到其它常见的呼吸道病毒，如副流感、呼吸道合胞及腺病毒等。配上单克隆荧光抗体既可以对培养物中常见的呼吸道病毒进行鉴定，又可早期对培养物进行上述病毒的快速检测。混合细胞培养再加上PCR检测肺炎支原体及衣原体方法使被检测的病原体范围扩大，检测速度也加快，提高了流行病学调查中应急反应的能力。因此，对群体性爆发疫情作病原调查时，应尽可能使用多种方法及手段进行多种病原体的检测，也不能因为查到了某种病原体就轻易地认定是该种病原体引起的爆发，而是还要结合有关因素考虑其它病原体并发感染的可能性，这样才能为爆发疫情的流行病学和病原学调查提供更完整准确的实验室依据。
参考文献：
[1] 段佩若，赵华，彭世勇北京甲3流感流行中合并其它呼吸道病毒感染的调查研究[J]免疫学杂志，2000，16：127～129
[2] Perrotta DM,Decker M,Glezen WP Acute respiratory disease hospitalizations as a measure of impact of epidemic influenza[J] Am J Epidemiol,1985,122:468～476
[3] 郭元吉，温乐英，王敏，等一种新的流感快速诊断方法[J]中华实验和临床病毒学杂志，2002，16：207～210, 百拇医药