地黄叶片器官形态建成的研究

    薛建平1 ,2

    , 王汝毅1

    , 张爱民1

    ,柳 俊2

    (1.淮北煤炭师范学院 生物系 ,安徽 淮北 235000 ;

    2.华中农业大学 园艺林学学院 ,湖北 武汉 430070)

    [摘要] 目的:研究地黄叶片器官发生的形态建成;建立诱导地黄叶片直接再生植株和试管小地黄的最佳培

    养基和培养条件。方法:从无菌脱毒苗上采取不同位置的叶片 ,接种到附加不同激素的培养基中 ,诱导叶片直接再

    生植株和试管地黄。结果与结论:MS + 62BA 2. 0 mg· L - 1

    培养基最适合叶片再生植株。MS + 62BA 1. 0 mg· L - 1

    +

    NAA 0. 5 mg· L - 1

    培养基适合诱导试管地黄。最佳培养条件是光照 12 h· d - 1

    ,光强 2 000～3 000 lx ,温度(25 ±1)

    ℃。

    [关键词] 地黄;叶片;再生植株;试管地黄

    [中图分类号] S 567 [文献标识码] A [文章编号] 100125302 (2003) 0120021204

    地黄 Rehmannia gl ut inosa L.属玄参科多年生

    草本植物 ,为大宗常用药材之一。目前 ,为解决地黄

    的病毒病 ,人们主要利用茎尖脱毒培养技术生产脱

    毒苗 ,但降低脱毒苗的生产成本已成为限制其应用

    的瓶颈[1 ]。近年来 ,国内外以地黄叶片、块根为外

    植体脱分化诱导生成愈伤组织 ,再分化成再生植

    株[2 ]。但这一途径往往存在变异 ,因为在愈伤组织

    长期培养中 ,常可见到细胞的染色体组发生变化 ,而

    表现出遗传上的不稳定性[3 ,4 ]。若利用叶片直接再

    生植株 ,不经过愈伤组织阶段 ,就能保持亲本的遗传

    性状 ,而且叶片取材方便 ,来源广泛 ,均一性强。试

    管地黄作为一种繁殖体 ,易运输、贮存 ,可望取代脱

    毒苗 ,从而降低生产成本 ,实现地黄栽培的革命性变

    化。为此我们开展了地黄叶片直接再生植株和试管

    地黄的研究工作 ,国内外尚未见报道。

    1 材料和方法

    1. 1 材料

    地黄栽培品种 “8525”,采自焦作市温县农科所 ,经本院生物系郭传友鉴定为玄参科植物地黄 R .

    gl ut inosa 的新鲜块根。

    1. 2 培养基及培养条件

    以 MS为基本培养基 ,附加不同种类和浓度的

    [收稿日期] 2002206221

    [通讯作者] Tel . : (0561) 3802225 E2mail :xuejp2000 @yahoo.

    com. cn

    植物激素 ,3. 0 %的蔗糖 ,用 0. 7 %的琼脂固化 ,pH

    5. 8～6. 0。叶片以叶背面接触培养基和以叶正面接

    触培养基 ,再分别作 2 个处理:一是光照培养 ,温度

    (25 ±1) ℃,光照 12 h· d - 1

    ,光强2 000～3 000 lx ;一

    是暗培养 ,温度(25 ±1) ℃。

    1. 3 无菌苗的获得

    将田间挖取的地下块根洗净,流水冲2 h。在超

    净工作台上 ,用 70 %酒精表面消毒 30 S ,然后用

    12 %的双氧水和 0. 1 %的升汞混合液消毒 10 min ,再用无菌水冲洗 5～6 次。将带芽眼的部分切成小

    块放入 1 2MS 基本培养基中 ,于光照培养箱中培

    养 ,15 d后可长出小植株。

    1. 4 苗的继代培养

    待无菌苗长至 1～2 cm时 ,在超净工作台上 ,从

    基部切下 ,转至 MS + 62BA 0. 5 mg· L - 1

    + NAA 0. 5

    mg· L - 1

    培养基 ,于光照培养箱中继代培养。

    1. 5 叶片直接再生植株诱导培养

    当继代培养的苗长至 3～4 cm 时 ,从苗顶端依

    次向下 ,选择色浓绿、伸展的健壮叶片 ,自叶柄处完

    整剪下 ,背接或正接到添加了不同种类和浓度植物

    激素的培养基上 ,每瓶中再接一个剪成碎片的不完

    整叶片作为对照。然后在光照培养箱和暗培养箱中

    作对照培养。

    1. 6 叶片试管地黄诱导培养

    叶片取材同上 ,背接到添加了不同种类和浓度

    植物激素的培养基上 ,在光照培养箱和暗培养箱中

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    第28 卷第1 期

    2003 年1 月 中 国 中 药 杂 志

    China Journal of Chinese Materia Medica

    Vol . 28 ,No. 1

    Jannuary ,2003

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.作对照培养。

    2 结果

    2. 1 叶片直接再生植株

    2. 1. 1 激素种类和浓度 将在 M1 培养基中继代

    植株的叶片以背面接触培养基 ,培养基中添加不同

    种类和浓度的激素(表 1) 。在光照条件下 ,接种 7 d

    后 ,叶龄较高的叶片边缘向叶背面卷曲 ,叶柄稍有膨

    大 ,呈淡黄色;叶龄较低的叶片整个膨大、伸展。15

    d后在 M5 和 M8 中叶片靠叶柄基部有芽出现 ,M5

    中叶片的叶柄处愈伤组织生长慢 ,继续培养 ,苗生长

    良好 ,每个叶片有 5～6 个不定芽(图 1) ,而 M8 中叶

    片随培养时间延长 ,苗停止生长 ,且叶柄部愈伤组织

    生长旺盛。20 d后 M1 ,M6 中叶片近基端都开始有

    芽的分化 ,继续培养 , 30 d 后 ,M6 中变化不大 ,而

    M1 叶片的远基端也开始有芽的分化 ,同时叶脉中部

    有2～4 个彭大良好的试管地黄(图 2) 。25 d 时在

    M4上叶脉个别地方有芽的分化 ,且生长缓慢。在

    M7 中 ,叶片大量愈伤化 ,无芽的分化。剪成碎片的

    叶片只在伤口处形成愈伤组织 ,无不定芽的形成(图

    3) 。暗培养条件下的叶片逐渐发黄 ,失绿 ,只形成愈

    伤组织 ,无再生植株。40 d 后观察统计发现幼叶比

    老叶容易诱导出再生植株。叶片出芽率从高到低的

    培养基是 M8 > M5 > M1 > M6 > M4 ,再生小植株生

    长最好的是 M5 培养基。

    在培养基中只附加 62BA ,当 62BA 浓度为 2. 0

    mg· L - 1

    时 ,诱导效果最好。3. 0 mg· L - 1

    的 62BA 诱

    导的芽比 1. 0 mg· L - 1

    62BA 诱导的要快。62BA 为

    5. 0 mg· L - 1

    时叶片无不定芽的分化 ,只有大量愈伤

    组织生成 ,且随着培养时间的延长愈伤组织可分化

    出大量不定芽。另外 ,当 62BA 和 NAA 的浓度配比

    是10∶ 1 ,但其绝对浓度不同时对叶片不定芽再生的

    影响也是不同的 ......